專利名稱：治療缺血相關(guān)疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療缺血相關(guān)的疾病及紊亂的方法，包括由于突然喪失氧氣導(dǎo)致的神經(jīng)及心臟疾病，以及像阿爾茲海默病這樣的變性疾病。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)由脊髓、腦及視網(wǎng)膜構(gòu)成，含有上千億個(gè)神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)，由此形成勝任復(fù)雜功能的網(wǎng)絡(luò)。CNS神經(jīng)元的存在及生理功能的實(shí)現(xiàn)需要能量支持。中樞神經(jīng)細(xì)胞能量的唯一來源通常認(rèn)為來自血液的葡萄糖及氧氣。如果全部或任何部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血液供應(yīng)被關(guān)閉，那么受累的神經(jīng)元會缺氧及低糖(又稱缺血)，以至迅速變性。臨床上，通常將神經(jīng)系統(tǒng)缺乏血液供應(yīng)的情況稱為“腦卒中”。僅僅是氧氣供應(yīng)的中斷，則稱為“缺氧”，這發(fā)生在昏厥、窒息或溺水。單獨(dú)是葡萄糖的供應(yīng)中斷，則稱為“低糖”，比如出現(xiàn)在糖尿病患者服用了過量的胰島素。上述所有情況，都涉及到能量短缺，在臨床上被認(rèn)為是腦損傷的潛在原因。下文中，“能量短缺”和“缺血”會交替使用，但都意指使中樞神經(jīng)系統(tǒng)所需能量短缺的任意狀況。
幾年來，神經(jīng)科學(xué)家在理解能量短缺導(dǎo)致的神經(jīng)變性的機(jī)理方面有了長足的進(jìn)展。已經(jīng)認(rèn)識到，谷氨酸鹽在中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常和健康的情況下是一種重要的興奮神經(jīng)遞質(zhì)，但在缺血時(shí)則起著神經(jīng)毒性作用，稱為“興奮毒性(excitotoxicity)”。通常，谷氨酸鹽存在于細(xì)胞內(nèi)，僅僅在突觸連接處微量釋放，作用到毗鄰含有谷氨酸鹽受體的神經(jīng)元以傳遞神經(jīng)信號。在正常情況下，釋放到細(xì)胞外液的谷氨酸鹽在數(shù)毫秒時(shí)間內(nèi)會以一種高效的轉(zhuǎn)運(yùn)過程被轉(zhuǎn)運(yùn)回神經(jīng)元內(nèi)。
只要這種轉(zhuǎn)運(yùn)過程工作正常，谷氨酸鹽的興奮毒性潛能就會被遏制。然而，這種轉(zhuǎn)運(yùn)過程是需要能量的，所以在缺血(能量短缺)的情況下，谷氨酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)失能，已經(jīng)釋放作為遞質(zhì)的谷氨酸鹽分子則會在細(xì)胞外的突觸液中蓄積。這使得谷氨酸鹽持續(xù)與興奮受體接觸，讓這些受體處于過度刺激狀態(tài)，這種情況下神經(jīng)元過度興奮導(dǎo)致死亡。兩個(gè)額外的因素使情況更加復(fù)雜和惡化(1)受刺激過度的神經(jīng)元在另外的突觸連接處釋放過量的谷氨酸鹽，使更多的神經(jīng)元處于過度刺激狀態(tài)，神經(jīng)毒積累范圍超過初始的缺血區(qū)；和(2)與正常的神經(jīng)元相比，受過度刺激的神經(jīng)元更迅速消耗葡萄糖或氧氣，這加速了有限能源的消耗，并進(jìn)一步損害谷氨酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。因此，象在腦卒中、心跳停止、昏厥的缺氧或低糖這樣能量不足情況下導(dǎo)致的腦損傷是由一種復(fù)合的機(jī)制造成的；初始的原因是缺血本身，但由此導(dǎo)致的谷氨酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)失靈及谷氨酸鹽介導(dǎo)的興奮毒性事件級聯(lián)反應(yīng)很大程度上為隨后的腦損傷負(fù)責(zé)。
除上述情況外，最近已經(jīng)注意到神經(jīng)元使用能量基質(zhì)(葡萄糖及氧氣)來維持其能量水平的能力的各種缺陷還可以激發(fā)導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的興奮毒性過程。據(jù)推定，這是出現(xiàn)在象阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、杭廷頓氏舞蹈病及肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化這樣的神經(jīng)疾病中的神經(jīng)變性的機(jī)制。例如，在患阿爾茲海默病病人腦活檢組織中，已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)能量代謝缺陷的證據(jù)，并被建議引發(fā)谷氨酸鹽興奮毒性潛能釋放導(dǎo)致阿爾茲海默病中神經(jīng)元的死亡，從而通過與能量關(guān)聯(lián)的興奮毒性過程來解釋。也有報(bào)道，在帕金森氏綜合癥及杭廷頓氏舞蹈病中細(xì)胞內(nèi)存在能量代謝的內(nèi)在缺陷的證據(jù)。因此，防范這些疾病中神經(jīng)變性的合理治療策略，將包括糾正能量缺陷或防止興奮毒性神經(jīng)變性的方法。
神經(jīng)變性疾病為特征在于正常神經(jīng)元功能改變，大多數(shù)情況下導(dǎo)致神經(jīng)死亡的一組疾病(大多數(shù)這些疾病，尤其在晚期與嚴(yán)重的神經(jīng)損傷有關(guān))。在大多數(shù)情況下，致病原因未知而且疾病是進(jìn)行性發(fā)展的。神經(jīng)變性疾病的結(jié)果會毫無例外地出現(xiàn)嚴(yán)重的情感、身體及財(cái)政方面壓力，不僅影響個(gè)體，也造成社會負(fù)擔(dān)。
發(fā)展成神經(jīng)變性紊亂(特別是阿爾茲海默病或帕金森氏綜合癥)的最一致的危險(xiǎn)因素是年齡的增長。一個(gè)世紀(jì)以來，在工業(yè)化國家中，65歲及以上人口的增長率已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人口整體的增長率。這樣，可以預(yù)料再過幾代人，老年人口的比例將加倍；與之相伴的是可能患神經(jīng)變性疾病人群的比例亦會加倍。這種預(yù)測是醫(yī)學(xué)界及法律制定者擔(dān)憂加劇的中心點(diǎn)，因?yàn)楹苋菀最A(yù)料與傷殘性疾病有關(guān)的，給病人、福利事業(yè)(caregivers)及社會的情感、身體及財(cái)政帶來的負(fù)擔(dān)會大幅度增加。事實(shí)上，要解決這種問題，目前已有數(shù)種已獲批的藥物在某種程度上可以減輕數(shù)種神經(jīng)變性疾病的癥狀，這些藥物的長期使用經(jīng)常有一定程度的副作用，似乎無一可以終止變性進(jìn)程。與此有關(guān)的是，我們對于神經(jīng)變性疾病中神經(jīng)元死亡的原因及機(jī)制的了解有限阻礙著開發(fā)有效的預(yù)防或保護(hù)性治療。盡管前景黯淡，數(shù)個(gè)神經(jīng)生物學(xué)的突破已經(jīng)使我們比以往更趨近揭開數(shù)種神經(jīng)變性疾病的秘密及獲得有效治療戰(zhàn)略的那一天。
在開發(fā)保護(hù)及減少CNS缺血相關(guān)的神經(jīng)元損傷的方法方面，已取得了重要的進(jìn)展。該領(lǐng)域中最活躍的研究涉及使用受體特異性的拮抗藥物(藥理學(xué)術(shù)語，為一種占據(jù)和封閉細(xì)胞表面上的某種受體而不引發(fā)該受體的活性的藥物，稱為該受體的拮抗劑)在谷氨酸鹽受體處抑制興奮活性的方法。能夠介導(dǎo)興奮毒性神經(jīng)變性的谷氨酸鹽受體，廣義分為NMDA及非NMDA受體兩大類。NMDA受體是以N-甲基-D-天冬氨酸鹽命名，這類藥物在自然情況下不存在于腦內(nèi)，但發(fā)現(xiàn)可以很強(qiáng)地結(jié)合到谷氨酸鹽受體上，因此與之結(jié)合的受體稱為NMDA受體。近來非NMDA類谷氨酸鹽受體又分為兩種不同類型，一種是KA(紅藻氨酸)受體，另一種是AMPA受體(曾稱為QUIS受體)。
NMDA受體拮抗劑在體外實(shí)驗(yàn)及在許多體內(nèi)動物模型中，一再表明可以保護(hù)CNS免受缺血性神經(jīng)變性的危害；然而，近來也有各種證據(jù)表明，NMDA受體拮抗劑對于一種主要類型的缺血-“彌漫性缺血”可能是無效的，而對另一種主要的缺血“病灶性(focal)”缺血僅僅提供部分保護(hù)。進(jìn)而，NMDA拮抗劑必須在缺血發(fā)作后立即給藥，才能提供顯著的保護(hù)。有關(guān)非NMDA拮抗劑的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更有限，但少數(shù)體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)研究表明，這些拮抗劑即使是在缺血事件發(fā)生后給藥仍可對缺血性神經(jīng)變性提供顯著的保護(hù)。
盡管單獨(dú)使用NMDA或非NMDA拮抗劑，宣稱能夠?qū)NS缺血提供實(shí)質(zhì)性的保護(hù)，但越來越多的證據(jù)表明，它們單獨(dú)使用的保護(hù)程度是相對有限的。
谷氨酸鹽受體拮抗劑作為神經(jīng)保護(hù)劑抵抗缺血性神經(jīng)變性的突出限制是，它們僅暫時(shí)使神經(jīng)元與變性隔離；它們既沒有更正能量短缺，也沒有更正隨著能量短缺繼發(fā)而來的其它錯(cuò)亂。因此，盡管這些拮抗劑的確在動物模型中對缺血性神經(jīng)變性提供了某種程度的保護(hù)，但如上所述，其保護(hù)是不完全的，在某種情況下僅延緩了變性的始發(fā)時(shí)間。但是，重要的是注意，如果在這延緩的期間中有其它藥物或方法能夠提供額外和/或持續(xù)的保護(hù)，那么使變性的始發(fā)時(shí)間延緩也許是很有價(jià)值的。
在大多數(shù)缺血研究中尚未給予足夠解決的一個(gè)關(guān)鍵因素是涉及損傷(缺血)事件的給藥時(shí)間。這是一個(gè)非常重要的考量；盡管某些缺血事件可以預(yù)測(如心臟打開手術(shù))，但絕大多數(shù)的缺血事件是不能預(yù)計(jì)的，而且在大多數(shù)情況下，治療僅僅在缺血事件發(fā)生的過程中或之后開始。因?yàn)槿毖l(fā)生后CNS細(xì)胞開始非常迅速地變性，所以很明確尚需要新的神經(jīng)保護(hù)方法，以在CNS變性開始之后給藥仍能奏效。
另一個(gè)重要的考慮是，缺血僅僅是短暫的(如在心動停止的發(fā)作期)，還是持續(xù)的(如CNS血管的血栓性或栓子性阻塞之后)。如果缺血是短暫的，在事件后立即恢復(fù)攜帶氧氣及葡萄糖的血液對CNS的供給，防止神經(jīng)變性或促進(jìn)缺血侵害恢復(fù)的藥物經(jīng)血液循環(huán)可以達(dá)到缺血組織。
如果腦區(qū)的血液供應(yīng)被凝血塊永久阻斷，那么現(xiàn)有方法不可能阻止缺血區(qū)中心的神經(jīng)變性，因?yàn)槿毖M織永久性喪失氧氣及葡萄糖，而藥物無法經(jīng)阻斷的血管到達(dá)缺血組織。然而，在環(huán)繞著缺血區(qū)邊緣存在著一個(gè)大的組織區(qū)域，稱作半影(penumbra)，這里可以得到毗鄰CNS區(qū)域的血液，這一組織區(qū)域是藥物治療的潛在靶。同樣，現(xiàn)在正檢測和研發(fā)用于治療心臟病發(fā)作的溶解凝血塊藥物(溶栓劑，如鏈激酶及組織纖維蛋白溶酶原激活劑)，以恢復(fù)腦卒中后給CNS的血液供應(yīng)。當(dāng)這些藥物廣泛用于人體的CNS時(shí)，利用這些藥物可使血管再通，這樣缺血的CNS組織不僅可以獲得氧氣及葡萄糖，同時(shí)亦可得到這里公開的神經(jīng)變性保護(hù)或促進(jìn)缺血侵害后恢復(fù)的藥物。
最后，在特殊情況下，如給眼睛視網(wǎng)膜供血的主要?jiǎng)用}出現(xiàn)血栓阻塞，這里公開的藥物會有幫助。當(dāng)這種血管阻塞時(shí)，直接注射本發(fā)明藥物于眼睛的玻璃體(即眼球內(nèi)的清亮液體)以投藥于缺血的視網(wǎng)膜是可能的。藥物可以迅速地由玻璃體擴(kuò)散進(jìn)入視網(wǎng)膜。
開發(fā)能夠預(yù)防或治療不管是急性還是慢性缺血事件的疾病/紊亂后果的治療劑，將是極受歡迎的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及以通式I化合物或其藥物前體投藥給所需病人以治療缺血相關(guān)疾病的方法 通式I其中
E是氧、硫、NH或N-C1-6烷基；R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環(huán)烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷?；蛘逳R1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)另外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子；并且HET為任選取代的5到7元雜芳香基殘基，該雜芳香基殘基含有1到4個(gè)選自氮、氧或硫的雜原子。
優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于本發(fā)明方法的組合物，其中HET是下列通式的殘基 其中m是0或1；當(dāng)m為0時(shí)，Z1、Z2及Z3獨(dú)立地選自N、O、S或CR，或當(dāng)m為1時(shí)，Z1、Z2及Z3獨(dú)立地選自N或CR；R每次出現(xiàn)時(shí)，獨(dú)立地選自氫、鹵化物、羥基、巰基(thiol)、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基；并且x為由0到4的整數(shù)。
更優(yōu)選的實(shí)施方案包括組合物的應(yīng)用，其中HET殘基獨(dú)立地選自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基；并且R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環(huán)烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷?；蛘逳R1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)額外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及通過對需要的病人給藥下列通式II的化合物或其藥物前體以治療缺血相關(guān)疾病的方法 通式II其中R、R1、R2、R3及R4獨(dú)立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環(huán)烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷?；?，或者NR1R2組合形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)額外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子，并且x為由0到5的整數(shù)。
并且，此處更具體其中x為0、1、2或3R、R1、R2、R3及R4獨(dú)立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環(huán)烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷?；蛘逳R1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)額外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子。
本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及通過對需要的病人給藥下列通式III的化合物或其藥物前體以治療缺血相關(guān)疾病的方法
通式III其中R、R1、R2、R3及R4獨(dú)立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環(huán)烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷?；蛘逳R1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)額外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子；R6為氫、羥基、氨基或C1-8烷基；R5及R7獨(dú)立地選自氫、鹵化物、羥基、巰基、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基。
本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案涉及通過對需要的病人給藥具有下列通式的PAN811(3-氨基吡啶-2-羧醛縮氨基硫脲)以治療缺血相關(guān)疾病的方法 本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及治療特定的缺血相關(guān)疾病的方法，這些疾病包括但不限于阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、冠狀動脈側(cè)枝架橋手術(shù)、心搏停止導(dǎo)致的彌漫性腦缺血、病灶性腦梗塞、腦出血、出血性梗塞、高血壓性出血、由顱內(nèi)血管異常破裂造成的腦出血、顱內(nèi)動脈瘤破裂造成的蛛網(wǎng)膜下腔出血、高血壓性腦病、頸動脈狹窄或阻塞造成的腦缺血、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓損傷、腦血管疾病例如，動脈粥樣硬化、脈管炎、斑變性，心肌梗塞、心肌缺血及室上性心動過速。
附圖簡述

圖1為用PAN-811(A)或已知的神經(jīng)保護(hù)劑維生素E(B)、硫辛酸(C)或銀杏(Ginkgo Biloba)(D)預(yù)處理，隨后用過氧化氫處理的細(xì)胞存活率(左版面)及神經(jīng)保護(hù)能力(右版面)的代表性圖示。
圖2為PAN-811對神經(jīng)細(xì)胞中產(chǎn)生ROS的影響的代表性圖示。(A)PAN-811對神經(jīng)細(xì)胞中產(chǎn)生過氧化氫誘導(dǎo)的ROS的影響。(B)PAN-811對神經(jīng)細(xì)胞中產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的ROS的影響。
圖3為在缺氧情況下神經(jīng)毒性對葡萄糖濃度的依賴性的代表性圖示。
圖4為細(xì)胞在缺氧情況下有或沒有神經(jīng)保護(hù)劑MK-801及PAN-811的代表性組織學(xué)影像。
圖5為在常氧情況下及缺氧情況下PAN-811的神經(jīng)保護(hù)作用的代表性圖示。
圖6為在缺氧/低糖情況下PAN-811毒性的代表性圖示。
圖7為輕度缺氧/低糖情況下PAN-811對神經(jīng)細(xì)胞死亡的保護(hù)作用的代表性圖示。
圖8為腦皮質(zhì)神經(jīng)元被PAN-811處理24小時(shí)時(shí)，PAN-811神經(jīng)毒性的代表性圖示。
圖9為PAN-811對缺血產(chǎn)生毒性的保護(hù)作用的代表性圖示。
圖10為在用PAN-811或溶劑預(yù)處理，然后用過氧化氫處理后的細(xì)胞存活率的代表性圖示。
圖11為在用PAN-811或溶劑預(yù)處理，然后用過氧化氫處理后的細(xì)胞存活率的代表性圖示。
發(fā)明詳述本發(fā)明的特點(diǎn)及其它細(xì)節(jié)，現(xiàn)在將給予更具體的描述，并將在權(quán)利要求書中指出。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的具體實(shí)施方案由說明方式展示的而非對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的主要特點(diǎn)可被用于不同的實(shí)施方案而不偏離本發(fā)明的范圍。
缺血相關(guān)紊亂或疾病的病理學(xué)，涉及通常由于血管狹窄或阻塞導(dǎo)致的體內(nèi)器官、組織或機(jī)體的部分血液供應(yīng)減少，例如視網(wǎng)膜病、急性腎衰竭、心肌梗塞及腦卒中。這可以是急性發(fā)作(如心臟病發(fā)作)或慢性過程(如神經(jīng)變性疾病)的結(jié)果。
本發(fā)明涉及將通式I化合物或其藥物前體給藥到所需病人以治療缺血相關(guān)疾病的方法 通式I其中E是氧、硫、NH或N-C1-6烷基；R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環(huán)烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷?；蛘逳R1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)額外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子；并且HET為可任選取得的5到7元雜芳香基殘基，該雜芳香基殘基含有1到4個(gè)選自氮、氧或硫的雜環(huán)原子。
優(yōu)選的實(shí)施方案涉及用于本發(fā)明方法中的組合物，其中HET是下列通式的殘基
其中m是0或1；當(dāng)m為0時(shí)，Z1、Z2及Z3獨(dú)立地選自N、O、S或CR或當(dāng)m為1時(shí)，Z1、Z2及Z3獨(dú)立地選自N或CR；R每次出現(xiàn)時(shí)，獨(dú)立地選自氫、鹵化物、羥基、巰基、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基；并且x為由0到4的整數(shù)。
更優(yōu)選的實(shí)施方案包括使用組合物，其中HET殘基獨(dú)立地選自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基；并且R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環(huán)烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷?；?，或者NR1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)額外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及通過給藥通式II化合物或其藥物前體到所需病人以治療缺血相關(guān)疾病的方法 通式II其中R、R1、R2、R3及R4獨(dú)立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環(huán)烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷?；?，或者
NR1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)額外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子，并且x為由0到5的整數(shù)。
并且，更具體的其中x為0、1、2或3，R、R1、R2、R3及R4獨(dú)立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環(huán)烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)額外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及通過給藥通式III的化合物或其藥物前體給所需病人來治療缺血相關(guān)疾病的方法 通式III其中R、R1、R2、R3及R4獨(dú)立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8成環(huán)烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷?；?，或者NR1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)額外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子；R6為氫、羥基、氨基或C1-8烷基；R5及R7選自氫、鹵化物、羥基、巰基、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基。
本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案涉及通過給藥具有下列通式的PAN811(3-氨基吡啶-2-羧醛縮氨基硫脲)給所需病人以治療缺血相關(guān)疾病的方法 本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式涉及治療特定缺血相關(guān)疾病的方法，所述疾病包括但不限于阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、冠狀動脈側(cè)枝架橋手術(shù)、心博停止導(dǎo)致的彌漫性腦缺血、病灶性腦梗塞、腦出血、出血性梗塞、高血壓性出血、由顱內(nèi)血管異常破裂造成的腦出血、顱內(nèi)動脈瘤破裂造成的蛛網(wǎng)膜下腔出血、高血壓性腦病、頸動脈狹窄或阻塞造成的腦缺血、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓損傷、腦血管疾病例如，粥樣硬化、脈管炎、斑變性、心肌梗塞、心肌缺血及室上性心動過速。
用于本發(fā)明方法中的化合物的合成方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。這樣的合成方案在美國數(shù)個(gè)專利中給予描述5,281,715、5,767,134、4,447,427、5,869,676及5,721,259。在此，它們以全文引為參考。
藥物組合物本發(fā)明的另一個(gè)方面，涉及用于本發(fā)明方法中的縮氨基硫脲的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物通常包含用于本發(fā)明方法中的化合物及藥學(xué)上可接受的載體。在此，“藥學(xué)上可接受的載體”包括任一和所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌及抗真菌劑、等滲劑及延緩吸收劑和生理相容的類似物。載體的類型可根據(jù)打算的給藥途徑選擇。在不同的實(shí)施方案中，載體適合于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、局部、經(jīng)皮或口服給藥。藥學(xué)上可接受的載體，包括無菌水溶液或分散系及適用于臨時(shí)制備無菌注射溶液或分散系的無菌粉劑。這些介質(zhì)及試劑用作藥學(xué)活性物質(zhì)是本領(lǐng)域眾所周知的。除與活性化合物不相容以外，任何常規(guī)的介質(zhì)或試劑都可考慮在本發(fā)明中的藥物化合物中的使用。補(bǔ)充的活性化合物也能被添加到這種組合物中。
治療用藥物組合物通常在制造及儲存情況下必須是無菌及穩(wěn)定的。這種組合物能夠配制成溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其它適合于高濃度藥的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有，例如水、乙醇、多羥基化合物(如丙三醇、丙二醇、液狀聚乙二醇及類似物)及其它適合的其混合物的溶劑或分散介質(zhì)。例如，適合的流動性，可以通過使用象卵磷脂這樣的涂層，在分散系中保持所需顆粒的尺寸及使用表面活化劑來維持。在許多情況下，更優(yōu)選在組合物中包含等滲劑，如糖類，象甘露醇及山梨(糖)醇這樣的多醇或氯化鈉。可注射成份的延遲吸收可以通過在組合物中包含一種延緩吸收劑，如單硬脂酸鹽或明膠來實(shí)現(xiàn)。此外，化合物能以隨時(shí)間而釋放的劑型給藥，例如在包含緩釋聚合物的組合物中?；钚曰衔锟膳c載體一起制備，以防化合物迅速釋放，諸如這種控制釋放的劑型，包括植入物及微膠囊化投遞系統(tǒng)。生物可降解、生物相容的聚合物可用于此，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸、聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。制備這些劑型的許多方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
可注射的無菌溶液，可用所需的量將活性化合物與上述列舉的成分之一或其組合(視需要)摻入在合適溶劑中，之后過濾除菌而制備。通常，將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)及其它所需的上述列舉成分的無菌媒介物中來制備分散系。在無菌粉劑用于制備可注射無菌溶液的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥及冰凍干燥，這生成活性成分加上來自其前述無菌過濾溶液的任何額外所需成分的粉劑。
取決于給藥途徑，化合物可用材料涂布以保護(hù)其免受酶、酸及其它可以失活該試劑的自然條件作用的材料。例如，可將化合物以適當(dāng)載體或稀釋劑與酶抑制劑共同給藥或以合適的載體例如脂質(zhì)體給藥于對象。藥用稀釋液包括鹽和水性緩沖液。酶抑制劑包括胰腺的胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟代磷酸鹽(DEP)和抑肽酶(trasylol)。脂質(zhì)體包括油包水-水包油乳狀液(water-in-oil-in-water)及常規(guī)的脂質(zhì)體(Strejan，etal.，(1984)J.Neuroimmunol 727)。分散系也可用丙三醇、液狀聚乙二醇及其混合物和油來制備。在通常的儲存及使用條件下，這些制備物中可含防腐劑，以防止微生物的生長。
組合物中的活性劑(即一或多種縮氨基硫脲)，優(yōu)選以治療有效量配制在組合物中?！爸委熡行Я俊币庵冈趧┝考八钑r(shí)間段獲得期望的治療結(jié)果，從而影響特定疾病狀態(tài)的療程的有效量?；钚詣┑闹委熡行Я靠筛鶕?jù)個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別、體重及該活性劑在個(gè)體引起期望反應(yīng)的能力的不同而異。劑量方案可被調(diào)整以提供最佳的治療反應(yīng)。治療有效量也指治療上有益效果超過其毒性或有害性作用的量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，活性劑以預(yù)防有效量被配制在組合物中?！邦A(yù)防有效量”意指在劑量及所需時(shí)間段獲得期望的疾病預(yù)防結(jié)果的有效量。通常，預(yù)防劑量低于治療有效量，這是因?yàn)樵搫┝坑糜趯ο蟀l(fā)病之前或疾病的早期。
組合物中活性化合物的量可根據(jù)個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別及體重等因素的不同而異。劑量方案可被調(diào)整，以提供最佳的治療反應(yīng)。例如給藥可以是單次團(tuán)注(bolus)、一段時(shí)間內(nèi)數(shù)次分劑量給藥，或根據(jù)治療緊急狀況成比例地加減劑量。特別有利的是，以容易給藥和均一劑量的單位劑量形式配制胃腸外給藥組合物。這里使用的單位劑量形式，意指對待治療的哺乳動物對象而言適合作為單位劑量的物理上分散的單元；每單元含有與所需的藥物載體聯(lián)用計(jì)算產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式規(guī)格由以下指定并直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特性質(zhì)及想獲得的具體療效；(b)對個(gè)體治療敏感度方面，在組合這種活性化合物時(shí)技術(shù)上的內(nèi)在局限。
本發(fā)明的化合物，可以配制成該化合物是其中唯一活性劑的藥物組合物?；蛘撸幬锝M合物可含有額外的活性劑。例如，本發(fā)明的兩種或更多種化合物可以組合使用。
本發(fā)明可通過下列的實(shí)施例進(jìn)一步闡明，這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為局限性。本申請中所有參考文獻(xiàn)、專利及公布的專利申請、以及圖示的內(nèi)容，在此引作參考。
實(shí)施例實(shí)施例1PAN-811與其它神經(jīng)保護(hù)劑的神經(jīng)保護(hù)效能比較目的本研究的目的是在阿爾茲海默病相關(guān)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中，比較PAN-811(3-氨基吡啶-2-羧醛縮氨基硫脲；C7H9N5S；MW＝195)與已知的神經(jīng)保護(hù)劑，如維生素E，硫辛酸及銀杏的神經(jīng)保護(hù)能力。
1.材料及方法1.1研究設(shè)計(jì)1.1.1.細(xì)胞的分離及培養(yǎng)初生皮層神經(jīng)元從17日齡大鼠胚腦分離，以每孔5萬個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，在常規(guī)的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(neurobasal medium)中培養(yǎng)2-3周。以不含抗氧化劑的新鮮神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基半量換液兩次。
1.1.2.用PAN-811、其它神經(jīng)保護(hù)劑及過氧化氫處理PAN-811以1mg/ml(～5mM)溶解于乙醇，并進(jìn)一步以培養(yǎng)基稀釋到0.1μM、1μM及10μM的終濃度。其它已知的神經(jīng)保護(hù)劑被溶解到合適的溶劑中，并稀釋到指示的終濃度。神經(jīng)元用PAN-811、已知的神經(jīng)保護(hù)劑或媒介物預(yù)處理24小時(shí)，然后進(jìn)行過氧化氫(終濃度150μM)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。對照包括未處理的細(xì)胞(沒有化合物及過氧化氫處理)、僅僅用化合物處理的細(xì)胞、暴露于過氧化氫但無化合物的細(xì)胞。未處理的細(xì)胞被用作對照來評價(jià)毒性及改進(jìn)的存活率。每個(gè)分析重復(fù)三次。
1.1.3.細(xì)胞功能的評價(jià)24小時(shí)后，使用標(biāo)準(zhǔn)的MTS分析(Promega)評價(jià)存活率及線粒體功能。遵循制造商的操作規(guī)程。
1.2材料-神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Invitrogen)-B27-AO(Invitrogen)-PAN-811(Vion Pharmaceuticals，Inc.)-過氧化氫(Calbiochem)-乙醇(Sigma)-維生素E(Sigma)-硫辛酸(Sigma)-銀杏(CVS)-MTS分析試劑盒(Promega)1.3設(shè)備-天平(Mettler-Toledo，Inc.)-可調(diào)加樣器(Finnpipette)-細(xì)胞培養(yǎng)櫥(Thermo Forma)-細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma)-讀板機(jī)(Bio-Rad Model 550)2.結(jié)果2.1實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)以上述“研究設(shè)計(jì)”中描述的方法進(jìn)行。PAN-811以1mg/ml(～5mM)溶解于乙醇，并進(jìn)一步以神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋到0.1μM、1μM及10μM的終濃度。硫辛酸以240mM溶解于乙醇，并進(jìn)一步以神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋到10μM、25μM及100μM的終濃度。維生素E以100mM溶解于乙醇，并進(jìn)一步以神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋到50μM、100μM、200μM及400μM的終濃度。銀杏以6mg/ml溶解于去離子水，并進(jìn)一步以神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋到2.5μg/ml、5μg/ml、25μg/ml及250μg/ml的終濃度。在處理結(jié)束時(shí)，用100μl新鮮的預(yù)熱神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上B27(-AO)更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)板放回到細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)一小時(shí)。之后，每孔中加入20μl的MTS試劑，培養(yǎng)板再放回到細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)兩小時(shí)。以BioRad讀板機(jī)(型號550)記錄每孔在490nm的吸收。僅含培養(yǎng)基的孔作為空白對照。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為3個(gè)單獨(dú)分析孔的平均值。未處理的細(xì)胞被用作計(jì)算細(xì)胞存活率及神經(jīng)保護(hù)能力的對照。兩周齡原代培養(yǎng)物用于這一研究。結(jié)果參見圖1。
結(jié)論P(yáng)AN-811在1-10μM濃度時(shí)，顯示良好的神經(jīng)保護(hù)能力，甚至是在苛刻的過氧化氫處理之下。維生素E及硫辛酸在苛刻處理之下，有最小的神經(jīng)保護(hù)能力。銀杏在苛刻處理之下，顯示某種程度的神經(jīng)保護(hù)。
PAN-811在1-10μM終濃度時(shí)，顯示顯著的神經(jīng)保護(hù)，甚至是在苛刻的過氧化氫處理之下。PAN-811的神經(jīng)保護(hù)效能明顯超出其它已知神經(jīng)保護(hù)劑，維生素E、硫辛酸及銀杏。
實(shí)施例2PAN-811對神經(jīng)細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧(ROS)的影響目的本研究的目的是評價(jià)PAN-811在阿爾茲海默病相關(guān)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中減少ROS產(chǎn)生的能力
1.材料及方法1.1研究設(shè)計(jì)1.1.1細(xì)胞的分離及培養(yǎng)初生皮層神經(jīng)元從17日齡大鼠胚腦分離，以每孔5萬個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，在常規(guī)的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3周。以不含抗氧化劑的新鮮神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基半量換液兩次。
1.1.2.以CM-H2DCFDA染料預(yù)裝載細(xì)胞和用PAN-811及過氧化氫處理細(xì)胞初生皮層神經(jīng)元由HBSS緩沖液沖洗一次，用10μM 5-(及6-)氯甲基-2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯，乙酰酯(CM-H2DCFDA)孵育以預(yù)裝載染料。之后細(xì)胞用HBSS緩沖液沖洗，用終濃度為0.1、1、5及10μM的PAN-811處理一小時(shí)，并進(jìn)一步進(jìn)行由300μM過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激兩小時(shí)。
1.1.3.神經(jīng)細(xì)胞中產(chǎn)生ROS的評價(jià)每孔在485/520nm(Ex/Em)的c-DCF熒光以BMG極星(polar star)讀板機(jī)記錄，并用于評價(jià)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。裝載了染料但未處理的細(xì)胞用作計(jì)算c-DCF熒光改變的對照。每一分析重復(fù)三次。
1.2材料-神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Invitrogen)-B27-AO(Invitrogen)-HBSS緩沖液(Invitrogen)-CM-H2DCFDA(Molecular Probes)-PAN-811(Vion Pharmaceuticals，Inc.)-過氧化氫(Calbiochem)-乙醇(Sigma)-PEG-300(Sigma)
1.3設(shè)備-天平(Mettler-Toledo，Inc.)-可調(diào)加樣器(Finnpipette)-細(xì)胞培養(yǎng)櫥(Thermo Forma)-細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma)-極星(Polarstar)熒光讀板機(jī)(BMG)2.0結(jié)果2.1實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)以上述“研究設(shè)計(jì)”中描述的方法進(jìn)行。每孔在485/520nm(Ex/Em)的c-DCF熒光以BMG極星讀板機(jī)記錄。含有細(xì)胞但無染料的孔作為空白對照。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是三個(gè)單獨(dú)分析孔的均值。加了染料但未處理的細(xì)胞用作計(jì)算c-DCF熒光改變的對照。兩周齡的原代培養(yǎng)物被用于本研究。
3.0討論CM-H2DCFDA是一種細(xì)胞滲透性的ROS指示劑，直到乙酸酯基團(tuán)被細(xì)胞內(nèi)酯酶去除并在細(xì)胞中出現(xiàn)氧化，CM-H2DCFDA方顯示出熒光。它被廣泛用于檢測細(xì)胞內(nèi)及動物體內(nèi)活性氧(ROS)的生成。在此，按照研究設(shè)計(jì)中描述的方法，它被用作評價(jià)PAN-811對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS生成影響的工具。如圖2所示，PAN-811在降低過氧化氫誘導(dǎo)的ROS生成和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)水平的ROS生成上，展示了良好的能力。使用緩沖液及PGE-300/EtOH替代PAN-811的平行對照實(shí)驗(yàn)，顯示對細(xì)胞內(nèi)的ROS生成無影響。實(shí)驗(yàn)以不同批次細(xì)胞重復(fù)4次，獲得類似的結(jié)果。代表性的實(shí)驗(yàn)參見圖2。
4.0結(jié)論P(yáng)AN-811在原代神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)明顯減低基礎(chǔ)水平的ROS生成(～50％；在10μM)及過氧化氫誘導(dǎo)的ROS生成(～30％；在10μM)。
參考文獻(xiàn)(1).Gibson GE，Zhang H，Xu H，Park LC，Jeitner TM.(2001).Oxidative stress increases internal calcium stores and reduces a keymitochondrial enzyme(氧化應(yīng)激增加內(nèi)部鈣儲量和減少關(guān)鍵的線粒體酶).Biochim Biophys Acta.Mar16；1586(2)177-89.
(2).Chignell CF，Sik RH.(2003).A photochemical study of cellsloaded with 2’，7’-dichlorofuorescinimplications for the detection ofreactive oxygen species generated during UVA irradiation(裝載有2’，7’二氯熒光素的細(xì)胞的光化學(xué)研究在UVA照射中檢測產(chǎn)生的活性氧的提示).Free Radic Biol Med.Apr 15；34(8)1029-34.
實(shí)施例3PAN-811對缺氧或缺氧/低血糖癥誘發(fā)的神經(jīng)毒性是一種潛在的神經(jīng)保護(hù)劑1.0導(dǎo)言在腦卒中后的頭幾分鐘減少神經(jīng)元損傷是獲得有效治療的重要策略。在腦卒中期間，血栓栓子封閉了動脈，中斷了局部腦區(qū)的氧及葡萄糖供給，從而導(dǎo)致梗死中心核中神經(jīng)元的喪失。中心核中的細(xì)胞通過壞死性機(jī)制非常迅速地死亡。環(huán)繞著缺血梗死區(qū)的腦區(qū)，結(jié)構(gòu)尚存，但(電傳導(dǎo))功能終止，稱作半影。半影是一種暫時(shí)的區(qū)域，它演變成梗死是一種相對進(jìn)行性現(xiàn)象(Touzani et al.，2001)。這一區(qū)域?yàn)橥炀饶承┠X功能提供了可能性，處理半影的治療窗口大大長于處理梗死區(qū)。半影也可描述為供血受限的區(qū)域，其中能量代謝仍然保留。因此，半影是神經(jīng)保護(hù)治療及重新激活靜止神經(jīng)元的因子如高壓氧的靶區(qū)。由此，中樞神經(jīng)受損后立即的損傷也許不是可逆的，但加重腦損傷，主要是彌漫性腦缺氧/缺血事件鏈的進(jìn)行，可以由有效的神經(jīng)保護(hù)策略加以阻止。例如，在冠狀動脈側(cè)枝架橋手術(shù)(CABG)之前及期間給予神經(jīng)保護(hù)劑，能夠有效地保護(hù)手術(shù)過程中由腦短期的血流改變(引起輕度缺氧/低糖狀態(tài))造成的神經(jīng)變性。如此，能夠顯著地保護(hù)神經(jīng)并能在神經(jīng)損傷后挽救神經(jīng)元的化合物具有非常的重要性。
2.0目的本研究的目的是理解PAN-811是否能夠在體外保護(hù)由缺氧或缺氧/低糖(H/H)導(dǎo)致的神經(jīng)毒性。在相關(guān)的工作中，PAN-811對過氧化氫處理的原代神經(jīng)元已顯示明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。
3.0材料及方法3.1材料-神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Invitrogen)-B27-AO(Invitrogen)-PAN-811(Vion Pharmaceuticals)-乙醇(Sigma)-DMSO(Sigma)-PEG-300(Sigma)-MTS分析試劑盒(Promega)-LDH分析試劑盒(Sigma)3.2設(shè)備-天平(Mettler-Toledo，Inc.)-可調(diào)加樣器(Finnpipette)-細(xì)胞培養(yǎng)櫥(Thermo Forma)-細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma)-讀板機(jī)(Bio-Rad Model 550)-FYRITE氣體分析器(Bacharach，Inc)-模塊培養(yǎng)室(Modular Incubator Chamber)-101TM(Billups-Rothenberg，Inc.)3.3縮寫B(tài)SS＝平衡鹽溶液
CABG ＝冠狀動脈側(cè)枝架橋手術(shù)d.i.v.＝體外天數(shù)EtOH ＝乙醇H/H ＝缺氧/低血糖癥LDH ＝乳酸脫氫酶MCAO ＝中腦動脈閉塞NB＝神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基NMDA ＝N-甲基-D-天冬氨酸鹽PEG ＝聚乙二醇3.4研究設(shè)計(jì)3.4.1神經(jīng)元培養(yǎng)96孔培養(yǎng)板用于本實(shí)驗(yàn)。皮質(zhì)神經(jīng)元以每孔5萬個(gè)細(xì)胞密度接種在聚-D-賴氨酸涂布的表面，培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中(NB加上B27補(bǔ)充劑)以獲得高富集神經(jīng)元的培養(yǎng)物。培養(yǎng)神經(jīng)元14d.i.v.以上，以增加細(xì)胞對興奮氨基酸的易感性(Jiang et al.，2001)。6個(gè)重復(fù)孔作為一組處理以利于分析定量。
3.4.2在體外模型中誘導(dǎo)神經(jīng)毒性如下表所示，腦中葡萄糖濃度通常超過2.2mM。在缺血時(shí)，其濃度在中心核及半影分別下降到0.2mM及1.4mM?；謴?fù)循環(huán)后一至兩小時(shí)，葡萄糖濃度回復(fù)到正常水平(Folbergrováet al.，1995)。
表1.葡萄糖濃度(mmol/kg) 為理解葡萄糖濃度對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的影響，我們已經(jīng)檢測了不同劑量的葡萄糖。如圖3所示，與正常情況下葡萄糖濃度為25mM相比，葡萄糖濃度下降到2.9mM沒有導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。當(dāng)葡萄糖濃度下降到0.4mM時(shí)，MTS分析顯示有強(qiáng)烈的細(xì)胞死亡出現(xiàn)。
為模擬腦卒中的腦環(huán)境，我們建立了三種體外模型系統(tǒng)。極度H/H模型(0.4mM葡萄糖)是梗死中心核環(huán)境的模擬；輕度H/H模型(1.63mM葡萄糖)為MCAO期間半影區(qū)環(huán)境的模擬；而以單純?nèi)毖跄Ｐ?正常神經(jīng)元下，體外葡萄糖的濃度為25mM)來模擬重新灌流后半影區(qū)的環(huán)境，這是因?yàn)樵谥匦鹿嗔骱笕毖醵皇悄芰克ソ呤窃斐煽赡艿募?xì)胞死亡的主要原因。
對于極度H/H及輕度H/H而言，通過將葡萄糖的濃度分別降低到0.4mM及1.63mM獲得缺氧/低血糖癥。在使用前，將BSS(116.0mMNaCl，5.4mM KCl，0.8mM MgSO4·7H2O，1.0mM NaH2PO4，1.8mMCaCl2·2H2O，26.2mM NaHCO3及0.01mM甘氨酸)或含有25mM葡萄糖的BBS脫氣5分鐘。缺氧下培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基用BBS或含有葡萄糖的BBS置換。同時(shí)，常氧下培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基由未脫氣的BBS或含有葡萄糖的BBS置換。為造成細(xì)胞缺氧，將培養(yǎng)板置于密封的容器(模塊培養(yǎng)室-101TM，Billups-Rothenberg，Inc.)，施加真空20分鐘以從培養(yǎng)基中去除氧及其它氣體，然后以30psi的壓力向容器內(nèi)充填5％二氧化碳及95％氮?dú)?分鐘。以O(shè)2指示器(FYRITE氣體分析器，Bacharach，Inc)測定容器內(nèi)氧氣的含量為0。培養(yǎng)板置于室內(nèi)6小時(shí)。作為實(shí)驗(yàn)對照，重復(fù)的培養(yǎng)板維持在正常培養(yǎng)條件下(5％二氧化碳及95％環(huán)境氣體)同樣長的時(shí)間。6小時(shí)后從容器內(nèi)取出處理的培養(yǎng)板，以含有25mM葡萄糖的終止液[添加1×丙酮酸鈉，10.0mM HEPES及1×N2補(bǔ)充的DMEM]，置換缺氧及常氧條件下培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基，并培養(yǎng)在5％二氧化碳及95％環(huán)境氣體的條件中。用不同濃度的PAN-811及媒介物作為陰性對照處理神經(jīng)元。以MK801作為陽性對照。在H/H侵害后的24或48小時(shí)，以MTS及LDH分析(見下文)來評價(jià)線粒體功能及細(xì)胞死亡。
在單純?nèi)毖跄Ｐ椭?，以溶劑或PAN-811預(yù)處理神經(jīng)元24或48小時(shí)。藥物處理在缺氧24小時(shí)期間及之后仍在持續(xù)。在缺氧侵害之后的24或48小時(shí)，評價(jià)細(xì)胞形態(tài)及功能(MTS及LDH分析)。
3.4.3.形態(tài)學(xué)監(jiān)控在圖4中，可見形態(tài)評估的神經(jīng)細(xì)胞死亡。在缺氧之前，神經(jīng)元是健康的，具有相亮(phase-brilliant)的體細(xì)胞(箭頭頭部)及完整的神經(jīng)突起(空心箭頭)。背景上，這些突起及其分枝形成致密的網(wǎng)絡(luò)。缺氧導(dǎo)致細(xì)胞體的皺縮及神經(jīng)突起與網(wǎng)絡(luò)的崩潰。5μM劑量的PAN-811及谷氨酸鹽NMDA受體拮抗劑MK801有效地避免了神經(jīng)細(xì)胞的死亡，并部分保存了神經(jīng)突起。
3.4.4.MTS分析MTS分析是一種測定代謝活性細(xì)胞中線粒體功能的比色分析。該檢測間接反映細(xì)胞存活率。MTS四唑化合物在代謝活性細(xì)胞的線粒體中，被還原為有色的可溶于組織培養(yǎng)基的甲月替(formazan)產(chǎn)物，其在490nm的吸收可被檢測。將20μl的MTS試劑(Promega)加到含有樣品的100μl培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板的孔中。在增濕、5％二氧化碳、37℃條件下，孵育培養(yǎng)板1到2小時(shí)，直至充分呈現(xiàn)顏色。以Bio-Rad96孔讀板機(jī)記錄在490nm處的吸收。
3.4.5.LDH分析乳酸脫氫酶(LDH)分析是基于乳酸脫氫酶作用使NAD還原。得到的還原NAD(NADH)用于四唑鹽染料的化學(xué)計(jì)量轉(zhuǎn)換。如果分析從不同處理培養(yǎng)物取出的無細(xì)胞培養(yǎng)基等份，則活性可用作相關(guān)細(xì)胞死亡以及細(xì)胞膜完整性的指示。將50μl等份的培養(yǎng)基由每孔測試的96孔培養(yǎng)板的孔中轉(zhuǎn)移到未用過的培養(yǎng)板中的孔，并補(bǔ)入25μl等量混合的底物、酶及染料(Sigma)。在室溫下孵育20到30分鐘，之后于490nm波長處進(jìn)行分光光度測定。
3結(jié)果4.1.單純?nèi)毖跄Ｐ?.1.1.PAN-811的效力及毒性以PAN-811在缺氧前預(yù)處理皮質(zhì)神經(jīng)元48小時(shí)。PAN-811于24小時(shí)缺氧期間及缺氧之后的48小時(shí)保留存在。如圖5所示，2μM劑量的PAN-811完全阻止了細(xì)胞死亡，但在50μM出現(xiàn)細(xì)胞毒性。
3.1.2.與其它神經(jīng)保護(hù)劑的比較用2μM PAN-811、1∶80綠茶或5μM MK801于缺氧24小時(shí)之前、期間和之后處理皮層24小時(shí)。在檢測的試劑中，PAN-811顯示了最高的效力，完全阻止神經(jīng)細(xì)胞死亡及線粒體機(jī)能障礙。
輕度H/H模型3.1.3在受侵害之前及期間，PAN-811保護(hù)神經(jīng)元免受輕度H/H誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性培養(yǎng)胚胎(E17)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元15天，以PAN-811及媒介物在缺氧/低血糖癥之前24小時(shí)和缺氧/低血糖癥期間(6小時(shí))處理。在接受侵害后17小時(shí)，通過MTS及LDH分析評價(jià)結(jié)果。PAN-811在濃度為5μM時(shí)，完全保護(hù)了缺氧/低血糖癥誘導(dǎo)的線粒體機(jī)能障礙及神經(jīng)細(xì)胞死亡，而1∶1520倍稀釋的PEG∶EtOH(相當(dāng)于媒介物在5μM PAN-811中的量)，沒有形成這種保護(hù)。
代表性數(shù)據(jù)見圖6。下面的表2總結(jié)了6次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，濃度范圍覆蓋2-50μM。
表2 4.2.2.PAN-811在受侵害期間，特別是侵害之后，保護(hù)細(xì)胞免受輕度H/H誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性神經(jīng)元培養(yǎng)15天后，用PAN-811或媒介物PEG∶EtOH(7∶3)于6小時(shí)H/H之前處理24小時(shí)(之前組)。或者，神經(jīng)元培養(yǎng)16天后，用上述試劑在6小時(shí)H/H期間處理(期間組)，在6小時(shí)H/H期間及H/H之后的48小時(shí)階段處理(期間及之后組)，或在H/H之后的48小時(shí)階段處理(之后組)。在H/H階段之后48小時(shí)，進(jìn)行LDH分析。圖7中的結(jié)果表明，在H/H期間，特別是H/H之后處理神經(jīng)元，PAN-811保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞死亡，但在H/H之前處理神經(jīng)元，保護(hù)作用微不足道。
3.2極度H/H模型PAN-811在濃度≤50μM，未見神經(jīng)保護(hù)作用(未示資料)。
4結(jié)論4.1.PAN-811在2μM時(shí)，對單純?nèi)毖跫拜p度H/H誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性有完全的保護(hù)作用。PAN-811在100μM時(shí)，對極度H/H誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡僅有部分阻止作用。因此，PAN-811不太可能與能量代謝有關(guān)。
4.2.當(dāng)缺氧或局部缺血侵害期間或之后給藥，PAN-811顯著保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于死亡。
4.3.PAN-811的效力明顯高于MK801和/或綠茶。
4.4.在長時(shí)間暴露(120小時(shí))的情況下，50μM的PAN-811是神經(jīng)毒性的。
5.0參考文獻(xiàn)1.Jiang，Z.-G.，Piggee，C.A.，Heyes，M.P.，Murphy，C.M.，Quearry，B.，Zheng，J.，Gendelman，H.E.，and Markey，S.P.Glutamate is a principalmediator of HIV-1-infected immune competent human macrophageneurotoxicity(谷氨酸鹽是HIV-1感染的免疫活性人巨噬細(xì)胞神經(jīng)毒性主要介質(zhì)).J.Neuroimmunology 117(12)97-107，2001.
2.Folbergrová，J.，Zhao，Q.，Katsura，K.，and Siesj，B.K.N-tert-butyl-phenylnitrone improves recovery of brain energy state in ratsfollowing transient focal ischemia(N-叔丁基苯基硝酮改善大鼠在短暫的局部缺血后腦能量狀態(tài)的恢復(fù)).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 925057-5061，1995.
3.Touzani，O.，Roussel，S.，and MacKenzie，E.T.The ischemicpenumbra.(局部缺血半影)Curr.Opin.Neurol.1483-88，2001.
實(shí)施例4在短暫的局部腦缺血的體內(nèi)模型中，PAN-811顯示顯著的神經(jīng)保護(hù)作用1.導(dǎo)言在腦卒中后的頭幾分鐘減少神經(jīng)損傷，是獲得有效治療的重要策略。在腦卒中期間，血栓栓子封閉了動脈，中斷了局部腦區(qū)的氧及葡萄糖供給，從而導(dǎo)致梗死中心核的神經(jīng)元的喪失。中心核中的細(xì)胞經(jīng)壞死性機(jī)制，非常迅速地死亡。環(huán)繞著缺血梗死區(qū)的腦區(qū)，結(jié)構(gòu)尚存，但(電傳導(dǎo))功能終止，稱作半影。半影是一種暫時(shí)的區(qū)域，它演變成梗死是一種相對進(jìn)行性現(xiàn)象(Touzani et al.，2001)。這一區(qū)域提供了挽救某些腦功能的可能性，處理半影的治療窗口大大長于處理梗死區(qū)。半影也可描述為供血受限的區(qū)域，能量代謝仍然保留。因此，半影區(qū)是神經(jīng)保護(hù)治療及重新激活靜止神經(jīng)元的因子如高壓氧的靶區(qū)。由此，中樞神經(jīng)受損后立即的損傷也許不是可逆的，但加重腦損傷，主要是迷漫性腦缺氧/缺血事件鏈的進(jìn)行，可以由有效的神經(jīng)保護(hù)戰(zhàn)略加以防止。例如，在冠狀動脈側(cè)枝架橋手術(shù)(CABG)之前及期間給予神經(jīng)保護(hù)劑，能夠有效地保護(hù)由腦血流短期改變(引起輕度缺氧/低糖狀態(tài))造成的神經(jīng)變性。如此，能夠顯著地保護(hù)神經(jīng)并在神經(jīng)損傷后挽救神經(jīng)元的化合物具有非常的重要性。
2.目的在氧化應(yīng)激及缺血的體外模型中，PAN-811已顯示顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。對該化合物的現(xiàn)有工作與已知的毒性譜及藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)，強(qiáng)烈表明PAN-811用于治療腦卒中的潛力。
3.0材料及方法3.1材料-PAN-811(Vion Pharmaceuticals)-乙醇(Sigma)-PEG-300(Sigma)-MTS分析試劑盒(Promega)
3.2縮寫CABG ＝冠狀動脈側(cè)枝架橋手術(shù)EtOH＝乙醇H/H ＝缺氧/低血糖癥MCAO ＝中腦動脈閉塞PEG ＝聚乙二醇3.3研究設(shè)計(jì)3.3.1體外研究在著手體內(nèi)研究前，在數(shù)種神經(jīng)變性的細(xì)胞模型中檢測PAN-811。
3.3.1.1.神經(jīng)元培養(yǎng)由胚齡為15日齡的Sprague-Dawley大鼠胚胎制備富集的神經(jīng)元培養(yǎng)物。以無菌技術(shù)，從子宮中取出鼠胚，置于無菌神經(jīng)元培養(yǎng)基中。在解剖鏡下，從各胚胎中取出腦組織，小心去除腦膜及血管。在顯微鏡下通過大致解剖分離小腦，僅小腦組織用于培養(yǎng)。研碎組織，游離細(xì)胞，以每孔5×105細(xì)胞的密度接種到聚-L-賴氨酸預(yù)涂布的48孔培養(yǎng)板上。培養(yǎng)物在含有等量Eagle氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無谷氨酰胺)和Ham氏F-12k培養(yǎng)基的溶液中維持，該溶液補(bǔ)充有10％熱滅活的馬血清、10％胎牛血清、600μl/ml葡萄糖、100μg/ml谷氨酰胺、50U/ml青霉素及50μg/ml鏈霉素。48小時(shí)后，加入10μM阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的分裂。培養(yǎng)7天的細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)。
3.3.1.2.PAN-811的神經(jīng)毒性用不同濃度(0-100μM)的PAN-811處理細(xì)胞24小時(shí)。以MTT分析確定細(xì)胞存活率。
3.1.3.3.體外模型中神經(jīng)毒性的誘導(dǎo)對4種興奮毒性的體外模型進(jìn)行研究。暴露細(xì)胞于H/H條件3小時(shí)，或以100μM谷氨酸鹽、1μM staurosporine、10μM藜蘆定(veratridine)處理45分鐘。所有細(xì)胞與或不與10μM PAN-811的Locke氏溶液共同處理。在各興奮毒性暴露結(jié)束時(shí)，更換條件培養(yǎng)基(原始培養(yǎng)基)。將細(xì)胞孵育在無外加葡萄糖的Locke氏溶液，5％二氧化碳及95％氮?dú)怙柡偷脑鰸衩荛]容器中3小時(shí)來誘導(dǎo)H/H。
3.1.3.4.MTS分析興奮毒性侵害24小時(shí)后，評價(jià)細(xì)胞存活率。應(yīng)用以3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鹽(MTT，SigmaChemical Co.Ltd.，St.Louis，Mo)為基礎(chǔ)的四唑鹽比色分析，定量評價(jià)細(xì)胞損傷。簡言之，將染料添加到各孔(終濃度1.5mg/ml)，細(xì)胞用MTT酸化的異丙醇(0.1N HCl的異丙醇)孵育細(xì)胞，然后用96孔讀板機(jī)測定各樣品在540nm的吸收強(qiáng)度。值表示為維持在各板上的媒介物處理的對照細(xì)胞的百分比，并計(jì)算細(xì)胞存活率百分?jǐn)?shù)的變化。
3.1.2體內(nèi)研究3.1.2.1.MCAO 36只雄性Sprague-Dawley大鼠(270-330克，Charles River Labs，Raleigh，VA)用于本項(xiàng)研究。以5％氟烷誘導(dǎo)麻醉，和在2％氟烷的氧氣中維持。以恒溫加熱系統(tǒng)(Harvard Apparatus，SouthNatick，MA)，使體溫在整個(gè)手術(shù)過程中保持在正常溫度(37±1℃)。食物及水于手術(shù)前后隨意攝取，動物在12小時(shí)明暗周期環(huán)境中，分籠飼養(yǎng)。麻醉后，使用中腦動脈閉塞(MACO)的絲阻方法(filament method)來實(shí)現(xiàn)短暫局部缺血并重灌流。簡言之，分離右側(cè)外頸動脈并凝結(jié)其分支。以3-0未涂布的圓頭單絲尼龍縫合線，經(jīng)外頸動脈插入內(nèi)頸動脈，并向前推進(jìn)(由頸動脈分叉算起約22mm)直至遇到輕微阻抗，這樣封閉了MCA的起端。血管內(nèi)縫合線留在原處2小時(shí)，然后收回以允許血液重新灌流到MCA。MCAO手術(shù)后，動物放到維持22℃室溫的恢復(fù)籠中。在2小時(shí)缺血階段及缺血后最初6小時(shí)，也用75瓦加熱燈直接放在每個(gè)籠子的頂部，以保證整個(gè)試驗(yàn)中動物的體溫恒定在正常體溫。
3.1.2.2.用PAN-811處理在MCAO之前，經(jīng)靜脈內(nèi)注射，以每公斤體重1毫克PAN-811處理大鼠10分鐘。制備PAN-811的70％PEG300，30％EtOH的儲液。在注射前，用無菌鹽水將該儲液稀釋5倍(終濃度為1mg/ml)。
3.1.2.3.梗死體積的測定對每只大鼠腦而言，缺血性腦損傷的分析被測量為總的梗死體積的函數(shù)。這從氯化2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)染色7個(gè)冠狀切片(2毫米厚)獲得。腦切片采集區(qū)由額極1毫米處開始，終止于皮質(zhì)小腦接合處的嘴端。使用計(jì)算機(jī)輔助影像分析計(jì)算梗死體積。簡言之，每一TTC染色的前腦切片的后表面被數(shù)字化成像(Loats Associates，Westminster，MD)，并定量缺血損傷的面積(以平方毫米計(jì))。
4結(jié)果4.1.體外研究4.1.1PAN-811的神經(jīng)毒性結(jié)果見圖1。實(shí)際上，PAN-811在濃度最高為100μM時(shí)，僅有輕微的毒性。在檢測的最高濃度，最大毒性僅為8.7％(見圖8)。
4.1.2PAN-811的神經(jīng)保護(hù)PAN-811顯示明顯地保護(hù)神經(jīng)元免受不同興奮毒的侵害(圖2)。以10μM PAN-811預(yù)處理神經(jīng)元保護(hù)缺氧/低糖(保護(hù)約92％)，100μM谷氨酸鹽(保護(hù)約75％)，1μM staurosporine蛋白激酶C抑制劑及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑(保護(hù)約47％)及10μM藜蘆定鈉通道阻斷劑(保護(hù)約39％)處理3小時(shí)誘導(dǎo)的損害(見圖9)。
4.2體內(nèi)研究本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表3。36只大鼠用于本試驗(yàn)，而11只大鼠因以下原因被排除在外4只在無出血并發(fā)癥下死于嚴(yán)重卒中，4只出現(xiàn)亞急性出血(SAH)(24小時(shí)內(nèi)有3只死亡)、1只由于手術(shù)中突發(fā)火災(zāi)演習(xí)、1只鼠由于統(tǒng)計(jì)定為無關(guān)項(xiàng)、另1只死于過量的氟烷。在這7只死亡的大鼠(4只無SAH，和3只有SAH下死于嚴(yán)重卒中)中，6只是未處理(媒介物)的大鼠，僅1只是PAN-811處理的。媒介物處理的大鼠的平均梗死體積為292.96mm3，范圍在198.75-355.81。PAN-811處理的大鼠的平均梗死體積為225.85mm3，范圍在42.36-387.08。這顯示23％的神經(jīng)保護(hù)(p＜0.05)。由于原因未知，在對照組觀察到比正常測量更嚴(yán)重的損傷。因此，PAN-811處理動物的梗死尺寸也比預(yù)計(jì)的神經(jīng)保護(hù)要顯著得多。盡管如此，在兩組中的差異性是極好的(SEM為10％或更少)，差異性結(jié)果與先前發(fā)表的研究一樣好，如果不是更好的話。
5結(jié)論11.1在體外及體內(nèi)模型系統(tǒng)中，PAN-811的耐受良好，并且相對無毒。
11.2以10μM PAN-811預(yù)處理神經(jīng)元，明顯保護(hù)神經(jīng)元免受導(dǎo)致神經(jīng)變性的興奮毒性的侵害。
11.3在短暫局部腦缺血前10分鐘以單劑量(1mg/ml)的PAN-811預(yù)處理大鼠，可減小23％的平均梗死體積。
6參考文獻(xiàn)6.1文獻(xiàn)5.1.1Williams AJ，Dave JR，Phillips JB，Lin Y，McCabe RT，andTortella FC.(2000)Neuroprotective efficacy and therapeutic window of thehigh-affinity N-methyl-D-aspartate antagonist conantokin-Ginvitro(primary cerebellar neurons)and in vivo(rat model of transient focalbrain ischemia)studies(高親和性N-甲基-D-天冬氨酸鹽拮抗劑conantokin-G的神經(jīng)保護(hù)功效和治療窗口體外(原代小腦神經(jīng)元)和體內(nèi)(短暫局部腦缺血大鼠模型)研究).J Pharmacol Exp Ther.294(1)378-86.
7.表3

表I媒介物和PAN-811處理的大鼠的梗死體積。大鼠在MACO前用1mg/ml PAN-811處理10分鐘，手術(shù)之后24小時(shí)測定梗死體積。
實(shí)施例5PAN-811保護(hù)神經(jīng)元免受過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激1.0目的本研究的目的是在阿爾茲海默病相關(guān)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中，評價(jià)PAN-811作為神經(jīng)保護(hù)劑的功效。神經(jīng)保護(hù)及細(xì)胞毒性被測定。不同的溶劑被檢測，以確定是否合適作為投遞PAN-811的媒介體。
2.0材料及方法
2.1材料-神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Invitrogen)-B27-AO(Invitrogen)-PAN-811(Vion Pharmaceuticals，Inc.)-過氧化氫(Calbiochem)-乙醇(Sigma)-DMSO(Sigma)-PEG-300(Sigma)-MTS分析試劑盒(Promega)2.2設(shè)備-天平(Mettler-Toledo，Inc.)-可調(diào)加樣器(Finnpipette)-細(xì)胞培養(yǎng)櫥(Thermo Forma)-細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma)-讀板機(jī)(Bio-Rad Model 550)2.3研究設(shè)計(jì)2.3.1細(xì)胞的分離及培養(yǎng)初生皮層神經(jīng)元從17日齡大鼠的胚腦分離，并以每孔5萬個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，在常規(guī)的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3周。以不含抗氧化劑的新鮮神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基半量換液兩次。
2.3.2用PAN-811及過氧化氫處理PAN-811以1mg/ml(～5mM)溶解于乙醇或DMSO中，以5mg/ml(～25mM)溶解于PEG-300/乙醇(70％/30％)中，并進(jìn)一步以培養(yǎng)基稀釋到1μM、5μM、20μM及50μM的終濃度。神經(jīng)元用PAN-811或媒介物處理24小時(shí)，之后進(jìn)行由過氧化氫(終濃度60-70μM)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。對照包括未處理的細(xì)胞(沒有PAN-811及過氧化氫處理)、僅僅用PAN-811處理的細(xì)胞和暴露于過氧化氫但沒有PAN-811的細(xì)胞。未處理的細(xì)胞用作對照以評價(jià)神經(jīng)元毒性及改進(jìn)的存活率。每個(gè)分析重復(fù)3次。等體積的溶劑(乙醇、DMSO與PEG-300/乙醇)被加到細(xì)胞中以測定溶劑對分析的影響。
2.3.3.細(xì)胞功能的評價(jià)24小時(shí)后，使用標(biāo)準(zhǔn)的MTS分析(Promega)評價(jià)培養(yǎng)物的存活率及線粒體功能。遵循制造商的操作規(guī)程。
3.結(jié)果3.1實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)以上述研究設(shè)計(jì)中描述的方法進(jìn)行。在處理結(jié)束時(shí)，用100μl新鮮的預(yù)熱神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上B27(-AO)更換所有的處理和培養(yǎng)基。培養(yǎng)板被放回到37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱一小時(shí)，然后每孔中加入20μl的MTS試劑，培養(yǎng)板繼續(xù)在37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩小時(shí)。以BioRad讀板機(jī)(型號550)記錄每孔在490nm的吸收。僅含培養(yǎng)基的孔作為空白對照。每個(gè)資料點(diǎn)是三個(gè)單獨(dú)分析孔的平均。未處理的細(xì)胞被用作計(jì)算細(xì)胞存活率及神經(jīng)保護(hù)能力的對照。三周齡的原代培養(yǎng)物用于這一研究。結(jié)果請見圖10。
3.2實(shí)驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)1的相同方法進(jìn)行。兩周齡的原代培養(yǎng)用于這一研究。結(jié)果請見圖11。
4.討論所有三種溶劑在相當(dāng)于PAN-811終濃度1-10μM的稀釋度時(shí)，對本分析系統(tǒng)有最小的影響。DMSO在相當(dāng)于PAN-811終濃度20μM或以上的稀釋度時(shí)，顯示一定水平的神經(jīng)保護(hù)。乙醇和PEG-300/乙醇在相當(dāng)于PAN-811終濃度50μM的稀釋度時(shí)，顯示一定水平的神經(jīng)保護(hù)能力。PAN-811在1-10μM時(shí)，顯示好的神經(jīng)保護(hù)。與單獨(dú)乙醇比較，PAN-811在PEG-300/乙醇中有較好的溶解性。
5.結(jié)論P(yáng)AN-811在1-10μM的終濃度時(shí)，顯示良好的神經(jīng)保護(hù)能力。PEG-300/乙醇在相當(dāng)于PAN-811 1-20μM的稀釋度時(shí)，對分析系統(tǒng)有最小的干擾，因此是被檢3種溶劑中最好的PAN-811溶劑。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易得知本發(fā)明非常適合于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)，并獲得最終結(jié)果和所述優(yōu)點(diǎn)以及其中內(nèi)在的東西。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可有不同的修飾及變更而無需背離本發(fā)明的精神及范圍。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可以在包含權(quán)利要求書中限定的本發(fā)明實(shí)質(zhì)的范圍內(nèi)進(jìn)行這里所述的修改和其他的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.治療缺血相關(guān)疾病的方法，包括對病人給藥通式I的化合物或其藥物前體 其中E是氧、硫、NH或N-C1-6烷基；R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環(huán)烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)另外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子；并且HET為任選取代的5到7元雜芳香基殘基，該雜芳香基殘基含有1到4個(gè)選自氮、氧或硫的雜環(huán)原子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中E是硫。
3.權(quán)利要求1的方法，其中HET是下列通式的殘基 其中m是0或1；當(dāng)m為0時(shí)，Z1、Z2及Z3獨(dú)立地選自N、O、S或CR；或當(dāng)m為1時(shí)，Z1、Z2及Z3獨(dú)立地選自N或CR；R每次出現(xiàn)時(shí)，獨(dú)立地選自氫、鹵化物、羥基、巰基、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基；并且x為由0到4的整數(shù)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中當(dāng)Z1、Z2或Z3中的0或1個(gè)為N時(shí)，剩余的為CR。
5.權(quán)利要求1的方法，其中HET殘基選自任選取代的吡啶基、任選取代的吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基。
6.權(quán)利要求1的方法，其中HET是任選取代的吡啶基。
7.權(quán)利要求1的方法，其中E為硫；HET殘基是選自任選取代的吡啶基、任選取代的吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基；并且R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環(huán)烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)另外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子。
8.治療缺血相關(guān)疾病的方法，包括對病人給藥通式II的化合物或其藥物前體 其中R、R1、R2、R3及R4獨(dú)立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環(huán)烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷酰基，或者NR1R2組合形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)另外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子；并且x為0到5的整數(shù)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中x是0、1、2或3，R、R1、R2、R3及R4獨(dú)立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環(huán)烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷?；?，或者NR1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)另外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子。
10.權(quán)利要求9的方法，其中R、R1、R2和R3獨(dú)立地選自氫、C1-4烷基、C1-2鹵代烷基、苯基、氨基C1-4烷基、羥基C1-4烷基、C1-4烷氧基C148烷基及C1-4烷?；?，或者NR1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)另外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子。
11.權(quán)利要求8的方法，其中給藥的化合物或其藥物前體是下列通式III的化合物 其中R、R1、R2、R3及R4獨(dú)立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環(huán)烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2組合形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0、1或2個(gè)另外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子；R6為氫、羥基、氨基或C1-8烷基；R5及R7獨(dú)立地選自氫、鹵化物、羥基、巰基、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基。
12.權(quán)利要求8的方法，其中R4是氫或C1-6烷基。
13.權(quán)利要求12的方法，其中R4是氫、甲基、乙基、正丙基或異丙基。
14.權(quán)利要求11的方法，其中R5選自氫或任選取代的氨基；R6為氫或C1-4烷基；并且R7為氫，任選取代的氨基或羥基，其中R5中至少一個(gè)是氨基、N-羥基氨基、單-或二-(C1-4烷基)氨基或N-(C1-4烷基)-N-(羥基)氨基，并且R5選自氫、羥基氨基、單-及二-(C1-8烷基)氨基、羥基及C1-8烷氧基；R6選自氫、羥基氨基、單-及二-(C1-8烷基)氨基；并且R5不同于R6，并且R5及R6之一為氫。
15.權(quán)利要求11的方法，其中R4是氫或C1-6烷基；并且，R1、R2及R3獨(dú)立地選自氫、C1-4烷基、C1-2鹵代烷基、苯基、氨基C1-4烷基、羥基C1-4烷基、C1-4烷氧基C148烷基及C1-4烷?；蛘逳R1R2合起來形成3到7元環(huán)，該環(huán)可包含0或1個(gè)另外選自氮、氧及硫的雜環(huán)原子。
16.權(quán)利要求11的方法，其中R4為氫、甲基、乙基、正丙基或異丙基；并且R1、R2及R3獨(dú)立地選自氫、甲基、乙基、乙酰基、甲酰基，或者NR1R2合起來形成哌啶基、吡咯烷基、嗎啉基、硫代嗎啉基或哌嗪基。
17.權(quán)利要求11的方法，其中R4為氫、甲基或乙基；并且R1、R2及R3獨(dú)立地選自氫、甲基、乙基及乙?；?br> 18.權(quán)利要求1到17中任一項(xiàng)的方法，其中缺血相關(guān)疾病選自阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、冠狀動脈側(cè)枝架橋手術(shù)、心博停止導(dǎo)致的彌漫性腦缺血、病灶性腦梗塞、腦出血、出血性梗塞、高血壓性出血、由顱內(nèi)血管異常破裂造成的出血、顱內(nèi)動脈瘤破裂造成的蛛網(wǎng)膜下腔出血、高血壓性腦病、造成腦缺血的頸動脈狹窄或阻塞、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓損傷、腦血管疾病例如，動脈粥樣硬化、脈管炎、斑變性，心肌梗塞、心肌缺血及室上性心動過速。
19.治療缺血相關(guān)疾病的方法，包含對病人給藥具有下列通式的化合物
20.權(quán)利要求19的方法，其中缺血相關(guān)疾病選自阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、冠狀動脈側(cè)枝架橋手術(shù)、心博停止導(dǎo)致的彌漫性腦缺血、病灶性腦梗塞、腦出血、出血性梗塞、高血壓性出血、由顱內(nèi)血管異常破裂造成的腦出血、顱內(nèi)動脈瘤破裂造成的蛛網(wǎng)膜下腔出血、高血壓性腦病、造成腦缺血的頸動脈狹窄或阻塞、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓損傷、腦血管疾病例如，動脈粥樣硬化、脈管炎、斑變性、心肌梗塞、心肌缺血及室上性心動過速。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過施用縮氨基硫脲化合物給需要的病人來治療缺血相關(guān)疾病的方法。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及治療特定的缺血相關(guān)疾病的方法，所述疾病包括但不限于阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、冠狀動脈側(cè)枝架橋手術(shù)、心搏停止導(dǎo)致的彌漫性腦缺血、病灶性腦梗塞、腦出血、出血性梗塞、高血壓性出血、由顱內(nèi)血管畸形破裂造成的腦出血、顱內(nèi)動脈瘤破裂造成的蛛網(wǎng)膜下腔出血、高血壓性腦病、頸動脈狹窄或阻塞造成的腦缺血、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓損傷、腦血管疾病例如，動脈粥樣硬化、脈管炎、斑變性、心肌梗塞、心肌缺血及室上性心動過速。
文檔編號A61K31/44GK1816336SQ200480018789
公開日2006年8月9日 申請日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月1日
發(fā)明者畢堅(jiān)·阿爾瑪森, 侯賽因·甘巴瑞, 邁克爾·力包未次, 潘魏英, 姜志鋼 申請人:萬能藥制藥公司