專利名稱：川藏香茶菜甲素在防治急性淋巴細(xì)胞白血病及宮頸癌中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)在預(yù)防、控制或治療急性淋巴細(xì)胞白血病及宮頸癌中的用途。
背景技術(shù)：
微管的極化結(jié)構(gòu)是由oc-和P-微管蛋白異二聚體以GTP依賴的方式裝配在一起的。微管不僅保持細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的很多進(jìn)程起到重要作用，比如細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)或細(xì)胞器長(zhǎng)距離的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及有絲分裂紡錘體的組裝。微管的動(dòng)力在細(xì)胞周期的過(guò)程中起著重要作用，任何對(duì)這一動(dòng)態(tài)過(guò)程的干擾都將引起有絲分裂阻滯并通常伴隨凋亡或有絲分裂異常。
臨床上紫杉醇的成功使用使得越來(lái)越多的研究致力于發(fā)現(xiàn)新的微管靶向化合物如ixabepilone和長(zhǎng)春氟寧。這些新化合物具有類似的干擾微管動(dòng)力的作用，但具有不同的生物學(xué)活性，這使得它們?cè)谂R床上擁有不同的功效。旱生香茶菜是一種云南產(chǎn)的多年生草本才直物，民間作為抗腫瘤、抗炎和抗;微生物制劑^f吏用。在過(guò)去的30年間，從香茶菜屬植物中提取、分離鑒定了大量對(duì)映-貝殼杉烷類化合物，其中不少化合物具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性和較低的毒性。例如，毛萼乙素(eriocalyxin B )能夠使小鼠t(8;21)易位的白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡，這顯示該化合物可能治療t(8;21)易位白血病。這一化合物以非竟?fàn)幮问礁蓴_p65和p50結(jié)合到特異的順式作用元件從而活化核因子kb (NFkB)。此外，運(yùn)用化學(xué)和遺傳學(xué)篩選的方法，Rundle等人發(fā)現(xiàn)ent-15-oxokaurenoic acid是一種活性成分，它能夠通過(guò)抑制染色體運(yùn)動(dòng)和有絲分裂動(dòng)力蛋白CENP-E結(jié)合到著絲點(diǎn)而引起有絲分裂阻滯。
多種微管活性化合物已經(jīng)成功研制成為抗癌藥物，例如紫杉醇和相關(guān)的紫杉烷類通過(guò)促進(jìn)微管蛋白聚合和穩(wěn)定微管并繼而引起有絲分裂阻滯和細(xì)胞凋亡，顯示出了強(qiáng)大的抗癌活性。這些化合物對(duì)于很多惡性肺瘤有效，例如頑固性卵巢癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、頭頸部腫瘤，以及膀胱癌等。于臨床(如長(zhǎng)春新堿)。因此，抗微管類制劑是治療腫瘤很重要的武器。然而，現(xiàn)有的抗微管類化合物仍具有一些局限性，比如耐藥性。因此，很有必要研發(fā)新的有效的抗微管類先導(dǎo)化合物用于腫瘤治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是提供一種川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)的用途，其不^義可安全有效地用于防治急性^fr巴細(xì)胞白血病，且還可安全有效地用于防治宮頸癌。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)的用途，所述
川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)包括川藏香茶菜曱素、其生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的鹽、其水合物或它們的混合物，其特征在于，用于制備預(yù)防、控制或治療與急性淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)的或?qū)m頸癌相關(guān)的疾病或征狀的組合物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物是藥物組合物、保健品組合物、食物組合物或膳食添加劑。
在本發(fā)明的另 一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)占所述組合物總重量的0.001 ~ 99.9wt% 。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)占組合物總重量的1 ~95wt % ，較優(yōu)選為5 ~ 90wt % ,更優(yōu)選10 ~ 80wt % 。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)的含量為0.01 ~ 2000mg /劑。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)的含量為0.01—5.0mg/劑，更優(yōu)選為0.05 ~ 4.0mg /劑，進(jìn)一步優(yōu)選含有0.1 ~ 3.0mg /劑；最優(yōu)選的含有川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)0.2 ~ 2.0mg /劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)的含量為5.0-250mg /劑；更優(yōu)選10 ~ 200mg /劑，進(jìn)一步優(yōu)選20 ~ 150mg /劑，更優(yōu)選30 ~100mg /劑；最優(yōu)選的，含有川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)40 ~ 70mg /劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)的含量為250 -2000mg /劑；更優(yōu)選300- 1500mg /劑，進(jìn)一步優(yōu)選500 ~ 1200mg /劑，更優(yōu)選750~ 1100mg/劑；最優(yōu)選的，含有川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)800~ 1000mg/劑。在本發(fā)明的另 一個(gè)優(yōu)選例中，每天施用1 ~ 6劑本發(fā)明的組合物，優(yōu)選施用1 ~ 3劑。
在本發(fā)明的另 一優(yōu)選實(shí)施方式中，由于川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)具有防治急性淋巴細(xì)胞白血病效果，其還可用于預(yù)防、治療和控制與有絲分裂阻滯相關(guān)
的疾病，例如但不限于急性非淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤'f曼性
粒細(xì)月包性白血病。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，由于川藏香茶菜甲素具有防治宮頸癌效
果，其還可用于預(yù)防、治療和控制與有絲分裂阻滯相關(guān)的疾病，例如但不限于頑固性卵巢癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、頭頸部腫瘤以及膀胱癌。
在本發(fā)明的另 一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物還包括用于防治急性淋巴細(xì)胞白血病的其它物質(zhì)，所述的其它物質(zhì)選自下組紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松，柔紅霉素、阿糖胞香、門冬酰胺酶及曱氨喋呤。
在本發(fā)明的另 一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物還包括用于防治宮頸癌的其它物質(zhì)，所述的其它物質(zhì)選自下組紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、順鉑、環(huán)磷酰胺、5-t^嗜啶、阿霉素及博萊霉素。
在本發(fā)明的第二方面中提供了 一種防治急性淋巴細(xì)胞白血病方法，所述方法包括給予需要防治急性淋巴細(xì)胞白血病的對(duì)象有效量的川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)或含有川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)的組合物，其中所述川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)包括川藏香茶菜曱素、其生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的鹽、其水合物或它們的混合物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述防治急性淋巴細(xì)胞白血病方法優(yōu)選為非治療目的的防治急性淋巴細(xì)胞白血病方法。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)占所述組合物總重量的0.001 ~ 99.9wt% 。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，給予對(duì)象的川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)的劑量為0.01 ~ 2000mg / 60kg體重/天。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，給予對(duì)象的川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)的劑量為0.05 ~ 1500mg / 60kg體重/天，更優(yōu)選為0.1 ~ 1000mg / 60kg體重/天，最優(yōu)選為1 ~ 500mg / 60kg體重/天。
6在本發(fā)明的另 一優(yōu)選例中，將所述的量單次給予或多次給予。
在本發(fā)明的另 一優(yōu)選例中，所述防治急性淋巴細(xì)胞白血病方法還包括同時(shí)
施用其它防治急性淋巴細(xì)胞白血病藥物、保健品或采用其它防治急性淋巴細(xì)月包
白血病方案。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，所述防治急性淋巴細(xì)胞白血病藥物選自紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松，柔紅霉素、阿糖胞苷、門冬酰胺酶及曱氨喋呤。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種組合物，所述組合物含有
(1) 有效量的川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)，其中所述川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)包括川藏香茶菜曱素、其生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的鹽、其水合物或它們的混合物；
(2) 選自下組的一種或多種物質(zhì)紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、順鉑、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素及博萊霉素；和
(3) 藥學(xué)上可接受的載體或食品學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述組合物還含有具有預(yù)防、控制或治療與宮頸癌相關(guān)的疾病或征狀的選自下組的一種或多種物質(zhì)紫杉醇、長(zhǎng)春新石咸、順鉑、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素及博萊霉素。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)占組合物總重量的0.001 ~ 99.9wt % ， 1 ~ 95wt % ,較優(yōu)選為5 ~ 90wt % ，更優(yōu)選10 ~ 80wt % 。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明主要提供了川藏香茶菜曱素在制備藥物組合物、食物組合物、保健品組合物和/或膳食添加劑中的用途，所述組合物用于預(yù)防、控制或治療與白血病相關(guān)的疾病和/或與腫瘤相關(guān)的征狀或疾病。本發(fā)明還提供了一種包含川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)和其它具有預(yù)防、控制或治療與白血病相關(guān)的疾病和/或與腫瘤相關(guān)的征狀或疾病物質(zhì)的組合物。本發(fā)明的組合物具有安全性高；容易吸收、穩(wěn)定性好；易為市場(chǎng)所接受等優(yōu)點(diǎn)。


圖l,川藏香茶菜甲素的相對(duì)立體構(gòu)型。圖2， Jurkat (上)和Raji細(xì)胞(下)均用指定濃度的pharicin A處理不同時(shí)間，活 細(xì)胞數(shù)量(左)和活力(右)都通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn);險(xiǎn)測(cè)，所有的值都是均值±標(biāo)準(zhǔn) 差表示。這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)了五遍，每次三個(gè)樣本。
圖3a、圖3b, Pharicin A引起Jurkat和Raji細(xì)胞有絲分裂阻滯，(a)用l、 2和4 pM pharicin A處理24或48小時(shí)，Jurkat和Raji細(xì)胞被收集并甩至載玻片，用瑞氏姬姆 薩染料染色，并用100x/1.3物鏡的Olympus BX60觀察；(b)用pharicin A (2 pM)、 紫杉醇(10nM)或喏考達(dá)唑(1 (iM)處理12小時(shí)，Jurkat和Raji細(xì)胞用H3S10抗體 (紅色)染色，細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色)，焚光信號(hào)用Bio-Rad MRC-1024激光掃描 共聚焦顯微鏡檢測(cè)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)了至少四次，并得到類似的結(jié)果，圖中顯示 了代表性的圖像。
圖4， Pharicin A穩(wěn)定Jurkat和Raji細(xì)胞的孩丈管，Jurkat和Raji細(xì)胞都用pharicin A (2)LiM)、紫杉醇(10nM)或嗜考達(dá)唑(Noc， 1 nM)處理12小時(shí)，并用a-微管蛋白 抗體(紅色)染色，DNA用DAPI(藍(lán)色)染色。圖中顯示代表性圖像。
圖5a、圖5b, Pharicin A引起的有絲分裂阻滯與Cdkl/cyclin B的活化相關(guān)， Jurkat和Raji細(xì)胞用pharicin A (2 fiM)處理了指定的時(shí)間，也用紫杉醇(10 nM)或 喏考達(dá)唑(Noc， 1 pM)分別處理12和24小時(shí)，處理細(xì)胞的DNA含量用流式細(xì)胞術(shù) 分析(A)。等量的細(xì)胞裂解液用蛋白印跡檢測(cè)cyclinBl、 Cdkl、 pCdkl(Tyr 15)、 pCdkl(Thr 161)、 MPM-2和卩-actin(B)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)了三次。
圖6， Pharicin A引起有絲分裂災(zāi)變。HeLa細(xì)胞用pharicin A (4 pM)、紫杉醇 (10 nM)或喏考達(dá)唑(1 ^M)處理指定時(shí)間，細(xì)胞裂解液用蛋白印跡檢測(cè)PAPR-1 和P-actin。條帶p89顯示了PARP-l的剪切產(chǎn)物。
圖7a、圖7b， Pharicin A增加Cdc20和紡錘體檢查點(diǎn)蛋白的相互作用，(a) Jurkat 和Raji細(xì)胞用pharicin A (2 一)處理了指定的時(shí)間，或用紫杉醇(10 nM)或喏考達(dá) 唑(Noc, 1 nM)分別處理12和24小時(shí)，等量的細(xì)胞裂解液用蛋白印跡檢測(cè)Cdc20、 Cdc27 、 Mad2和卩-actin; (b) Jurkat細(xì)胞用pharicin A (2 iaM)或DMSO處理12小時(shí) 后進(jìn)行免疫共沉淀，Cdc20抗體或正常免疫前兔源免疫球蛋白IgG的免疫沉淀物， 以及全細(xì)胞裂解液(i叩ut)用Cdc20、 Cdc27、 Mad2或BubRl進(jìn)行蛋白印跡分析。 所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)了四次，并得到類似結(jié)果。
圖8， Pharicin A在滯后/錯(cuò)分的染色體上優(yōu)先維持CENP-E和Sgol信號(hào)。
8HeLa細(xì)胞用pharicin A (2 pM)或喏考達(dá)唑(Noc, 1 pM)處理24小時(shí)，并用免 疫熒光方法;險(xiǎn)測(cè)CENP-E (綠色)和Sgol (紅色)分布。DNA用DAPI (藍(lán)色)染色。 文中顯示代表性圖像。
圖9a、圖9b， Pharicin A引起HeLa細(xì)胞有絲分裂阻滯。(a) HeLa細(xì)胞用pharicin A (2 nM)、紫杉醇(10nM)、喏考達(dá)唑(Noc， 1 jiM)或DMSO處理24小時(shí)，處理 的細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下觀察，圖中顯示了代表性的圖像；(b)HeLa細(xì)胞用pharicin A(2|iM)、紫杉醇(10nM)、喏考達(dá)唑(Noc， 1 nM)或DMSO處理24小時(shí)，處理 的細(xì)胞用免疫熒光方法檢測(cè)a-微管蛋白(綠色)和H3S10(紅色)分布，DNA用 DAPI染色(藍(lán)色)。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，并得到類似結(jié)果。
圖10a、圖1 Ob 、圖10c、圖10d, Pharicin A I起Hela細(xì)胞染色體錯(cuò)誤分離以 及紡錘體檢查點(diǎn)失調(diào)。(a)HeLa細(xì)胞用pharicinA(2pM)、紫杉醇(10nM)、喏考 達(dá)唑(Noc， 1 iuM)或DMSO處理24小時(shí)，處理的細(xì)胞用a-拔克管蛋白(綠色)和 H3S10(紅色)染色。DNA用DAPI染色(藍(lán)色)；(b)A中所示pharicinA或DMSO處理 細(xì)胞中的滯后/錯(cuò)分的染色體比例被統(tǒng)計(jì)出來(lái)。(c) HeLa細(xì)胞用pharicin A (2 |iM)、 紫杉醇(10nM)、喏考達(dá)喳(Noc， 1 (iM)或DMSO處理24小時(shí)，等量的細(xì)胞裂解 液用蛋白印跡檢測(cè)BubRl、 Cdc27、 Cdcl6或p-actin; (d) HeLa細(xì)胞用pharicin A (2 pM)、紫杉醇(10nM)、喏考達(dá)唑(Noc, 1 )dM)或DMSO處理24小時(shí)，處理的細(xì) 胞用BubRl(綠色)和CREST(紅色)染色。DNA用DAPI染色(藍(lán)色)。所有試驗(yàn)重復(fù) 了至少三次，圖中顯示了代表性的圖像。
圖lla、圖llb、圖llc， Pharicin A增加微管聚合，但作用方式與紫杉醇不 同。(a)純化的兔腦微管蛋白與指定濃度的pharicinA、紫杉醇(20nM)或喏考達(dá)唑 (5 iaM)—起孵育。檢測(cè)340 nm時(shí)的OD值檢測(cè)體外微管聚合狀況；(b)加入或 不加入pharicin A (2 nM)、 紫杉醇(10 nM)或喏考達(dá)唑(l |uM)12小時(shí)，Jurkat細(xì) 胞分為可溶的微管蛋白二聚體(S)和不可溶的微管多聚體(P),并用免疫印跡檢 測(cè)；(c)紫杉醇耐受的Jurkat細(xì)胞用紫杉醇(20 nM)或pharicin A (2 pM)處理24 小時(shí)，處理的細(xì)胞用瑞氏姬姆薩染料染色(上)或用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分 布的DNA含量(下)。
具體實(shí)施方式
現(xiàn)依據(jù)附圖，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)"川藏香茶菜甲素"、"活性成分"和"川藏香茶菜甲素活 性物質(zhì)"可互換使用，它們是指具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物(即川藏香茶菜甲素)、 其生理學(xué)可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或它們的混合物。
在本發(fā)明中，對(duì)于制備川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)的方法沒(méi)有特別的限制， 比如其可以提取自植物，或者可以采用化學(xué)合成的方法來(lái)制備，只要其具有上 述結(jié)構(gòu)。 一種優(yōu)選的方法是從植物中提取川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)，優(yōu)選的植 物為川藏香茶菜。
川藏香茶菜樣品采自西藏拉薩地區(qū)，由中科院昆明植物所李錫文教授鑒定，
實(shí)驗(yàn)室。植物原料經(jīng)提取分離得到川藏香茶菜曱素，利用各項(xiàng)波鐠技術(shù)，特別 是核磁共振波譜A^:譜鑒定其結(jié)構(gòu)。
川藏香茶菜甲素的分離和鑒定
粉碎后的川藏香茶菜(4kg)用70%丙酮-水在常溫下浸泡提取(共提取3次， 每次12升)，放置過(guò)夜。提取液減壓蒸餾除去丙酮，用乙酸乙酯萃取水相3次， 減壓蒸餾濃縮，合并濃縮液得浸膏(380g)。浸膏用少量90%曱醇溶解，用MCI 脫色，依次用卯％甲醇和100%曱醇洗脫，濃縮90%甲醇洗脫液得到浸膏(285巨)。 浸膏用少量甲醇溶解后，60-100目硅膠(300g)拌樣，用1.5kg200-300目硅膠 干法上柱，依次用氯仿-丙酮(1:0， 9:1，4:1,2:1，1:1,0:1)洗脫，濃縮后分別得A-F 六個(gè)餾份。餾份B用200"300目娃膠干法上柱，依次用石油醚-丙酮 (99:1,9:1,4:1，2:1，1:1)洗脫得B1-B5五個(gè)餾份。川藏香茶菜甲素(400mg,純度 大于98%)從Bl餾分中結(jié)晶析出。川藏香茶菜曱素(l),白色無(wú)定形粉末。由高分辨質(zhì)譜(HRESIMS)確定 其分子式為C24H3407 (測(cè)定值m/z 457.2191 [M + Na]+，計(jì)算值457.2202 )，顯 示不飽和度為8。紅外光譜中3383, 1726和1647 cm-l的信號(hào)，預(yù)示羥基、羰 基和ot,P不飽和羰基的存在。化合物1的13C NMR諳顯示有24個(gè)碳信號(hào)，除去 兩個(gè)乙酰基4個(gè)碳的信號(hào)(5C 170.6, s, 168.1， s, 21.2, q， 21.2, q )夕卜，其余20個(gè) 碳信號(hào)分屬于3個(gè)甲基、5個(gè)亞曱基(包括l個(gè)sp2亞甲基)、7個(gè)次曱基(包括 4個(gè)氧化的次曱基)、5個(gè)季碳(包括2個(gè)sp2季碳)(見表1)。
表1. 'H and 13C NMR data of pharicin A (in CDC13， 3 in ppm， Jin Hz)
Carbon.4jCarbon<5c
11.30 (lH，td, 3.2, 13.4)32.8 t133.11 (1H, d，3.2)53.8 d
1.44(1H，brd， 12.9)
21.61 (IH， overlapped)22.5 t145.19 (1H， s)69.6 d
1.88 flH，m)
34.63 (IH， s)77,3 d15205.7 s
436.6 s16144.1 s
51.53 (1H, overlapped)46.7 d176.15 (1H, s) 5.43 (IH， s)119,5 t
61.64 (2H, overlapped)25.0 t180.87 (3H, s)27.8 q
"75.52(1H，dd, 11.8, 4.2)76.4 d19O.卯(3H， s)21.5 q
860.9 s201.29 (3H, s)15.6 q
91.61 (1H, overlapped)、55.8 dOAc2.05 (3H， s)170.6 s
1038.3 s21.2 q
111.96(1H，dd， 11.6,3.6)24.5 tOAc1.99(3H, s)168.1 s
1.62 flH, overlapped)
124.09 (1H, brs)72.0 d21.2 q
表明化合物1為1個(gè)對(duì)映-貝殼杉烷型二薛。
在HMBC中觀察到的從H-3 (5H4.63)到C-l (5C 32.8)、 C-5 (5C 46.7)和C-19 (SC 21.5);從H國(guó)7 (SH 5.52, tid， J = 11.8,4.2 Hz)到C-8 (SC 60.9)、 C-14 (5C 69.6) 和C-15 (SC 205.7);從H畫12 (3H 4.09)到C-9 (SC 55.8)和C-14 (SC 69.6)以及從 H-14 (SH 5.19)到C-7 (SC 76.4)、 C-15 (SC 205.7)和C曙16 (3C 144.1)的相關(guān)信號(hào), 提示4個(gè)氧化的次曱基分別連在C-3、 C-7、 C-12和C-14上。此外，根據(jù)HMBC 中H-3 (SH 4.63)和OAc (SC 170.6)以及H-7 (SH 5.52)和OAc (SC 168.1)的相關(guān)， 可知兩個(gè)乙酰lL&分別連在C-3和C-7上。川藏香茶菜甲素的相對(duì)立體構(gòu)型由 ROESY實(shí)驗(yàn)確定ROESY譜中H-3與H-19, H-7與H-5(3和H-鄧，H-12與H-鄧 和H-17a, H-14與H-13a和Me-20的相關(guān)信號(hào)(如圖1所示)揭示C-3, C-7, C-12和C-14上的取代基構(gòu)型分別為P, a, a和p。因此，化合物1確定為
ii3(3，7oc-diacetoxy-12a,14(3-dihydroxy-ent-kaur-16- en-15-one，命名為川藏香茶菜曱 素(pharicin A )。
目前還沒(méi)有川藏香茶菜曱素在防治急性淋巴細(xì)胞白血病或?qū)m頸癌方面的研 究報(bào)道。
1. 防治急性淋巴細(xì)月包白血病效果
為了研究川藏香茶菜曱素的防治急性淋巴細(xì)胞白血病效果，本發(fā)明人首先 利用人T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat和人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞系Raji，建立急性淋 巴細(xì)胞白血病模型，用川藏香茶菜甲素對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，對(duì)給藥組與對(duì)照 組進(jìn)行指標(biāo)上的比較，驗(yàn)證川藏香茶菜曱素的防治急性淋巴細(xì)胞白血病效果。
本發(fā)明證實(shí)了川藏香茶菜曱素具有良好的防治急性淋巴細(xì)胞白血病效果。 由于它是天然植物中含有的物質(zhì)，因此安全性高，可作為一種安全可靠的防治 急性淋巴細(xì)胞白血病活性物質(zhì)。
此外由于川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)具有防治急性淋巴細(xì)胞白血病效果，其 還可用于預(yù)防、治療和控制與有絲分裂阻滯相關(guān)的疾病，例如但不限于急性 非淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤慢性粒細(xì)胞性白血病
為此，本發(fā)明提供了川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)在制備預(yù)防、控制和治療急 性淋巴細(xì)胞白血病的藥物組合物、食物組合物、保健品組合物和/或膳食添加 劑中的用途。下文將對(duì)這些組合物進(jìn)行詳細(xì)描述。
此外，在本發(fā)明中還可利用川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)進(jìn)行非治療目的的防 治急性淋巴細(xì)胞白血病。
2. 防治宮頸癌的效果
為了研究川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)防治宮頸癌的效果，發(fā)明人對(duì)施用川藏 香茶菜甲素后的HeLa (宮頸癌)細(xì)胞進(jìn)行了研究。
本發(fā)明證實(shí)了川藏香茶菜曱素可以有效防治宮頸癌。由于它是天然植物中 含有的物質(zhì)，因此安全性高，可作為一種安全可靠的防治宮頸癌的活性物質(zhì)。
此外由于川藏香茶菜甲素具有防治宮頸癌效果，其還可用于預(yù)防、治療和 控制與有絲分裂阻滯相關(guān)的疾病，例如但不限于頑固性卵巢癌、轉(zhuǎn)移性乳腺 癌、非小細(xì)胞性肺癌、頭頸部腫瘤以^Jf胱癌。
為此，本發(fā)明提供了川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)在制備預(yù)防、控制和治療與
12宮頸癌相關(guān)的疾病或征狀的藥物組合物、食物組合物、保健品組合物和/或膳 食添加劑中的用途。下文將對(duì)這些組合物進(jìn)行詳細(xì)描述。
此外，本發(fā)明的川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)還可用于同時(shí)產(chǎn)生預(yù)防、控制和 治療與宮頸癌和預(yù)防、控制和治療急性淋巴細(xì)胞白血病的雙重效果。
本發(fā)明還提供了 一種組合物，所述的組合物含有有效量的川藏香茶菜甲素 活性物質(zhì)，以及食品學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"或"食品學(xué)上可接受的，，的成分是適用于 人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效 益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明的組合物"包括藥物組合物、食物組合物、保健品 組合物和/或膳食添加劑。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"有效量，，是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可^皮 人和/或動(dòng)物所接受的量。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各 種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性 成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
本發(fā)明的組合物還可作為一種食物或膳食添加劑，直接服用或添加到其它
食品中服用。優(yōu)選的，所述的"食品上學(xué)可接受的載體:，選白填充劑、崩解劑、
潤(rùn)滑劑、助流劑、泡騰劑、矯味劑、包覆材料、膳食制品、賦形劑、或緩/控 釋劑。
在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇.。 另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、
助流劑、泡騰劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些 物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約 為5 ~ 8，爭(zhēng)支佳地，pH約為6-8。
本發(fā)明的組合物中可含有川藏香茶菜甲素、川藏香茶菜甲素的生理學(xué)可接 受的鹽或藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或它們的混合物。
本發(fā)明的組合物中川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)有效成分占組合物總重量的 0.001 ~ 99.9wt% ;優(yōu)選為組合物總重量的1 ~ 95wt% ，較優(yōu)選為5 ~ 90wt% ,更
13優(yōu)選10~80wt%。余量為藥學(xué)上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"單位劑型"是指為了服用方便，將本發(fā)明的組合物制備成 單次服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠嚢劑、緩 釋劑。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其
中川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)的含量為0.01 -2000mg/劑。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)的含量為0.01 ~5.0mg /劑，更優(yōu)選為0.05 ~ 4.0mg /劑，進(jìn)一步優(yōu)選含有0.1 ~ 3.0mg /劑；最優(yōu)選的 含有川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)0.2 2.0mg/劑；在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例 中，川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)的含量為5.0 250mg/劑；更優(yōu)選10 200mg/ 劑，進(jìn)一步優(yōu)選20- 150mg/劑，更優(yōu)選30- 100mg/劑；最優(yōu)選的，含有川 藏香茶菜甲素活性物質(zhì)40 ~ 70mg /劑。在本發(fā)明的另 一個(gè)優(yōu)選例中，川藏香茶 菜曱素活性物質(zhì)的含量為250 ~ 2000mg /劑；更優(yōu)選300 ~ 1500mg /劑，進(jìn)一 步優(yōu)選500 ~ 1200mg /劑，更優(yōu)選750 ~ 1100mg /劑；最優(yōu)選的，含有川藏香 茶菜曱素活性物質(zhì)800 ~ 1000mg /劑。
在本發(fā)明的另 一個(gè)優(yōu)選例中，每天施用1 ~ 6劑本發(fā)明的組合物，優(yōu)選施用 1~3劑；最優(yōu)選的，每天服用的劑量為l劑。
應(yīng)理解，所用川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)的有效劑量可隨待施用或治療的對(duì) 象的嚴(yán)重程度而變化。具體情況根據(jù)對(duì)象的個(gè)體情況(例如對(duì)象體重、年齡、身 體狀況、所需達(dá)到的效果)來(lái)決定，這在熟練醫(yī)師或營(yíng)養(yǎng)師可以判斷的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠嚢、舌 下含片)或液態(tài)(如口服液)或其他合適的形狀。
本發(fā)明的組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑施用，其中包括(但并不限于)口服、肌 注、皮下注射等。優(yōu)選口服施用。組合物形式應(yīng)與施用方式相匹配。本發(fā)明組 合物的施用量，按活性物質(zhì)計(jì)算，通常為每天約0.01 ~ 2000mg / 60kg體重/天， 較佳地約0.05 ~ 1500mg / 60kg體重/天，更優(yōu)選為0.1 ~ 1000mg / 60kg體重/ 天，最優(yōu)選為1 ~ 500mg / 60kg體重/天。
本發(fā)明的組合物可直接使用，也可與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，在用于防治急性淋巴細(xì)胞白血病或預(yù)防、控制、治療與急性淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)的疾病中時(shí)，本發(fā)明的組合物還可與有效
量(如0.0005 ~ 0.1克/ 60千克體重/天；優(yōu)選的，為0.001 ~ 0.05克/ 60千克體 重/天)的選白下組的物質(zhì)聯(lián)合施用苯丙胺及其衍生物，包括(但不限于)紫 杉醇、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松，柔紅霉素、阿糖胞苷、門冬酰胺酶、甲氨喋呤。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，在用于預(yù)防、治療與防治宮頸癌相關(guān)的疾病 中，本發(fā)明組合物還可與有效量(如0.5 ~ 100mg / 60kg體重/天；優(yōu)選的，為1 ~ 50mg/60kg體重/天)的選自下組的物質(zhì)聯(lián)合施用紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、順鉑、 環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、博萊霉素。
當(dāng)兩種或兩種以上的藥物聯(lián)合給藥時(shí)， 一般具有優(yōu)于兩種藥物分別單獨(dú)給 藥的效果。優(yōu)選地，聯(lián)合施用的藥物或其它制劑不干擾本發(fā)明川藏香茶菜曱素 活性物質(zhì)有效成分的治療活性。
本發(fā)明還提供了一種非治療目的的防治急性淋巴細(xì)胞白血病方法，所述方 法包括給予對(duì)象有效量的川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，給予對(duì)象的川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)的 量為0.01 ~ 2000mg / 60kg體重/天，更優(yōu)選為0.1 ~ 1000mg / 60kg體重/天， 最優(yōu)選為1 500mg/60kg體重/天。在一天中，可以將所述的量單次給予或多 次給予。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，給予對(duì)象川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)的 量為6 49.9mg/60kg體重/天；更優(yōu)選的，給予對(duì)象川藏香茶菜曱素活性物 質(zhì)的量為8~45mg/60kg體重/天；進(jìn)一步更優(yōu)選的，給予對(duì)象川藏香茶菜 甲素的量為12 35mg/60kg體重/天；最優(yōu)選的，給予對(duì)象川藏香茶菜甲素 活性物質(zhì)的量為15 30mg/60kg體重/天；比如，每劑可給予對(duì)象川藏香茶 菜曱素活性物質(zhì)的量為20mg / 60kg體重/天、22mg / 60kg體重/天、或24mg /60kg體重/天。在一天中，可以將所述的量單次給予或多次給予。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在所述防治急性淋巴細(xì)胞白血病方法中 還包括給予對(duì)象其它防治急性淋巴細(xì)胞白血病藥物或保健品，例如上文所述的 那些防治急性淋巴細(xì)胞白血病藥物。
本發(fā)明的以川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)為活性成分的預(yù)防、控制或治療與宮 頸癌相關(guān)的疾病和/或與急性'淋巴細(xì)月包白血病相關(guān)的疾病或癥狀的藥物組合物、食物組合物及保健品組合物和/或膳食添加劑具有以下優(yōu)點(diǎn)
1. 川藏香茶菜曱素是一種植物中天然存在的化合物，具有較高的安全性；
2. 川藏香茶菜甲素類的化合物如毛萼乙素、冬凌草甲素在以往的研究中已 應(yīng)用腫瘤、炎癥等方面疾病的防治中，因此容易為市場(chǎng)所接受
本發(fā)明的川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)具有容易吸收、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，更加 適合作為新型藥物、食物、保健品和/或膳食添加劑進(jìn)行開發(fā)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)
明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)
與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。
實(shí)施例1 細(xì)力包處理
人T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat和人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞系Raji均在含有10%熱滅 活胎牛血清(FBS， Gibco BRL， Gaithersburg, ML)、青霉素(IOO IU/ml)和鏈霉素 (100 jxg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich， St Louis， MO)中培養(yǎng)，放置于 37。C,含有5% C02和95。/。空氣的培養(yǎng)箱中。Hela (宮頸癌)細(xì)胞從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生 物品收藏中心(ATCC， Manassas, VA)獲得，并在培養(yǎng)皿或Lab-Tek II載玻片(Fisher Scientific)上用含有10。/。熱滅活胎牛血清的Dulbesso's改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM) 中培養(yǎng)，放置于37。C，含有5%(302和95%空氣的培養(yǎng)箱中。紫杉醇耐受的Jurkat 細(xì)胞每隔一天加入20 nM紫杉醇(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)并維持較長(zhǎng)時(shí)間。 在試驗(yàn)中，細(xì)胞都以2xl05細(xì)胞/毫升起種，并用相應(yīng)濃度的pharicinA、紫杉醇 或喏考達(dá)唑(Sigma-Aldrich,St Louis, MO)處理。pharicinA、紫杉醇和喏考達(dá)峻均 溶于DMSO，其儲(chǔ)存濃度分別為100mM、 5mM和16mM。細(xì)胞活率用臺(tái)盼藍(lán)排 斥測(cè)試法檢測(cè)。形態(tài)觀察通過(guò)將細(xì)胞收集并用細(xì)胞離心涂片器(Shandon, Runcom， UK)甩至載玻片，并用瑞氏姬姆薩染料(BASO Diagnostic Inc., Shanghai, China)染 色，在光學(xué)顯微鏡(Olympus BX-51, Olympus Optical, Japan)下，見察。
實(shí)施例2 流式細(xì)胞術(shù)分析
為了進(jìn)行DNA含量的流式細(xì)胞術(shù)分析，收集106細(xì)胞漂洗，并用75%冷乙醇 -20。C固定過(guò)夜。細(xì)胞用溶于Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)的100 (ig/ml RNase A處理，
16并用25 ing/ml碘化丙啶(PI， Sigma-Aldrich, St Louis, MO)染色，樣品用流式細(xì)胞儀 (FACSCalibur， BD Biosciences, San Jose， CA， USA)使用CellQuest Pro軟件(BD Biosciences)。選取了 IOOOO個(gè)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量分析。
實(shí)施例3免疫共沉淀
不同處理的等量細(xì)胞裂解液都與兔源多克隆抗體Cdc20在4。C孵育過(guò)夜。蛋 白A瓊脂糖小球(SantaCruz,CA)加入2小時(shí)，4。C孵育。正常免疫前兔源免疫^(guò)求蛋 白IgG(SantaCruz，CA)作為陰性對(duì)照。收集免疫沉淀物，用裂解緩沖液漂洗，溶 于2x十二烷基硫酸鈉(SDS)用于蛋白印跡分析。
實(shí)施例4細(xì)胞中微管蛋白二聚體和多聚體準(zhǔn)備
不同化合物和溶劑DMSO處理的2x 106細(xì)胞用于制備微管蛋白二聚體和多聚 體。用5mlPBS漂洗后，細(xì)胞用100pl裂解緩沖液[80mMPipes-KOH、 pH6.8、 1 mM MgC 12、 1 mM EGTA、 0.5% (v/v) Triton X-100和10% (v/v)甘油，含蛋白酶 抑制劑]裂解三分鐘。細(xì)胞裂解液12，000 g離心10分鐘。上清(可溶部分)加入IOO (il2.3%SDS、 125mMTris-HCl、 10。/。(v/v)甘油、1% (v/v) 2-巰基乙醇，并馬上 煮3分鐘。剩下的不可溶的團(tuán)塊含有多聚微管蛋白，將其溶于100W 1.。/。SDS中， 超聲l分鐘使團(tuán)塊消失，煮3分鐘。二聚和多聚的微管蛋白將用于蛋白印跡分析。
實(shí)施例5微管蛋白提取和微管蛋白聚合試驗(yàn)
微管蛋白從兔腦中提取。并用MES緩沖液[100mMMES、 1 mMEGTA和0.5 mM MgCl2， pH 6.9，含l mM GTP (Amresco， Solon, Ohio)]稀釋成3mg/ml。微管 蛋白聚合試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行(Yoon et al.， 2002)。用能夠控溫的Tecan Safire UV-Vis分光光度計(jì)(Tecan, Seestrasse, Switzerland,測(cè)微管蛋白的混濁度，直至 吸光度到達(dá)平臺(tái)期。。
實(shí)施例6免疫熒光染色
收集細(xì)月包并用Wescor Model 7620 Cytopro細(xì)月包離心才幾(Wescor Inc., Ontario, Canada)甩至載玻片，并用4%多聚曱醛固定10分鐘，接著用0.3% Triton X-100透化，然后細(xì)胞用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉，以及用Ot-微管蛋白
(Sigma畫Aldrich, St Louis， MO)、phospho-Histone H3 (Ser10) (Upstate Biotechnology Inc, Lake placid, NY)、 BubRl、 CREST或CENP-E—抗孵育過(guò)夜。接著，細(xì)胞用 合適的Texas Red (Sigma-Aldrich， St Louis, MO)、 Rhodamine-Red-X或FITC (Jackson Immuno Research)結(jié)合的二抗染色1小時(shí)。纟田胞DNA最后用 4，，6-diamidino-2-phenylindole (DAPI， Molecular Probe, Eugene, OR)染色。熒光信 號(hào)用帶有Zeissx60物鏡的Bio-Rad MRC-1024激光掃描共聚焦顯微鏡或熒光顯微 鏡(Olympus， BX-51, Tokyo, Japan)觀察。
實(shí)施例7 蛋白印跡分析
Pharicin A(2 ^M,除非特別^是出)、喏考達(dá)唑(l ^M)或紫杉醇(10 nM)處理細(xì) 胞不同的時(shí)間點(diǎn)。有絲分裂(變圓)的HeLa細(xì)胞通過(guò)搖晃收集起來(lái)。蛋白提取 物等量上樣至6-12。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移印跡至穩(wěn)定素-NC 膜上(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)。用5%脫脂牛奶封閉膜滯后， 4。C孵育鼠源一抗P-微管蛋白(Sigma陽(yáng)Aldrich)、 cyclinBl、 Cdcl6、 Cdc20 (Abcam， UK)、 Cdc27 (Santa Cruz， CA)、 MPM2 (Upstate Biotechnology Inc, Lake placid, NY) 或者兔源一才元Cdc2 (Santa Cruz, CA)、 phospho隱Cdc2 (Tyrl5)、 phospho畫Cdc2 (Thrl61) (Cell Signaling, Beverly, MA) 、 Mad2 (Bethyl Laboratories Inc, Montgomery, TX)和BubRl 。接著孵育辣才艮過(guò)氧化物酶連接的二抗(Cell Signaling, Beverly, MA)。特異的信號(hào)用化學(xué)發(fā)光(Cell Signaling)檢測(cè)。(3-actin檢測(cè)(Merck, Darmstadt, Germany)用于衡量上才羊量是否相同。
實(shí)施例I PharicinA通過(guò)引起有絲分裂阻滯抑制Jurkat和Raji細(xì)胞增殖
Pharicin A是通過(guò)一系列色鐠層析分離技術(shù)從川藏香茶菜葉中分離得到。結(jié) 構(gòu)分析請(qǐng)見表l以及圖1。為了明確pharicin A對(duì)惡性淋巴細(xì)胞Jurkat和Raji的作用， 兩種細(xì)胞用不同濃度的該化合物處理12、 24和48小時(shí)，計(jì)算每種處理的活細(xì)胞 數(shù)目，并算出其活率。Pharicin A以劑量依賴形式抑制Jurkat和Raji細(xì)胞的增殖(圖 2)。當(dāng)2 pharicin A處理Jurkat和Raji細(xì)胞，其活率影響不大但生長(zhǎng)完全受到抑 制。當(dāng)用2^Mpharicin A處理Jurkat和Raji細(xì)胞48小時(shí)，兩者的活率顯著下降。顯微鏡檢測(cè)顯示用低濃度pharicin A ( 1, 2， and 4 |iM)處理Jurkat和Raji細(xì)胞時(shí)，染 色體發(fā)生濃縮，且核膜被破壞(圖3a)，這說(shuō)明這一化合物可能引起了有絲分裂阻 滯。
組蛋白H3絲氨酸10位磷酸化(H3S10)是一種可靠的有絲分裂和減數(shù)分裂的 標(biāo)志，有絲分裂的完成有賴于組蛋白H3的去磷酸化。因此，本發(fā)明人用H3S10 抗體對(duì)pharicin A處理的細(xì)胞進(jìn)行染色。焚光顯微鏡顯示pharicin A處理的Jurkat 和Raji細(xì)胞H3S10染色呈高度陽(yáng)性，這一結(jié)果與有絲分裂誘導(dǎo)劑紫杉醇和諾考達(dá) 唑處理的結(jié)果類似(圖3b)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析顯示2 pharicin A處理顯著增加 處于G2/M期細(xì)胞的比例，并伴隨著G,和S期細(xì)胞的減少，而且pharicin A引起的 G2/M期阻滯呈時(shí)間依賴(圖5a)。更高濃度的pharicin A(4 jtiM)也能？ 1起類似的細(xì)胞 周期變化。這些結(jié)果說(shuō)明pharicin A能夠引起淋巴細(xì)胞白血病Jurkat和Raji細(xì)胞發(fā) 生有絲分裂阻滯。
為了進(jìn)一步確認(rèn)pharicin A引起有絲分裂阻滯的作用，用2 pharicin A處 理Jurkat細(xì)胞，檢測(cè)處理后不同時(shí)相的cyclin B和Cdkl蛋白的表達(dá)，這是因?yàn)?Cdkl/cyclin B復(fù)合物的活化控制著細(xì)胞是否進(jìn)入或離開有絲分裂期。與未處理的 細(xì)胞相比，cyclinB的表達(dá)增加(圖5b),然而15位酪氨酸磷酸化Cdkl (抑制Cdkl 活性)減少，而161位蘇氨酸磷酸化的Cdkl (活化Cdkl活性)增加。這些變化在 化合物處理后3-6小時(shí)開始顯現(xiàn)，在處理12小時(shí)后更加明顯，這說(shuō)明pharicinA處 理活化了Cdkl。此外，pharicin A (2 inM)也顯著增加MPM-2，后者代表磷酸化表 位的有絲分裂蛋白水平，它是由于Cdkl/cyclinB或下游調(diào)節(jié)物引起的磷酸化而造 成的。如其所料，紫杉醇和諾考達(dá)唑也顯著增加Cdkl活性和MPM-2水平(圖5b)。
實(shí)施例II Pharicin A活化紡錘體檢查點(diǎn)
4艮多化合物通過(guò)影響^i:管完整性而導(dǎo)致有絲分裂阻滯。為了確定pharicin A 是否對(duì)微管結(jié)構(gòu)也有影響，Jurkat和Raji細(xì)胞用該化合物處理了12小時(shí)。熒光顯 微鏡的結(jié)果顯示，紫杉醇造成多才及化紡錘體形成，而諾考達(dá)唑則完全阻礙了有 絲分裂紡錘體的形成(圖4)。 pharicin A引起的有絲分裂細(xì)胞保持了幾乎正常的紡 錘體微管(圖4),這說(shuō)明在影響微管完整性方面該化合物與紫杉醇和諾考達(dá)唑不 同。
19接下來(lái)，我們檢測(cè)了pharidn A對(duì)于紡錘體片全查點(diǎn)蛋白及其相互作用蛋白的 影響。Pharicin A以及紫杉醇和諾考達(dá)唑都能夠增加Cdc20和磷酸化Cdc27的水平 (圖7a)。另一方面，pharicin A并不能改變Mad2的水平，后者是紡錘體4企查點(diǎn)主 要的組成部分。免疫沉淀檢測(cè)顯示較之對(duì)照細(xì)胞，pharicin A處理的細(xì)胞中有更 多的Cdc20被拉下(圖7b)，這與該化合物引起有絲分裂阻滯相一致。此外，pharicin A處理的細(xì)胞中也有更多磷酸化的Cdc27和BubRl與Cdc20結(jié)合而被沉淀下來(lái)。然 而，在Cdc20免疫沉淀物中有Mad2出現(xiàn)，而在對(duì)照IgG免疫沉淀物中卻沒(méi)有檢測(cè) 到，這說(shuō)明pharicin A處理引起Cdc20與紡錘體檢查點(diǎn)成份物理上的相互作用。
實(shí)施例III Pharicin A干擾Hela細(xì)胞的紡錘體檢查點(diǎn)活性和染色體分離
為了檢測(cè)是否除了白血病細(xì)胞之外其他肺瘤細(xì)胞也對(duì)pharicin A敏感，HeLa 細(xì)胞用該化合物以及DMSO處理了 24小時(shí)。Pharicin A(2 pM)處理后，有相當(dāng)部 分的Hela細(xì)胞變圓，這一形態(tài)和紫杉醇或諾考達(dá)唑處理的形態(tài)一致(圖9a),說(shuō)明 pharicin A也能可1起貼壁細(xì)胞發(fā)生有絲分裂阻滯。高濃度pharicin A處理24小時(shí)還 能引起凋亡，并伴隨著明顯的PARP-1剪切片段的出現(xiàn)(圖6)。為了確定pharicinA 能夠引起有絲分裂阻滯，pharicin A以及紫杉醇和諾考達(dá)唑處理Hda細(xì)胞24小時(shí)， 并用H3S10和a-微管蛋白抗體染色。與紫杉醇和諾考達(dá)唑處理的結(jié)果類似， pharicinA處理顯著增加H3S10磷酸化陽(yáng)性比例(圖7b),說(shuō)明該化合物能夠引起有 絲分裂阻滯。
更詳細(xì)的熒光顯微鏡檢測(cè)顯示，大部^pharicin A引起的有絲分裂組織細(xì)胞 中出現(xiàn)染色體形態(tài)異常，包括在紡錘體極區(qū)域出現(xiàn)的遲滯或錯(cuò)誤分離的染色體 (圖9a和圖9b)。這種染色體形態(tài)在紫杉醇和諾考達(dá)唑處理時(shí)均未出現(xiàn)。為了檢 查pharicin A是否也干擾紡錘體檢查點(diǎn)，Hela細(xì)胞用該化合物處理24小時(shí)。與紫 杉醇和諾考達(dá)唑處理的標(biāo)本一樣，從中收取變圓細(xì)胞的裂解液來(lái)檢測(cè)磷酸化狀 態(tài)的BubRl、 Cdc27和Cdc16。我們發(fā)現(xiàn)紫杉醇和諾考達(dá)哇使得非磷酸化的BubRl 和Cdc27完全變成磷酸化BubRl和磷酸化Cdc27，而pharicin A引起的磷酸化只是 其中的一部分(圖10c),這顯示pharicin A引起的有絲分裂阻滯具有其特殊的機(jī)制。 由于pharicin A處理的細(xì)胞具有滯后/錯(cuò)分的染色體，我們接下來(lái)檢測(cè)了 pharicin A 處理的細(xì)胞中檢查點(diǎn)蛋白的亞細(xì)胞定位。熒光顯微鏡顯示在赤道板的著絲點(diǎn)上
20的染色體中檢測(cè)到少量的BubRl,而在聚集在紡錘體極點(diǎn)區(qū)域的滯后/錯(cuò)分染色 體上有較高水平的BubRl(圖10d)。 CENP-E和Sgol是兩個(gè)檢查點(diǎn)組成部分，它們 在錯(cuò)分的染色體著絲粒的堆積比赤道板上的染色體要多(圖8)。另一方面，著絲 點(diǎn)抗原CREST也平均分布在pharicinA或紫杉醇處理細(xì)胞的著絲點(diǎn)上(圖10d)。因 此，發(fā)明人研究顯示pharicinA干擾紡錘體纟全查點(diǎn)具有其特殊的方式。
實(shí)施例IV Pharicin A增加微管聚合
由于紡錘體檢查點(diǎn)顯著受到pharicin A影響，我們接下來(lái)通過(guò)體外微管蛋白 聚合試驗(yàn)4全測(cè)了該化合物對(duì)^f效管蛋白動(dòng)力學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)20 nM紫杉醇能夠顯著 增加微管蛋白聚合，而5 ^M諾考達(dá)唑明顯使其解聚(圖11a)。2、4和8 inM的Pharicin A也增加微管蛋白聚合，這說(shuō)明在體外pharicinA能夠穩(wěn)定微管。與此一致的是， 較之DMSO或諾考達(dá)唑處理的細(xì)胞，相當(dāng)數(shù)量從pharicin A處理的細(xì)胞中提取出 來(lái)的P-微管蛋白不可溶，盡管這個(gè)數(shù)量少于30% (圖llb)。然而，紫杉醇處理的 細(xì)胞中提取出來(lái)的P-微管蛋白大部分不可溶(>60%)。
實(shí)施例V Pharicin A引起紫杉醇耐受的細(xì)胞發(fā)生有絲分裂阻滯
臨床上紫杉醇治療的主要問(wèn)題之一是藥物耐受。由于pharicin A能夠引起有 絲分裂阻滯并部分穩(wěn)定微管，我們想知道該化合物是否對(duì)于紫杉醇耐受的細(xì)胞 仍然有效。我們建立了紫杉醇耐受的細(xì)胞，并持續(xù)加入紫杉醇。與母細(xì)胞不同 的是，加入20nM紫杉醇后，這些紫杉醇耐受的細(xì)胞不能發(fā)生有絲分裂阻滯(圖 1 lc)。然而，在用2 pM pharicin A處理24小時(shí)后，形態(tài)和DNA含量顯示這些 紫杉醇耐受的細(xì)胞發(fā)生了有絲分裂阻滯(圖llc)。這些研究再次說(shuō)明pharicin A 的作用^L制與紫杉醇不同。
盡管很多二萜類化合物^^現(xiàn)具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，但其中的機(jī)制仍不 清楚。本發(fā)明中我們發(fā)現(xiàn)pharicin A這一新型對(duì)映貝殼杉烯化合物能夠引起急性 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞和實(shí)體腫瘤細(xì)胞發(fā)生有絲分裂阻滯。我們的研究顯示 pharicin A能夠有效引起有絲分裂阻滯和有絲分裂突變。Pharicin A引起的有絲分 裂阻滯伴隨著微管蛋白動(dòng)力的下調(diào)，染色體的錯(cuò)誤分離，以及紡錘體檢查點(diǎn)的 活化。然而，pharicinA具有其獨(dú)特的作用方式。(l)與諾考達(dá)唑不同，pharicinA不能使微管解聚。(2)與紫杉醇類似，pharicinA穩(wěn)定微管，然而其穩(wěn)定纟敖管的 能力比紫杉醇弱。(3 )在體內(nèi)，pharicin A不能引起坊錘體微管束數(shù)量上的明顯 變化。(4)大部分用pharicinA處理的細(xì)胞都發(fā)生了滯后/錯(cuò)分的染色體，這與某 些紡錘體檢查點(diǎn)組分的部分活化相關(guān)。(5)更重要的是，pharicin A能夠引起紫 杉醇耐藥的細(xì)胞發(fā)生有絲分裂阻滯。
與紫杉醇和諾考達(dá)唑類似，pharicinA活化Cdkl/cyclinB，后者是進(jìn)入有絲 分裂起的調(diào)節(jié)者。MPM2時(shí)間依賴的累積和高水平的H3S10磷酸化i正明了 pharicinA造成了有絲分裂期的阻滯。在有絲分裂期，后期的進(jìn)入和有絲分裂期 的結(jié)束都首先受到紡錘體檢查點(diǎn)的調(diào)控以及后期促進(jìn)復(fù)合物(APC/C)活化控制。 APC/C受到紡錘體活化的控制與其組分Cdcl6和Cdc27的磷酸化相關(guān)。Cdc20 能夠結(jié)合并活化APC/C，使得securin發(fā)生泛素化降解從而使separase能夠分離 聚合在一起的姐妹染色單體。紡錘體檢查點(diǎn)蛋白包括BubRl和Mad2，它們通過(guò) 直接結(jié)合到Cdc20而抑制APC/C活性。Pharicin A處理引起Cdc20與BubRl 或Mad2結(jié)合增力口(圖7b),這說(shuō)明pharicin A處理抑制了 APC/C。
更詳細(xì)的紡錘體檢查點(diǎn)狀態(tài)檢測(cè)顯示pharicin A引起的反應(yīng)并非經(jīng)典的已 知有絲分裂毒性物質(zhì)的特征。尤其是在pharicin A處理的Hela細(xì)胞中，搖晃脫 落的細(xì)胞中包含了磷酸化和非磷酸化的BubRl，這"i兌明pharicin A停止細(xì)胞周期 進(jìn)程在有絲分裂期，其機(jī)制與紫杉醇和諾考達(dá)唑不同。與此一致，pharicinA處 理的Hela細(xì)胞中只有一小部分Cdc27磷酸化。此外，pharicin A引起有絲分裂 阻滯的細(xì)胞的染色體形態(tài)與紫杉醇或諾考達(dá)唑處理的細(xì)胞不同。除了聚集在赤 道板上的染色體，還有一些聚集在紡錘體極區(qū)域。有趣的是，紡錘體極處的染 色體其紡錘體檢查點(diǎn)蛋白BubRl、 CENP-E和Sgol呈高度陽(yáng)性，這與赤道板處 染色體上這些蛋白4氐表達(dá)完全相反(圖10a、圖10b、圖10c、圖10d和圖8)。
雖然目前還不清楚pharicin A的分子靶標(biāo)是什么。鑒于pharicin A能夠影響 體內(nèi)體外微管的穩(wěn)定性，微管也許是一個(gè)候選把標(biāo)。根據(jù)調(diào)節(jié)微管動(dòng)力的能力 不同，目前抗微管抗癌藥物可以主要分為兩大類，包括紫杉烷類和長(zhǎng)春花堿類。 紫杉烷類通過(guò)抑制分解而穩(wěn)定微管，而長(zhǎng)春花堿類結(jié)合到微管蛋白上秋水仙素 位點(diǎn)，通過(guò)抑制微管蛋白異二聚體形成而使微管去穩(wěn)定。在體內(nèi)和體外，pharicin A穩(wěn)定微管方面與紫杉醇類似，但效果不如后者。另一種可能是，pharicin A可
22能通過(guò)調(diào)節(jié)其他有絲分裂調(diào)節(jié)因子而間接影響微管動(dòng)力。曾有研究顯示功能性
破壞CENP-E這一微管動(dòng)力蛋白能夠增加染色體單向異常聚集到紡錘體極的發(fā) 生頻率。此外，通過(guò)RNAi干擾Sgol的功能也能引起顯著的有絲分裂阻滯，并 伴隨著染色質(zhì)不成熟地分離及染色體聚集在紡錘體極處。
總之，我們描述了一種新型對(duì)映貝殼杉烯化合物能夠引起有絲分裂阻滯， 并停留在某一個(gè)不同于其他已知微管活性藥物引起有絲分裂的時(shí)期。據(jù)我們所 知，這是第一次公開對(duì)映貝殼杉烯二萜化合物具有這種千擾有絲分裂進(jìn)程的能 力。藥物耐受也是紫杉醇化療中一個(gè)主要的問(wèn)題，pharicinA能夠引起紫杉醇耐 受細(xì)胞發(fā)生有絲分裂阻滯顯示了其不同的作用機(jī)制，這也為解決紫杉醇耐受的 惡性腫瘤提供了 一個(gè)新的途徑。發(fā)明人的研究說(shuō)明繼續(xù)研究該化合物或其類似 結(jié)構(gòu)衍生物對(duì)開發(fā)新型抗癌藥物的重要性。
權(quán)利要求
1、一種川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)的用途，所述川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)包括川藏香茶菜甲素、其生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的鹽、其水合物或它們的混合物，其特征在于，用于制備預(yù)防、控制或治療與急性淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)的或?qū)m頸癌相關(guān)的疾病或征狀的組合物。
2、 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述組合物是藥物組合物、保 健品組合物、食物組合物或膳食添加劑。
3、 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述川藏香茶菜甲素活性物質(zhì) 占所述組合物總重量的0.001 ~ 99. 9wt % 。
4、 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述組合物為單位劑型或多劑 型，且其中川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)的含量為0.01 ~ 2000mg /劑。
5、 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，由于川藏香茶菜甲素活性物質(zhì) 具有防治急性淋巴細(xì)胞白血病效果，其還可用于預(yù)防、治療和控制與有絲分裂 阻滯相關(guān)的疾病，例如但不限于急性非淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨 髓瘤慢性粒細(xì)胞性白血?。挥捎诖ú叵悴璨思姿鼐哂蟹乐螌m頸癌效果，其還可用于預(yù)防、治療和控制 與有絲分裂阻滯相關(guān)的疾病，例如但不限于頑固性卵巢癌、轉(zhuǎn)移性乳l^癌、 非小細(xì)胞性肺癌、頭頸部腫瘤以及膀胱癌。
6、 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述組合物還包括用于防治急 性淋巴細(xì)胞白血病的其它物質(zhì)，所述的其它物質(zhì)選自下組紫杉醇、長(zhǎng)春新石威、 強(qiáng)的松，柔紅霉素、阿糖胞苷、門冬酰胺酶、曱氨喋呤；所述組合物還包括用于防治宮頸癌的其它物質(zhì)，所述的其它物質(zhì)選自下組 紫杉醇、長(zhǎng)春新石威、順鉑、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧咬、阿霉素、博萊霉素。
7、 一種使急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞阻滯和凋亡的方法，所迷方法包括給予 急性淋巴細(xì)胞白血病的對(duì)象有效量的川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)或含有川藏香茶 菜曱素活性物質(zhì)的組合物，其中所述川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)包括川藏香茶 菜曱素、其生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的鹽、其水合物或它們的混合物。
8、 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述川藏香茶菜曱素活性物質(zhì) 占所述組合物總重量的0.001 ~99.9wt% 。
9、 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，給予對(duì)象的川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)的劑量為0.01 ~ 2000mg / 60kg體重/天。
10、 一種《且合物，所述纟且合物含有(1) 有效量的川藏香茶菜曱素活性物質(zhì)，其中所述川藏香茶菜曱素活性物質(zhì) 包括川藏香茶菜甲素、其生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的鹽、其水合物或它們的 混合物；(2) 選自下組的一種或多種物質(zhì)紫杉醇、紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松，柔 紅霉素、阿糖胞苷、門冬酰胺酶、曱氨喋呤、順鉑、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧咬、阿 霉素、博萊霉素；和(3) 藥學(xué)上可接受的載體或食品學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了川藏香茶菜甲素在防治急性淋巴細(xì)胞白血病及宮頸癌中的應(yīng)用，川藏香茶菜甲素的主要用途在于川藏香茶菜甲素、其生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的鹽、其水合物或它們的混合物用于制備預(yù)防、控制或治療與急性淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)的或?qū)m頸癌相關(guān)的疾病或征狀的組合物。本發(fā)明還提供了一種包含川藏香茶菜甲素活性物質(zhì)和其它具有預(yù)防、控制或治療與白血病相關(guān)的疾病和/或與腫瘤相關(guān)的征狀或疾病物質(zhì)的組合物。本發(fā)明的組合物具有安全性高；容易吸收、穩(wěn)定性好；易為市場(chǎng)所接受等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07C69/21GK101497568SQ200910045118
公開日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日
發(fā)明者吳英理, 孫漢董, 徐含章, 肖偉烈, 勇 趙, 陳國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院;中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所