專利名稱：抗禽流感病毒免疫球蛋白、制備方法和其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫球蛋白、及其制備方法和制劑形式，更具體地說(shuō)，涉及一種抗禽流感病毒免疫球蛋白、其制備方法及其制劑形式。
背景技術(shù)：
從1997年至今，亞洲多個(gè)國(guó)家和地區(qū)暴發(fā)了高致病性禽流感，而且這場(chǎng)疫情至今還沒(méi)有得到控制。禽流感在亞洲國(guó)家和地區(qū)的擴(kuò)散、蔓延給人類生命帶來(lái)威脅，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。與SARS相比，禽流感所帶來(lái)的潛在危害更令人擔(dān)憂。如果不采取有效措施，禽流感很有可能出現(xiàn)全球性大流行。2003年底以來(lái)，泰國(guó)、越南、中國(guó)等國(guó)家均報(bào)告發(fā)生禽流感疫情。截至目前，全球共報(bào)告43例人感染禽流感病例，其中33人死亡，死亡率極高。
禽流感的病原體是甲型流感病毒的H5N1、H7N7、H9N2亞型病毒。1997年香港的禽流感與目前亞洲10個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生的禽流感，病原體都相同。H5N1型禽流感病毒是人與動(dòng)物共患的流感病毒，容易引起世界性大流行。由于流感病毒多變異，因而導(dǎo)致甲型流感反復(fù)發(fā)生，難以徹底根除。禽流感病毒基因組由8個(gè)負(fù)鏈的單鏈RNA片段組成。這8個(gè)片段編碼10個(gè)病毒蛋白，其中，8個(gè)是病毒粒子的組成成分--HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA，另兩個(gè)是分子質(zhì)量最小的RNA片段，編碼兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白--NS1和NS2。NS1與胞漿包含體有關(guān)，但對(duì)NS1和NS2的功能目前尚不清楚。禽流感病毒一般為球形，直徑為80～120納米，但也常有同樣直徑的絲狀形態(tài)，長(zhǎng)短不一。病毒表面有10～12納米的密集釘狀物或纖突覆蓋，病毒囊膜內(nèi)有螺旋形核衣殼。兩種不同形狀的表面釘狀物是HA(棒狀三聚體)和NA(蘑菇形四聚體)。
免疫球蛋白制劑是最常見(jiàn)的免疫血清，免疫球蛋白制劑有破傷風(fēng)抗毒素、白喉抗毒素、氣性壞疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗炭疽血清、抗愛(ài)博拉病毒血清等。目前，市場(chǎng)上常見(jiàn)的球蛋白制劑有抗狂犬病血清、抗蛇血清等?？箍袢⊙逵煽袢〔《久庖唏R，經(jīng)胃蛋白酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑。用于配合抗狂犬病疫苗對(duì)被瘋動(dòng)物嚴(yán)重咬傷如頭、臉、頸部或多部位咬傷者進(jìn)行預(yù)防注射，被瘋動(dòng)物咬傷后注射越早越好，咬后48小時(shí)之內(nèi)注射，可減少發(fā)病率?？股叨狙逵蒙叨久庖唏R后的馬血漿精制而成，供治療毒蛇咬傷者之用。
目前，人們主要用禽流感疫苗來(lái)預(yù)防動(dòng)物的禽流感，但疫苗的效果并不理想，至今仍未有用于禽流感治療的特效藥物。也有研究者制得抗禽流感病毒的卵黃抗體用于禽類的禽流感病毒感染治療和預(yù)防，例如，專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N02113744.7的專利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種抗禽類病毒性疫病的復(fù)合卵黃抗體及其制備方法。但未有能夠用于人類的治療和預(yù)防的禽流感藥物。
為了更快、更有效地控制禽流感疫情的發(fā)生，有必要對(duì)能夠?qū)η萘鞲衅鸬接行У仡A(yù)防和治療作用的藥物進(jìn)行更深入地研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種抗禽流感病毒的免疫球蛋白，可以用于人或動(dòng)物的禽流感預(yù)防、診斷和治療，填補(bǔ)了目前未有防治人類禽流感的有效藥物的空白。
本發(fā)明的抗禽流感病毒免疫球蛋白，是抗禽流感病毒免疫球蛋白G(IgG)和/或抗禽流感病毒免疫球蛋白G的有效片段[(Fab)2片段]；這種抗禽流感病毒免疫球蛋白是從動(dòng)物的血清和/或血漿中提取出來(lái)的，上述的動(dòng)物是經(jīng)滅活的禽流感病毒與免疫佐劑的混合物和/或禽流感疫苗免疫接種的動(dòng)物。
從動(dòng)物的血清和/或血漿中分離抗禽流感病毒免疫球蛋白可采用現(xiàn)有的免疫球蛋白分離方法。本發(fā)明的抗禽流感病毒免疫球蛋白G可以采用以下方法來(lái)制備(1)用滅活的禽流感病毒與免疫佐劑的混合物和/或禽流感疫苗對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種；(2)采集經(jīng)步驟(1)免疫接種的動(dòng)物的血液；(3)從步驟(2)得到的動(dòng)物血液中分離出血清和/或血漿；(4)采用硫酸銨沉淀或辛酸沉淀法沉淀步驟(3)得到的血清和/或血漿中的抗禽流感病毒免疫球蛋白G；(5)通過(guò)柱層析法，對(duì)步驟(4)得到的抗禽流感病毒免疫球蛋白G進(jìn)行提純。
而本發(fā)明抗禽流感病毒免疫球蛋白G的(Fab)2片段既可以采用現(xiàn)有免疫球蛋白制備方法制備，也可以采用本發(fā)明的第二個(gè)發(fā)明目的中提供的制備方法來(lái)制備。采用現(xiàn)有方法可以按以下步驟操作(1)滅活的禽流感病毒與免疫佐劑的混合物和/或禽流感疫苗對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種；(2)采集經(jīng)步驟(1)免疫接種的動(dòng)物的血液；(3)從步驟(2)得到的動(dòng)物血液中分離出血清和/或血漿；(4)采用硫酸銨沉淀或辛酸沉淀法沉淀步驟(3)得到的血清和/或血漿中的抗禽流感病毒免疫球蛋白G；(5)用胃蛋白酶直接對(duì)步驟(3)得到的血清和/或血漿中的免疫球蛋白G進(jìn)行消化；(6)采用柱層析，對(duì)步驟(5)得到的物質(zhì)進(jìn)行提純，得到抗禽流感病毒免疫球蛋白G的(Fab)2片段。
本發(fā)明采用的免疫動(dòng)物可以是小鼠、大鼠、兔、豬、牛、猴、馬等，優(yōu)選為馬、羊、?；蜇i，更優(yōu)選為馬。
本發(fā)明的抗禽流感病毒免疫球蛋白的中和抗體效價(jià)一般在1∶1024-1∶10240的范圍，可以達(dá)到1∶2048-1∶10240。這里所說(shuō)的中和抗體效價(jià)，是對(duì)免疫球蛋白進(jìn)行濃縮前測(cè)得的，濃縮后效價(jià)還可以進(jìn)一步提高。此外，所采用的免疫佐劑的種類和使用次數(shù)都會(huì)對(duì)效價(jià)產(chǎn)生影響，免疫佐劑使用次數(shù)越多，效價(jià)一般會(huì)越高。本發(fā)明采用的免疫佐劑可以是氟氏佐劑(Freund’s adjuvant)、氫氧化鋁、CpG等，其中，氟氏佐劑包括氟氏完全佐劑(FCA)和氟氏不完全佐劑(FIA)。優(yōu)選地，采用氟氏佐劑。更優(yōu)選地，對(duì)動(dòng)物的第一次免疫采用FCA+滅活禽流感疫苗，第二次以上免疫采用FIA+滅活禽流感疫苗。
現(xiàn)有禽流感病毒主要是H5型、H7型、H9型的，更具體地說(shuō)，是H5N1、H7N7和H9N2型禽流感病毒。本發(fā)明既可以采用H5型、H7型、H9型禽流感病毒或其組合與免疫佐劑的混合物來(lái)免疫動(dòng)物，以獲得高免血清；也可以直接采用含有上述病毒或其組合的疫苗來(lái)免疫動(dòng)物。因此，本發(fā)明抗禽流感病毒免疫球蛋白能抗H5型、H7型、H9型一種禽流感病毒或一種以上型號(hào)的禽流感病毒的組合。當(dāng)然，也可以是其他病毒型的禽流感病毒或其組合。
本發(fā)明的抗禽流感病毒免疫球蛋白可用于人或動(dòng)物的禽流感預(yù)防和治療以及診斷，其中，免疫球蛋白G可同時(shí)用于禽流感的診斷和防治，免疫球蛋白G的(Fab)2片段主要用于禽流感病毒的防治。雖然本發(fā)明的抗禽流感病毒免疫球蛋白源自于動(dòng)物的血清或血漿，沒(méi)有經(jīng)過(guò)人源化，存在著可能使人體產(chǎn)生致敏反應(yīng)的不足，但它與直接使用高免血清相比，已大大地降低了致敏反應(yīng)的發(fā)生率。本發(fā)明的免疫球蛋白G(Fab)2片段比本發(fā)明的免疫球蛋白G更不易引起致敏反應(yīng)。本發(fā)明的抗禽流感病毒免疫球蛋白特異性強(qiáng)，對(duì)提高人體抗禽流感病毒感染能力的效果明顯，與其他病毒或微生物無(wú)交叉反應(yīng)，從而填補(bǔ)了人類禽流感治療無(wú)有效和特效藥物的空白。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備抗禽流感免疫球蛋白方法。該方法所制得的抗禽流感免疫球蛋白是抗禽流感病毒免疫球蛋白G的(Fab)2片段，所制得的(Fab)2片段在產(chǎn)率和純度方面都要高于采用常規(guī)的方法，如硫酸銨鹽析和柱層析法制得的(Fab)2片段。
本發(fā)明的制備方法包括以下步驟(1)用滅活的禽流感病毒與免疫佐劑的混合物和/或禽流感疫苗對(duì)動(dòng)物體進(jìn)行免疫接種；(2)采集經(jīng)步驟(1)免疫接種的動(dòng)物的血液；(3)從步驟(2)得到的動(dòng)物血液中分離出血清和/或血漿；(4)用胃蛋白酶直接對(duì)步驟(3)得到的血清和/或血漿中的免疫球蛋白G進(jìn)行消化；(5)采用切向流超濾系統(tǒng)，除去步驟(4)得到的混合物中的低分子量的消化產(chǎn)物；(6)采用柱層析，對(duì)步驟(5)得到的物質(zhì)進(jìn)行提純；(7)采用切向流超濾系統(tǒng)，對(duì)步驟(6)得到的物質(zhì)進(jìn)行濃縮，制得免疫球蛋白G的有效片段。
在進(jìn)行上述步驟(1)操作以前，還可以包括對(duì)禽流感病毒進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。
步驟(1)既可以采用未滅活的禽流感病毒，先將其滅活，然后將滅活的病毒與免疫佐劑混合，用該混合物來(lái)作免疫抗原，也可以直接使用禽流感疫苗作為抗原，給動(dòng)物進(jìn)行注射。將滅活后的禽流感病毒與免疫佐劑混合的目的是加強(qiáng)免疫效果以及獲得高含量的抗體。
禽流感病毒的滅活方法主要有甲醛滅活法、β-丙內(nèi)脂滅活法和溫度滅活法。本發(fā)明的禽流感病毒可以采用上述這些方法滅活。甲醛滅活法的優(yōu)點(diǎn)是它能更有效地滅活病毒，且在滅活前后，病毒的抗原性不受影響。甲醛滅活法的關(guān)鍵是控制甲醛的濃度和滅活時(shí)間，溫度滅活法的關(guān)鍵是控制滅活溫度。如果選用甲醛滅活法，則甲醛的濃度可以控制在0.1％-1.00％的范圍內(nèi)，優(yōu)選為0.15％-0.60％，滅活的時(shí)間為幾小時(shí)至幾十小時(shí)。優(yōu)選地，采用0.25％的甲醛滅活24小時(shí)以上，或者0.4％的甲醛滅活2小時(shí)以上。雖然這兩種滅活條件都可以使禽流感病毒喪失感染性，滅活率為100％，且病毒的滅活前后抗原性不受影響，但是，由于采用0.2％的甲醛作用24小時(shí)后，還能檢測(cè)出高拷貝的核酸，因此更優(yōu)選地，采用0.4％的甲醛滅活2小時(shí)以上。如果選用溫度滅活，則滅活溫度優(yōu)選在46℃-66℃范圍內(nèi)，滅活時(shí)間一般控制在10-180分鐘范圍內(nèi)，可選擇在水浴中進(jìn)行滅活。此外，病毒在滅活后，有必要對(duì)禽流感病毒進(jìn)行檢測(cè)，在確保病毒已喪失致病能力后，才能用于免疫動(dòng)物。
在步驟(1)中所采用的免疫佐劑可以是氟氏佐劑(Freund’sadjuvant)、氫氧化鋁、CpG等，其中，氟氏佐劑包括氟氏完全佐劑(FCA)和氟氏不完全佐劑(FIA)。優(yōu)選地，采用氟氏佐劑。更優(yōu)選地，對(duì)動(dòng)物的第一次免疫采用FCA+滅活禽流感疫苗，第二次或以后幾次的免疫采用FIA+滅活禽流感疫苗。所采用的免疫動(dòng)物可以是小鼠、大鼠、兔、豬、牛、猴、馬等，優(yōu)選為馬、羊、牛或豬，更優(yōu)選為馬。
在步驟(3)中，從血液中分離血清和/或血漿的方法可以是自然分層法、離心法等。
步驟(4)采用了酶消化法直接對(duì)免疫血清和/或血漿中IgG進(jìn)行消化，沒(méi)有采用像提取(Fab)2片段的常規(guī)方法那樣，先用硫酸銨鹽析法或辛酸沉淀法從血清中提取IgG，再用酶對(duì)IgG進(jìn)行消化。所用的酶通常是胃蛋白酶。
步驟(5)和(6)操作的目的是對(duì)消化產(chǎn)物——(Fab)2片段進(jìn)行提純。在步驟(6)中所采用的柱層析法既可以是離子交換法，也可以是分子篩層析法，更具體來(lái)說(shuō)，所采用的離子交換法可以是陰離子或陽(yáng)離子交換法；所采用的分子篩層析法可以是DEAE柱層析、凝膠濾過(guò)層析或蛋白A柱層析。
在步驟(7)中所采用的濃縮方法還可以是PEG濃縮法。但本發(fā)明優(yōu)選采用切向流超濾濃縮法。
本發(fā)明所采用的球蛋白G有效片段既可以是含有球蛋白G有效片段的溶液，也可以是通過(guò)步驟(8)的操作——對(duì)步驟(7)得到的免疫球蛋白G有效片段進(jìn)行冷凍干燥，得到干燥的球蛋白G有效片段。
此外，本發(fā)明的制備方法還可以包括對(duì)進(jìn)行血清、IgG以及(Fab)2片段的鑒定和活性檢測(cè)，例如，蛋白測(cè)定法檢測(cè)其濃度；用血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)血凝抑制效價(jià)；用中和抗體法檢測(cè)血清、IgG以及(Fab)2片段，得到禽流感病毒的效價(jià)。本發(fā)明所采用的檢測(cè)方法優(yōu)選為禽流感病毒檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中記載的方法。
本發(fā)明的制備方法基于以下原理滅活的禽流感病毒中的抗原成分可以誘導(dǎo)和刺激動(dòng)物產(chǎn)生高滴度的中和抗體，而這種中和抗體又可以在體內(nèi)與禽流感病毒特異結(jié)合，中和進(jìn)入體內(nèi)禽流感病毒而達(dá)到治療的目的。根據(jù)這一原理，本發(fā)明的發(fā)明人利用臨床分離獲得的禽流感病毒或從受禽流感病毒感染的禽類體內(nèi)分離的禽流感病毒，滅活后制得滅活疫苗，然后與具有加強(qiáng)免疫刺激效果的免疫佐劑一起注射到馬、羊、豬等動(dòng)物體內(nèi)，在證實(shí)免疫動(dòng)物體內(nèi)已產(chǎn)生抗體后，從免疫動(dòng)物血液中提取血清或血漿成份，再?gòu)难搴?或血漿中提取特異的免疫球蛋白。
本發(fā)明的制備方法的特點(diǎn)是采用了直接對(duì)血漿和/或血清中的免疫球蛋白G進(jìn)行酶消化，從而將IgG消化為(Fab)2片段和Fc片段；還采用了切向流超濾系統(tǒng)(Tangential-flowultrafiltration)，先采用該系統(tǒng)除去低分子量的消化產(chǎn)物，然后將去除了小分子并富含(Fab)2的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)陰離子柱層析，去除胃蛋白酶和其它的無(wú)效成份，再經(jīng)過(guò)切向流超濾系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，得到濃縮后(Fab)2片段。該方法得到的(Fab)2產(chǎn)率較高，1L血清中可以獲得約19-21g的(Fab)2。然而如果采用常規(guī)的硫酸銨沉淀，然后對(duì)IgG進(jìn)行酶消化得到(Fab)2的方法，則1L血清中僅能提取出約13-15g的(Fab)2。而且，硫酸銨鹽析法沉淀IgG后，IgG中的銨離子無(wú)法除去，存在用藥安全性隱患。
本發(fā)明的制備方法采用了酶消化法和切向流超濾系統(tǒng)，可從1L血清中提取出約19-21g的(Fab)2，比提取免疫球蛋白常采用的硫酸銨鹽析法得到的(Fab)2的產(chǎn)率要高。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種抗禽流感病毒免疫球蛋白制劑。
本發(fā)明的抗禽流感病毒疫球蛋白制劑中含有本發(fā)明的抗禽流感病毒免疫球蛋白G有效片段，以及藥學(xué)上可以接受的輔料。
本發(fā)明的制劑包括凍干粉針、液體注射制劑、噴霧制劑。其中，本發(fā)明的液體注射制劑可以用于靜脈注射、肌肉注射、皮下注射。本發(fā)明的抗禽流感病毒免疫球蛋白噴霧劑可以作用于粘膜組織，尤其適合作用于鼻腔粘膜組織，是一種攜帶、使用方便的劑型。
本發(fā)明的抗禽流感病毒疫球蛋白制劑可用于被禽流感病毒感染的病人的治療、以及疑似病人、禽流感病毒感染的接觸者等高危人群的預(yù)防，同時(shí)還可以用于動(dòng)物禽流感的緊急預(yù)防接種和治療。
以下結(jié)合實(shí)施例，來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例，任何依照本發(fā)明的基本精神的改造或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)中所要求保護(hù)的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例中使用的動(dòng)物選擇3-5歲膘情好、未經(jīng)免疫的深色馬(用紅棕色或黑色，而白色、青色馬不用)，免疫前飼養(yǎng)90天以上，進(jìn)行馬傳貧、鼻疽、布病檢查，選出健康的馬用與動(dòng)物免疫。
動(dòng)物的飼養(yǎng)場(chǎng)所選擇與管理選擇遠(yuǎn)離其它動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)所的圈舍作為飼養(yǎng)場(chǎng)所，動(dòng)物進(jìn)入一周前進(jìn)行消毒。動(dòng)物專人飼養(yǎng)，器械及用具專用。動(dòng)物排泄物進(jìn)行無(wú)害化處理。
實(shí)施例中所采用的部分材料氟氏完全佐劑(FCA)與不完全佐劑(FIA)均為Sigma公司的產(chǎn)品。
低鹽哌嗪緩沖液(20mM哌嗪，30mM NaCl 用HCl調(diào)pH至6.0)滲濾緩沖液A(Buffer A)(20mM哌嗪，150mM NaCl，pH 6.0)滲濾緩沖液B(Buffer B)(20mM哌嗪，1或2M NaCl用HCl調(diào)pH至6.0)實(shí)施例1 抗原制備以250ml log 10-60TCID50/ml的禽流感病毒細(xì)胞培養(yǎng)物為抗原，0.2％甲醛進(jìn)行滅活，5000gx 30分鐘離心取上清，20000-25000g超速離心1.5小時(shí)取沉淀，滅菌蒸餾水16x稀釋。制備氟氏完全佐劑(FCA)與不完全佐劑(FIA)用于免疫。
實(shí)施例2 免疫程序用實(shí)施1制備的抗原免疫3匹云南某軍馬場(chǎng)的健康馬。免疫可分為基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫?；A(chǔ)免疫一般注射兩次抗原，第一次用FCA+滅活禽流感疫苗，第二次及以后用FIA+滅活禽流感疫苗。然后用滅活病毒或滅活疫苗直接免疫，根據(jù)免疫馬產(chǎn)生抗體的滴度或效價(jià)，決定加強(qiáng)免疫的數(shù)量。一般加強(qiáng)免疫次數(shù)為3-5次。
實(shí)施例3 血清/血漿的分離與保存按實(shí)例2免疫的步驟免疫健康馬，于免疫后7天采血，每隔一個(gè)星期或10天采一次血，分離血清，用血凝抑制試驗(yàn)(HI)或ELISA/微量細(xì)胞中和試驗(yàn)測(cè)定抗體效價(jià)。根據(jù)抗體效價(jià)，在最后一次采血，分離血清或血漿，-20℃保存。
實(shí)施例4 本發(fā)明免疫球蛋白(Fab)2片段的分離和純化及產(chǎn)品鑒定方法1肌肉注射用馬抗禽流感病毒免疫球蛋白(Fab)2片段的制造及檢定1)制備工藝a.將實(shí)施例3得到的原料馬血漿或、血清置于37℃水浴融解后，按45％加入飽和硫酸銨溶液，溫和攪拌30分鐘，于4℃離心取沉淀。
b.往步驟a得到的沉淀加入與血漿等體積的注射用水溶解，經(jīng)透析除鹽后，按2％加入胃酶于37℃消化8小時(shí)。
c.調(diào)節(jié)將步驟b得到的胃酶消化液最終pH至8.0±0.1，通過(guò)DEAESepharose Fast Flow離子交換層析柱。
d.將步驟c得到的層析液超濾濃縮，加入最終濃度為0.3M的甘氨酸成為產(chǎn)品原液。
e.檢定步驟d得到的產(chǎn)品原液，檢定合格后按規(guī)格除菌分裝。
2)檢測(cè)外觀無(wú)色或淺黃色澄清液體，可帶輕微乳光，不應(yīng)有異物、絮狀物及搖不散的沉淀。
蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法測(cè)定，應(yīng)不高于150g/L。
pH值加生理氯化鈉溶液稀釋成10g/L蛋白質(zhì)濃度。在20±2℃測(cè)定，pH值為6.6至7.4。
純度用SDS-PAGE法測(cè)定，(Fab)2含量不低于70％。
細(xì)菌內(nèi)毒素含量用鱟試劑凝膠法測(cè)定，細(xì)菌內(nèi)毒素含量不高于200EU/ml。
3)劑型與規(guī)格液體劑型，每瓶裝量為1ml。
保存，運(yùn)輸2～8℃避光保存和運(yùn)輸。有效期自效價(jià)檢定合格之日起暫定為3年。
該液體制劑可用于制備噴霧劑或注射劑，冷凍干燥后可以制成凍干粉針。
方法2 逐步法從血清中大量獲得高純度抗體片段(Fab)21)溶液和緩沖液的配制胃蛋白酶溶液(用蒸餾水或去離子水配制50mg/ml，等分成兩份，-20℃貯存?zhèn)溆?、鹽酸(0.36M)、哌嗪基質(zhì)液(50mM)、低鹽哌嗪緩沖液、Buffer A、BufferB。
2)抗血清的處理量取40ml血清(或所需劑量)用約11ml的0.36M HCl調(diào)pH至3.5，同時(shí)用磁性攪拌器混合。
3)胃蛋白酶消化酸化后的抗血清在37℃水浴預(yù)熱30min，加足量的胃蛋白酶溶液，使酶與原抗血清之比為4294U/ml或171，760U/40ml，同時(shí)磁性攪拌器攪拌。加過(guò)后繼續(xù)攪拌5分鐘，繼續(xù)37℃消化18-24h。用哌嗪基質(zhì)液滴定至pH 6.0停止消化，同時(shí)攪拌。停止消化后貯存過(guò)夜，如果一周后用則4℃保存。2750g，4-12℃離心，棄沉渣。除了可以采用離心以外，還可以采用大型玻璃毛纖維預(yù)過(guò)濾器過(guò)濾。大型玻璃毛纖維預(yù)過(guò)濾器過(guò)濾能夠在無(wú)菌條件下大劑量過(guò)濾。沉淀(粒狀沉淀)可用低鹽哌嗪緩沖液重懸，再次離心，收集上清。同樣，若過(guò)濾，過(guò)濾器可用少量低鹽哌嗪緩沖液沖洗，增加產(chǎn)物量。
4)去除低分子量的消化產(chǎn)物可通過(guò)切向流滲濾除去低分子量的消化產(chǎn)物。無(wú)任何沉淀的消化液在裝有50cm3截留分子量為30kDa濾膜的切向流滲濾器上首先濃縮至約100ml總體積(如關(guān)閉樣品容器蓋之前，約30ml在管中和膜上，樣品容器中約70ml)。同時(shí)用至少10(≥11)倍總體積的滲濾緩沖液A沖洗。繼續(xù)濃縮，用少量的滲濾緩沖液A使終體積保持在100ml，沖洗掉切向流滲濾器上的任何殘余物，達(dá)到最佳回收。此過(guò)程中可能形成少量沉淀，可以通過(guò)離心或預(yù)過(guò)濾器過(guò)濾。若進(jìn)行小劑量濃縮處理，也可以采用離心機(jī)、正壓濃縮器或者尺寸排阻層析。
5)陰離子交換層析用50ml的Q-SepHarose Fast Flow裝柱(柱床10cm高)，用200ml的滲濾緩沖液A預(yù)平衡，進(jìn)行陰離子交換分離。消化過(guò)的抗血清通過(guò)柱，同時(shí)監(jiān)測(cè)被洗脫物的A280nm值，然后用新鮮的滲濾緩沖液A使A280nm回至基線。收集所有未吸附物，相當(dāng)于純化的(Fab)2，2-8℃貯存。然后用梯度滲濾緩沖液B洗脫被吸附的污染物(酸性凝集物和胃蛋白酶)，使柱再生。層析流速始終保持在5ml/min。
6)濃縮切向流超濾裝置用于濃縮和/或制備終產(chǎn)物(未吸附的陰離子交換物)，達(dá)到所需濃縮量。產(chǎn)物濃縮后，VivaFlow50系統(tǒng)用去離子水徹底清洗，然后用1M NaOH清洗2h，使系統(tǒng)再生。加低鹽緩沖液，再用去離子水洗去清洗液NaOH。
7)分析方法a.SDS-PAGE用Laemmli(1970)描述的緩沖系統(tǒng)，非還原SDS-PAGE，監(jiān)測(cè)消化過(guò)程中未消化的IgG或未完全消化的清蛋白片段。
b.尺寸排阻層析尺寸排阻層析可用于檢測(cè)大分子量凝集物。使用FPLC系統(tǒng)，柱Superose 12Hr 10/30，加樣前樣品用50nM(納摩爾)Tris/200nMNaCl，pH 8.0的緩沖液稀釋，離心、過(guò)濾，上樣，0.5ml/min的流速1h以上，洗脫的蛋白A280nm監(jiān)測(cè)。
c.分析型離子交換層析用層析系統(tǒng)和柱Mono QHR 10/10來(lái)檢測(cè)需除去的酸性雜質(zhì)和大分子凝集物和胃蛋白酶，柱用滲濾緩沖液A平衡，上樣，最后用梯度滲濾緩沖液B再生柱，層析流速為5ml/min，A280nm監(jiān)測(cè)。
8)結(jié)果以牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，BCA蛋白分析，馬抗血清濃度為95g/L左右。
產(chǎn)品鑒定方法以及產(chǎn)品的劑型與規(guī)格與方法1的相同。
實(shí)施例5 本發(fā)明IgG的分離、純化及產(chǎn)品鑒定
1)制備工藝a.將實(shí)施例3得到的原料馬血漿置于37℃水浴融解后，按45％加入飽和硫酸銨溶液，溫和攪拌30分鐘，于4℃離心取沉淀。
b.往步驟a得到的沉淀中加入與血漿等體積的注射用水溶解，經(jīng)透析除鹽；c.將步驟b得到的沉淀通過(guò)DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析柱。
d.將步驟c得到的層析液超濾濃縮，制得抗禽流感病毒IgG。
2)檢測(cè)外觀無(wú)色或淺黃色澄清液體，不應(yīng)有異物、絮狀物及搖不散的沉淀。
蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法測(cè)定，應(yīng)不高于150g/L。
pH值加生理氯化鈉溶液稀釋成10g/L蛋白質(zhì)濃度。在20±2℃測(cè)定，pH值為6.6至7.4。
純度用SDS-PAGE法測(cè)定，IgG的含量不低于70％。
細(xì)菌內(nèi)毒素含量用鱟試劑凝膠法測(cè)定，細(xì)菌內(nèi)毒素含量不高于200EU/ml。
3)劑型與規(guī)格液體劑型，每瓶裝量為1ml。
保存，運(yùn)輸2～8℃避光保存和運(yùn)輸。有效期自效價(jià)檢定合格之日起暫定為3年。
該液體制劑可用于制備噴霧劑或注射劑，冷凍干燥后可以制成凍干粉針。
實(shí)施例6 馬血清的效價(jià)檢測(cè)一、血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)(一)材料準(zhǔn)備1.96孔V型微量反應(yīng)板，微量移液器(配有滴頭)。
2.阿氏(Alsevers)液、雞紅細(xì)胞懸液，配制方法見(jiàn)(表-2HA和HI試驗(yàn)用溶液的配制)。
(1)阿氏(Alsevers)液配制。阿氏(Alsevers)液的配方如下表所示。

加蒸餾水至100mL，加熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa 15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)1％雞紅細(xì)胞懸液制備采集至少3只SPF公雞或無(wú)禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH 7.2的0.01mol/L PBS液洗滌3次，每次均以1000r/min離心10min，洗滌后用PBS配成1％(V/V)紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.pH 7.2的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)。
4.高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和標(biāo)準(zhǔn)分型血清以及陰性血清。
(二)操作方法1.血凝(HA)試驗(yàn)(微量法)(1)在微量反應(yīng)板的1-12孔均加入0.025mL PBS，換滴頭；(2)吸取0.025mL抗原加入第1孔，混勻；(3)從第1孔吸取0.025mL抗原加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，如此進(jìn)行對(duì)倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄之，換滴頭；(4)每孔再加入0.025mL PBS；(5)每孔均加入0.025mL 1％(V/V)雞紅細(xì)胞懸液(將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入)；(6)振蕩混勻，在室溫(20℃-25℃)下靜置40min后觀察結(jié)果(如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下1hr)。對(duì)照孔紅細(xì)將成明顯的鈕扣狀沉到孔底；(7)結(jié)果判定。將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無(wú)呈淚滴狀流淌。完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位(HAU)。
2.血凝抑制(HI)試驗(yàn)(微量法)(1)根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為1∶256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1∶64(256除以4)。
(2)在微量反應(yīng)板的1-11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mLPBS。
(3)吸取0.025mL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對(duì)倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。
(4)1-11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025mL，室溫(約20℃)靜置至少30min。
(5)每孔加入0.025mL的雞紅細(xì)胞懸液輕輕混勻，靜置約40min(室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下1hr)，對(duì)照紅細(xì)胞將呈顯鈕扣狀沉于孔底。
(三)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)以完全抑制4個(gè)HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。
只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于2log 2，陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過(guò)1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。
HI價(jià)小于或等于3log2判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)等于4log2為陽(yáng)性。
(四)結(jié)果血清的HI價(jià)為1∶10240。
二、ELISA法檢測(cè)采用間接ELISA法，操作步驟按禽流感檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，測(cè)得實(shí)施例3獲得的馬血清的抗體滴度為1∶10240。
實(shí)施例7 (Fab)2片段的效價(jià)檢測(cè)采用間接ELISA法與中和抗體試驗(yàn)測(cè)得實(shí)施例4方法1獲得的(Fab)2片段進(jìn)行濃縮之前的效價(jià)為1∶4096，檢測(cè)步驟按禽流感檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
采用間接ELISA法與中和抗體試驗(yàn)測(cè)得實(shí)施例4方法2獲得的(Fab)2片段進(jìn)行濃縮之前的效價(jià)為1∶5120，檢測(cè)步驟按禽流感檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種抗禽流感病毒免疫球蛋白，其特征在于，所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白是指抗禽流感病毒免疫球蛋白G和/或抗禽流感病毒免疫球蛋白G的有效片段；所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白是從免疫接種的動(dòng)物的血清和/或血漿中提取出來(lái)的，所述的免疫接種的動(dòng)物是采用滅活的禽流感病毒與免疫佐劑的混合物和/或禽流感疫苗進(jìn)行免疫接種；所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白的中和抗體效價(jià)為1∶1024-1∶10240。
2.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白，其特征在于，所述的免疫接種的動(dòng)物為馬、羊、?；蜇i。
3.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白，其特征在于，所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白的中和抗體效價(jià)為1∶2048-1∶10240。
4.如權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白，其特征在于，所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白是抗H5型、H7型、H9型中一種或一種以上禽流感病毒型的免疫球蛋白。
5.一種制備抗禽流感病毒免疫球蛋白G有效片段的方法，該方法包括以下步驟(1)用滅活的禽流感病毒與免疫佐劑的混合物和/或禽流感疫苗對(duì)動(dòng)物體進(jìn)行免疫接種；(2)采集經(jīng)步驟(1)免疫接種的動(dòng)物的血液；(3)從步驟(2)得到的動(dòng)物血液中分離出血清和/或血漿；(4)用胃蛋白酶直接對(duì)步驟(3)得到的血清和/或血漿中的免疫球蛋白G進(jìn)行消化；(5)采用切向流超濾系統(tǒng)，除去步驟(4)得到的混合物中的低分子量的消化產(chǎn)物；(6)采用柱層析，對(duì)步驟(5)得到的物質(zhì)進(jìn)行提純；(7)采用切向流超濾系統(tǒng)，對(duì)步驟(6)得到的物質(zhì)進(jìn)行濃縮，制得免疫球蛋白G的有效片段。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中所述的滅活的禽流感病毒所采用的滅活方法是甲醛滅活法、β-丙內(nèi)脂滅活法或溫度滅活法，其中，甲醛滅活法所采用的甲醛濃度為0.10％-1.00％，溫度滅活法所采用的滅活溫度為46-66℃。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的免疫佐劑是氟氏佐劑、氫氧化鋁佐劑或CpG。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括步驟(8)對(duì)步驟(7)得到的免疫球蛋白G有效片段進(jìn)行冷凍干燥，得到干燥的球蛋白G有效片段。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(6)中所述的柱層析法是離子交換法或分子篩層析法。
10.一種抗禽流感病毒免疫球蛋白制劑，其特征在于，所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白制劑含有如權(quán)利要求1-4之一所述的抗禽流感病毒免疫球蛋白G有效片段以及藥學(xué)上可以接受的輔料，所述的制劑是液體注射制劑、凍干粉針或噴霧制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗禽流感病毒免疫球蛋白及其制備方法，該免疫球蛋白是指抗禽流感病毒免疫球蛋白G和/或其有效片段([Fab]
文檔編號(hào)A61P31/00GK1796416SQ20041007766
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日
發(fā)明者陸家海, 郭中敏, 潘興華 申請(qǐng)人:中山大學(xué), 陸家海