專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞毒免疫球蛋白的制作方法
專(zhuān)利說(shuō)明本發(fā)明涉及細(xì)胞毒免疫球蛋白(cytotoxic immunoglobulin)。單克隆抗體已廣泛用作治療性結(jié)合劑?；镜目贵w結(jié)構(gòu)在本文中以完整的IgGl 免疫球蛋白為例來(lái)說(shuō)明。兩條相同的重鏈(H)和兩條相同的輕鏈(L)組合，形成Y形抗體分子。每條重鏈 有4個(gè)結(jié)構(gòu)域。氨基末端可變區(qū)(VH)位于Y形的頂端。它們之后是三個(gè)恒定區(qū)CH1，CH2， 以及位于Y形的莖部底座的羧基端CH3。一條短鏈，即連接鏈(switch)，將重鏈可變區(qū)與恒 定區(qū)相連。鉸鏈將CH2和CH3(Fc片段)與抗體的其余部分(Fab片段)相連。對(duì)完整抗體 分子的鉸鏈區(qū)進(jìn)行蛋白裂解，可以產(chǎn)生一個(gè)Fc和兩個(gè)相同的Fab片段。輕鏈由可變區(qū)(VL) 和恒定區(qū)(CL)這兩個(gè)區(qū)組成，它們被一個(gè)連接鏈分隔。鉸鏈區(qū)中的二硫鍵將兩條重鏈連接起來(lái)。輕鏈與重鏈通過(guò)另外的二硫鍵相連。根 據(jù)免疫球蛋白類(lèi)型的不同，在恒定區(qū)中不同位置附著有Asn-連接的糖模塊(Carbohydrate moieties)。對(duì)于IgGl，鉸鏈區(qū)中位于Cys235和Cys238之間的二硫鍵將兩條重鏈串起來(lái)。 輕鏈與重鏈通過(guò)CHl區(qū)的Cys2^與CL區(qū)的Cys214之間的兩個(gè)額外二硫鍵相連。糖模塊 與每個(gè)CH2中的Asn306相連，在Y形的莖區(qū)產(chǎn)生明顯的凸出。這些特征具有深遠(yuǎn)的功能性后果。重鏈和輕鏈兩者的可變區(qū)(VH和VL)位于Y 形"尖端"，它們?cè)谀抢锾幱谂c抗原反應(yīng)的位置。該分子的這種尖端是氨基酸序列N端所 在。Y形的主干區(qū)以有效介導(dǎo)效應(yīng)子功能的方式凸出，所述效應(yīng)子功能諸如激活補(bǔ)體以及 與Fc受體相互作用，或ADCC和ADCP。其CH2和CH3區(qū)凸出有利于與效應(yīng)蛋白的相互作用。 該氨基酸序列的C端位于與尖端相反的一側(cè)，即Y形的"底部"。抗體中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)型的輕鏈=IambdaU )型和kappa( κ )型。一種具體的免疫球蛋 白要么具有κ鏈，要么具有λ鏈，不會(huì)同時(shí)具有兩種鏈。具有λ輕鏈的抗體與具有κ輕 鏈的抗體之間未發(fā)現(xiàn)功能差異?？贵w分子的每個(gè)結(jié)構(gòu)域具有相似的結(jié)構(gòu)兩個(gè)beta片層彼此緊密靠近而反向平 行堆積成beta柱體(barrel)。這一保守結(jié)構(gòu)稱(chēng)為免疫球蛋白折疊。恒定區(qū)的免疫球蛋白 折疊包含一個(gè)由3-鏈片層堆積在一個(gè)4-鏈片層上。該折疊的穩(wěn)定是通過(guò)每個(gè)片層的beta 鏈之間的氫鍵、通過(guò)內(nèi)部的反向片層殘基之間的疏水相互作用、以及通過(guò)這些片層之間的 二硫鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述3-鏈片層包含C，F(xiàn)，和G鏈，所述4-鏈片層具有A，B，E，和D鏈。字 母A-G表示這些beta鏈沿免疫球蛋白折疊的氨基酸序列的依次位置。可變區(qū)的折疊結(jié)構(gòu)具有9條β折疊鏈，排列成4條鏈和5條鏈的兩組片層。5鏈 片層在結(jié)構(gòu)上與恒定區(qū)的3鏈片層類(lèi)似，但包含額外的C'和C"鏈。其余鏈(Α、B、C、D、 E、F、G)與它們?cè)诤愣▍^(qū)免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)中的對(duì)應(yīng)物具有相同的拓?fù)鋵W(xué)和相似的結(jié)構(gòu)。 一個(gè)二硫鍵連接對(duì)立片層中的B和F鏈，與恒定區(qū)中的一樣。免疫球蛋白輕鏈和重鏈的可變區(qū)都包含三個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。V區(qū)的 三個(gè)⑶R(⑶R1、⑶R2、⑶舊)在β桶的一端簇集。這些⑶R是連接免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)的 β鏈B-C、C' -C"和F-G的環(huán)。這些⑶R中的殘基在不同免疫球蛋白分子中有不同，賦予 抗體各自的抗原特異性。
抗體分子尖端的VL和VH結(jié)構(gòu)域壓緊，使得6個(gè)CDR(每個(gè)結(jié)構(gòu)域3個(gè))協(xié)作而構(gòu) 建供抗原特異性結(jié)合的表面(或空腔)。如此，抗體的天然抗原結(jié)合位點(diǎn)由連接輕鏈可變區(qū) 的B-C、C' -C"和F-G鏈及重鏈可變區(qū)的B-C、C' -C"和F-G鏈的環(huán)構(gòu)成?？贵w分子尖端的VL和VH區(qū)緊密推擠，使得6個(gè)CDR(每區(qū)3個(gè))協(xié)作而構(gòu)建出供 抗原特異性結(jié)合的表面(或空腔)。如此一來(lái)，抗體的天然抗原結(jié)合位點(diǎn)由連接輕鏈可變區(qū) 的B-C、C' -C"和F-G鏈及重鏈可變區(qū)的B-C、C' -C"和F-G鏈的多個(gè)環(huán)構(gòu)成。有些環(huán)并非天然免疫球蛋白中的⑶R環(huán)、或者也不是由⑶R環(huán)和可能還有⑶R環(huán) 區(qū)內(nèi)鄰接環(huán)決定的抗原結(jié)合口袋的一部分，這樣的環(huán)不具有抗原結(jié)合或表位結(jié)合特異性， 但有助于完整免疫球蛋白分子和/或其效應(yīng)物或其它功能的正確折疊，因此為了本發(fā)明的 目的被稱(chēng)為結(jié)構(gòu)環(huán)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)顯示，到目前為止免疫球蛋白樣支架被用于操控已有的抗原結(jié)合位 點(diǎn)，從而導(dǎo)入新的結(jié)合特性。在大多數(shù)情況下CDR區(qū)已經(jīng)被改造用于抗原結(jié)合，換言之，就 免疫球蛋白折疊來(lái)說(shuō)，只有天然抗原結(jié)合位點(diǎn)被改造以便改變其結(jié)合親和力或特異性。已 有非常多的文獻(xiàn)記載了不同形式的此類(lèi)被操作過(guò)的免疫球蛋白，它們常常以單鏈Fv片段 (scFv)或Fab片段的形式表達(dá)，或是展示在噬菌體顆粒的表面，或是在各種原核或真核表 達(dá)系統(tǒng)中可溶性表達(dá)。W006/072620A1描述了一種改造免疫球蛋白的方法，其包括在結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的改造以 獲得新的抗原結(jié)合位點(diǎn)。該方法廣泛適用于免疫球蛋白，可用于產(chǎn)生一系列靶向于不同抗 原的免疫球蛋白。CH3文庫(kù)已經(jīng)被證明可用于選擇抗原的特異性結(jié)合劑。W008/003103A2描述了在代表CD20抗原的模擬表位(mimotope)的合成肽上淘選 CH3, CHl 或 CL 文庫(kù)。多種免疫球蛋白文庫(kù)已在本領(lǐng)域被提議用于獲得特異性免疫球蛋白結(jié)合劑。現(xiàn)有 技術(shù)總體上涉及結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單體單價(jià)展示。W09209690A2描述了噬菌粒顆粒在其顆粒表 面展示單拷貝的融合蛋白。從而描述了從噬菌粒顆粒(亦稱(chēng)為噬菌體)的文庫(kù)獲得高親和 力的結(jié)合劑。這提供了含編碼結(jié)合多肽和噬菌體外殼蛋白的基因的可復(fù)制型表達(dá)載體，以 形成編碼融合蛋白的基因融合體，其是噬菌粒顆粒、噬菌體外殼蛋白和結(jié)合多肽的嵌合蛋 白。US5223409泛泛描述了將編碼目的蛋白的基因與絲狀噬菌體M13基因III外殼蛋 白的N端結(jié)構(gòu)域融合的方法。所述基因融合體經(jīng)突變，形成結(jié)構(gòu)相關(guān)、且在噬菌粒顆粒表面 少量表達(dá)的融合蛋白的文庫(kù)。生物學(xué)選擇和篩選方法被用來(lái)鑒定可用作藥物候選物的新配 體。但是，在使用這類(lèi)“融合噬菌體”或單價(jià)噬菌體展示和使用相應(yīng)單個(gè)融合蛋白方面 存在一些限制。多個(gè)生物制品天然以低聚形式存在。對(duì)于本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)，低聚表示二 聚、三聚或甚至更高的多聚形式，直至M個(gè)單體?，F(xiàn)有技術(shù)的融合噬菌體被描述為展示單體融合蛋白，主要是因?yàn)椋瑩?jù)信如果通過(guò) 噬菌粒顆粒展示多個(gè)單體融合蛋白，最高親和力的結(jié)合劑只能選自一種文庫(kù)。但是天然 蛋白經(jīng)常組裝為二聚體或甚至以更高的寡聚程度組裝。為了獲得具有單個(gè)融合蛋白的二 聚展示，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一些技術(shù)，它們涉及位于外殼蛋白和結(jié)合多肽之間的條件終止密碼子 (Dall' Acqua et al. The Journal of Immunology, 2002，169 :5171-5180)。從而除了與噬菌體融合的多肽之外的那些多肽的可溶性單體被表達(dá)，由此啟動(dòng)二聚體的形成。但是，這 類(lèi)終止密碼子需要在能將終止密碼子翻譯為氨基酸的特異性抑制者宿主細(xì)胞中增殖，以便 提供合適量的除可溶性結(jié)合多肽之外的融合蛋白。在一些情況下，現(xiàn)有技術(shù)的融合蛋白包括接頭序列，以便展示更大的結(jié)合多 肽。最多有M個(gè)氨基酸的接頭序列常規(guī)用于展示抗體的可變區(qū)。參見(jiàn)例如，展示載體 pC0MB3x(Hybrid. Hybridomics. 2003 Apr ；22 (2) :97-108. Development of functional human monoclonal single-chain variable fragment antibody against HIV-I from human cervical B cells. Berry JD,Rutherford J,Silverman GJ,Kaul R,Elia M,Gobuty S, Fuller R, Plummer FA,Barbas CF.)?；谌L(zhǎng)IgGl的免疫球蛋白已廣泛用于治療實(shí)體腫瘤患者，尤其過(guò)表達(dá)erbB類(lèi) 受體的那些。所述的受體例如EGFR(Herl)，Her2, Her2neu, Her3和Her4。Herceptin (曲妥珠單抗(trastuzumab)，humAb4D5)是基于單克隆抗體、用于治療 乳腺癌的產(chǎn)品。Here印tin抗體特異于her2neu (也稱(chēng)c-erbB-2或MAC117)的HER2胞外區(qū) 的4D5表位。丨‘HER2胞外區(qū)〃或〃HER2 E⑶〃是指位于細(xì)胞外側(cè)的HER2區(qū)，包括其片段，它們 或者錨著在細(xì)胞膜上，或者在血液循環(huán)中。HER2胞外區(qū)可包含4個(gè)區(qū)“I區(qū)"(氨基酸殘 基約1-195)，" II區(qū)〃(氨基酸殘基約196-319)，" III區(qū)〃(氨基酸殘基約320-488)， 和"IV區(qū)"(氨基酸殘基約489-630)(不含信號(hào)肽時(shí)的殘基編號(hào))?！?4D5表位〃是HER2胞外區(qū)中被4D5抗體(ATCC CRL 10463)和曲妥珠單抗結(jié) 合的區(qū)。該表位靠近HER2跨膜區(qū)，位于HER2的第IV區(qū)內(nèi)。HER2的4D5表位在大約殘基 5四-625區(qū)域(包括HER2 ECD)跨越(encompasses)任意一或多個(gè)殘基，是含有信號(hào)肽時(shí)的 編號(hào)。EGFR是大分子(1，186個(gè)殘基)單體糖蛋白，有單個(gè)跨膜區(qū)，胞漿酪氨酸激酶區(qū)， 側(cè)翼為非催化調(diào)節(jié)區(qū)。序列分析顯示，外功能區(qū)(ectodomain，殘基1-621)包含4個(gè)亞區(qū)， 在此稱(chēng)Li，CRl, L2和CR2，其中L和CR分別是大和Cys富集。The Ll和L2區(qū)也分別稱(chēng) I區(qū)和III區(qū)。CR區(qū)以前稱(chēng)II區(qū)和IV區(qū)，或稱(chēng)Si. 1-S1. 3和S2. 1-S2. 3，其中的S是“小 (small)，，的縮寫(xiě)。已開(kāi)發(fā)出抗EGFR胞外區(qū)的單克隆抗體(Mab)，其破壞配體與受體的結(jié)合及隨后 的信號(hào)傳導(dǎo)。三種EGFR-特異性阻斷抗體已在體外試驗(yàn)中被非常詳細(xì)地表征，目前已用 于臨床研究；它們是 mAbC225 (ERBITUX/ 西妥昔單抗(cetuximab))，mAb425 (EMD72000) 和人mAb ABX-EGF。C225 (西妥昔單抗/Erbitux)已被FDA批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌， mAb425 (EMD59000)的人源化形式是(EMD72000)，其目前已進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)，用于多種表 達(dá)EGFr的實(shí)體腫瘤。C225結(jié)合EGFr胞外區(qū)的明顯(distinct)表位。已有證據(jù)表明，這兩 種抗體都與野生型受體獨(dú)立地結(jié)合，也都與在腫瘤細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的突變受體(EGFrVIII) 獨(dú)立地結(jié)合。西妥昔單抗僅與EGFR胞外區(qū)的III區(qū)(sEGFR)發(fā)生相互作用，其與該結(jié)構(gòu)域 的配體結(jié)合區(qū)域部分地咬合，在空間上阻礙該受體二聚化。自發(fā)突變的EGF受體首先在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)。現(xiàn)稱(chēng)為EGFRvIII的這種分子 代表了 EGF受體胞外區(qū)外顯子2-7的缺失。這去掉了 273個(gè)氨基酸，在融合連接處產(chǎn)生 新的甘氨酸。EGFRvIII (也稱(chēng)de2-7EGFR或deltaEGFR)在胞外區(qū)有框內(nèi)缺失(in-framedeletion)，在非常多種類(lèi)型的人類(lèi)腫瘤中都已發(fā)現(xiàn)。W09720858A1涉及誘導(dǎo)Her2表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗Her2抗體。因此，與Her2結(jié)合的 單克隆抗體(HiAb)通過(guò)用純化的可溶性Her2免疫小鼠來(lái)產(chǎn)生。W006087637A2涉及識(shí)別Her2/neu并對(duì)Her2/neu表達(dá)細(xì)胞發(fā)揮抗增生效應(yīng)的抗 體。該文獻(xiàn)描述了能特異性結(jié)合Her2neU、但無(wú)細(xì)胞毒活性的分離的抗體或片段，變體或其 衍生物，尤其人Fab片段，以及scFv片段。一些現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)涉及能在缺乏諸如ADCC等細(xì)胞毒活性的情況下抑制腫瘤生長(zhǎng) 的抗體形式。Rovers 等(Cancer Immunol. Immunother. (2007)56 :303-317)描述了具有抑制腫 瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的潛能的抗EGFR納米抗體(nanobodies)。W003/075840A2描述了以相當(dāng)于或高于人VEGF的親和力結(jié)合KDR、并中和KDR的 激活作用的抗體，其中的單價(jià)Fabs能中和KDR的激活作用，并因此抑制血管新生和腫瘤生長(zhǎng)。還有其它一些免疫球蛋白片段被提議用于人類(lèi)的治療。專(zhuān)利申請(qǐng)W006036834A2描述了作為內(nèi)部序列摻入到Fc結(jié)構(gòu)域環(huán)區(qū)之中的生物活 性肽；其說(shuō)明書(shū)描述了一種分子，其通過(guò)插入或替換先前存在于Fc結(jié)構(gòu)域中的氨基酸，而 添加了所述內(nèi)部肽序列。一個(gè)肽實(shí)例靶向pl85HER2/neU。靴向Her2/neu 的肽參見(jiàn) Park et al Nat. Biotechnol. (2000) 18(2) 194-80 雖 然肽結(jié)合親和力常常很低，在kD值高于10_6M的范圍，但該文獻(xiàn)所述的環(huán)外抗HER2/neU肽 模擬物發(fā)揮出不一般的高親和力(KD = 300nM)。W001/01748A2描述了以低水平結(jié)合親和力與人erbB2基因產(chǎn)物結(jié)合的肽混合物。 一例抗erbB2的肽-Fc融合蛋白在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)中被測(cè)試，以少量相同類(lèi)型的肽作為競(jìng)爭(zhēng) 劑，結(jié)果IC50值較低，但并不指示飽和試驗(yàn)中測(cè)出的Kd或EC50值。本發(fā)明的目的是提供改進(jìn)的與細(xì)胞表面結(jié)合的免疫球蛋白產(chǎn)物。所述目的通過(guò)本文所述的主題來(lái)解決。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供分子量最高達(dá)60kD的細(xì)胞毒模塊抗體(cytotoxic modular antibody)，其以Kd < 1(). 的結(jié)合親和力(優(yōu)選在納摩爾范圍或更低水平)結(jié)合細(xì)胞表 面的靶。本發(fā)明的高親和力模塊抗體因此體積縮小，具有易于穿過(guò)細(xì)胞層或腫瘤、在目標(biāo) 被過(guò)表達(dá)的部位有效裂解細(xì)胞或使細(xì)胞死亡的優(yōu)勢(shì)。備選地，本發(fā)明的模塊抗體優(yōu)選IC50 < 10_%，可在飽和結(jié)合試驗(yàn)中測(cè)出。本發(fā)明的模塊抗體優(yōu)選發(fā)揮ADCC，ADCP,⑶C或凋亡活性中的至少一種活性。本發(fā)明模塊抗體的細(xì)胞毒活性優(yōu)選通過(guò)其效應(yīng)子功能確定，即通過(guò)測(cè)定ADCC， ADCP,⑶C或凋亡活性中的至少一種活性來(lái)確定。優(yōu)選的本發(fā)明模塊抗體是模塊抗體結(jié)構(gòu)域的寡聚體，尤其免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的寡 聚體，或全長(zhǎng)免疫球蛋白的片段。優(yōu)選的抗體是選自VH/VL，CH1/CL，CH2/CH2，CH3/CH3，F(xiàn)c 加Fab的二聚體，或它們的單鏈。本發(fā)明的模塊抗體優(yōu)選包含具有隨機(jī)化抗體序列的結(jié)合位點(diǎn)和/或位于結(jié)構(gòu)環(huán) 區(qū)的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其總是要理解為潛在地包括可以對(duì)抗原結(jié)合作貢獻(xiàn)的末端結(jié)構(gòu)域序列。隨機(jī)化抗體序列的位點(diǎn)可以位于CDR區(qū)或結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)之中。因此，與靶結(jié)合、或與功能 性配體如效應(yīng)分子(優(yōu)選支架配體)結(jié)合是可能的，即使免疫球蛋白不含CDR區(qū)，或者在 ⑶R區(qū)以外的部位也是如此。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，細(xì)胞表面靶結(jié)合位點(diǎn)位于CDR區(qū)之中，特異于功能性配體或 支架配體的結(jié)合位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)之中。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，特異于功能性配體或支架配體的結(jié)合位點(diǎn)位于CDR區(qū)之 中，細(xì)胞表面靶結(jié)合位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)之中。優(yōu)選的本發(fā)明模塊抗體具有與靶結(jié)合的特異性結(jié)合特性，所述靶是erbB類(lèi)別的 受體，如選自EGFR，Her2, Her2neu, HER3和HER4。優(yōu)選的本發(fā)明模塊抗體用于治療實(shí)體腫 瘤患者，所述腫瘤表達(dá)erbB類(lèi)型的受體。那些抗-Her2模塊抗體特別優(yōu)選在結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的EF環(huán)之中包含選自表4和表5的 氨基酸序列，表4和表5的序列任選地包含在EF和/或AB和/或CD環(huán)之中。雖然長(zhǎng)期以來(lái)都需要高效的小分子抗體，但這是首次可以根據(jù)本發(fā)明，用模塊抗 體結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)，尤其與效應(yīng)配體結(jié)合的模塊抗體結(jié)構(gòu)域寡聚體的文庫(kù)，獲得這樣的模塊 抗體。所述文庫(kù)中選出的成員具有兩種特性，靶結(jié)合特性和效應(yīng)配體結(jié)合特性，這是生物學(xué) 細(xì)胞毒性或胞解作用的前提。還優(yōu)選模塊抗體支架的形式不因產(chǎn)生所述支架的變體和文庫(kù) 而改變，因此文庫(kù)成員仍保持功能性形式，可通過(guò)與支架配體的結(jié)合來(lái)確定。本發(fā)明提供了產(chǎn)生權(quán)利要求1的模塊抗體的方法，包括以下步驟a.提供模塊抗體結(jié)構(gòu)域寡聚體的庫(kù)，b.在有效應(yīng)配體存在的條件下，將所述庫(kù)與所述靶接觸，c.選出具有以下兩項(xiàng)特性的庫(kù)成員⑴靶結(jié)合親和力為Kd < KT8M或IC50 < 10_8M，且(ii)具有細(xì)胞毒活性，和d.產(chǎn)生該模塊抗體的制劑。優(yōu)選的篩選方法能選出同時(shí)對(duì)兩者(靶和效應(yīng)配體)的結(jié)合，這種同時(shí)結(jié)合有利 于進(jìn)行胞解。同時(shí)結(jié)合優(yōu)選在能進(jìn)行二維鑒別的基于細(xì)胞的試驗(yàn)(如FACS系統(tǒng))中測(cè)定。優(yōu)選地，文庫(kù)成員含有隨機(jī)化抗體序列，其中的誘變位點(diǎn)任選在CDR區(qū)之中或在 ⑶R區(qū)一側(cè)，優(yōu)選在結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)之中，可能包括末端序列。本發(fā)明方法中使用的文庫(kù)優(yōu)選根據(jù)以下設(shè)計(jì)產(chǎn)生，所述設(shè)計(jì)在與效應(yīng)配體相互作 用的結(jié)合位點(diǎn)之外提供誘變。因此，優(yōu)選使用高質(zhì)量文庫(kù)(high quality library)，其通過(guò) 利用效應(yīng)分子結(jié)合試驗(yàn)或支架配體結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行的質(zhì)量控制測(cè)量法來(lái)確定。本發(fā)明的優(yōu)選方法還包括親和力成熟步驟，以增加與細(xì)胞表面靶的結(jié)合親和力。 這種親和力成熟優(yōu)選通過(guò)對(duì)選定的免疫球蛋白的誘變來(lái)進(jìn)行，所述選定的免疫球蛋白具有 確定的與靶結(jié)合的結(jié)合特異性，不與對(duì)照蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，但具有中度或低水平的親和 力。優(yōu)選對(duì)結(jié)合親和力為IC50或Kd < KT6M的文庫(kù)成員進(jìn)一步誘變，以提供親和力成熟的 結(jié)合劑或所述結(jié)合劑的群體，即具有較高親和力的親和力成熟結(jié)合劑的文庫(kù)，所述較高親 和力是指IC50或Kd< 1(TM、優(yōu)選IC50或Kd< 10_8M、或甚至在納摩爾范圍或更低范圍。 在本例中，優(yōu)選本發(fā)明的模塊抗體在其細(xì)胞毒效應(yīng)方面仍然是具有功能的。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明模塊抗體的方法，用于治療實(shí)體腫瘤患者，所述腫瘤表達(dá)erbB —類(lèi)的受體。本發(fā)明的模塊抗體優(yōu)選用于治療實(shí)體腫瘤患者，所述腫瘤表達(dá)erbB —類(lèi)的受體。附圖

圖1 產(chǎn)生裝配文庫(kù)FcabOl所用片段的PCR示意圖。PCR引物按它們各自5’ _3’ 的取向用箭頭表示，垂直線表示為裝配突變基因所引入的限制性位點(diǎn)的大概位置。所述限 制性位點(diǎn)都包含在引物上，用于連接所述PCR片段。圖2 :CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)(IMGT編號(hào))。為文庫(kù)FcabOl至Fcab06 提供了隨機(jī)化方案。AB環(huán)和EF環(huán)中的隨機(jī)化位置用圓圈標(biāo)示。X代表所有20種氨基酸， ζ 僅指 Ala，Asp, Ser, Tyr0圖3 :IgG Fc片段的晶體結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)圖4 含隨機(jī)化氨基酸修飾的人IgGl (氨基酸序列)圖5 :FcabRGD4L的氨基酸序列(氨基酸序列)圖6 載體pHENFcabRGD4 (核苷酸序列)圖7 載體pHENFcabRGD4L (核苷酸序列)圖8 (SEQ ID NO 15)載體 pYDldX (核苷酸序列)圖 9 (SEQ ID NO 16)載體 pYDldXFc (核苷酸序列)圖 10 (SEQ ID NO 17)載體 pYDlCH12 (核苷酸序列)圖 11 (SEQ ID NO 18) =FcabOl (核苷酸序列)圖 12 (SEQ ID NO 19) :Fcab02 (核苷酸序列)圖 13 (SEQ ID NO 20) :Fcab03 (核苷酸序列)圖 14 (SEQ ID NO 21) :Fcab04 (核苷酸序列)圖 15 (SEQ ID NO 22) :Fcab05 (核苷酸序列)圖 16 (SEQ ID NO 23) :Fcab06 (核苷酸序列)圖17 (SEQ ID NO 72)載體 ρYDl (核苷酸序列)圖18 (SEQ ID NO 73)修飾的載體pYDlNhe (核苷酸序列)圖 19 (SEQ ID NO 74)載體 pYDllnk (核苷酸序列)圖 20 (SEQ ID NO 75)載體 pYDlmata (核苷酸序列)圖 21 (SEQ ID NO 76)載體 pYDlgal (核苷酸序列)圖 22 (SEQ ID NO 77) :4D5H(核苷酸序列)圖 23 (SEQ ID NO 78) :4D5L (核苷酸序列)圖 24 (SEQ ID NO 79)載體 pYD4D5hc (核苷酸序列)圖 25 (SEQ ID NO 80) :4D5hp (氨基酸序列)圖洸(SEQ ID NO 81)載體 pYD4D5hl (核苷酸序列)圖 27 (SEQ ID NO 82) :4D51p (氨基酸序列)圖沘(SEQ ID NO :427)質(zhì)粒 pYDldX_dCHldCH3_Fcab_wt (核苷酸序列)發(fā)明詳述^X說(shuō)明書(shū)全文使用的專(zhuān)有術(shù)語(yǔ)具有下列含義。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”被定義為可以顯示單-
-或雙重或多重特異性，或單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)結(jié)合特性的多肽或蛋白，優(yōu)選至少兩個(gè)，更優(yōu)選至少三個(gè)特異性結(jié)合位 點(diǎn)，所述位點(diǎn)針對(duì)例如病原體來(lái)源的或具有人的結(jié)構(gòu)的抗原、效應(yīng)分子或蛋白(象包含細(xì) 胞結(jié)合蛋白或血清蛋白的自身抗原)的表位。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)免疫球蛋白還包括，抗體 的功能性片段，諸如Fe，F(xiàn)ab, scFv, CH1/CL結(jié)構(gòu)域的單鏈二聚體，F(xiàn)v，二聚體如VH/VL，CHl/ CL, CH2/CH2，CH3/CH3，或免疫球蛋白的其它衍生物或組合，象成對(duì)免疫球蛋白區(qū)的單鏈。所 述定義進(jìn)一步包括，可變區(qū)重鏈和輕鏈的結(jié)構(gòu)域(諸如dAb，F(xiàn)d, VI，Vk, Vh, VHH)，完整抗體 的恒定區(qū)或個(gè)別結(jié)構(gòu)域諸如CH1，CH2，CH3，CH4，Cl和Ck，以及由結(jié)構(gòu)環(huán)連接的免疫球蛋白 區(qū)至少兩條beta鏈組成的小結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明使用的“模塊抗體”被定義為抗原結(jié)合分子，例如人抗體，由至少一個(gè)多肽 組件或蛋白結(jié)構(gòu)域組成，優(yōu)選采用天然形式。術(shù)語(yǔ)“模塊抗體”包括抗原結(jié)合分子，其是免 疫球蛋白，免疫球蛋白樣蛋白，或顯示類(lèi)似于免疫球蛋白或抗體的模塊形式和抗原結(jié)合特 性的其它蛋白，其可用作抗原結(jié)合支架，優(yōu)選基于人蛋白。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白樣分子，，涉及任意抗原結(jié)合蛋白，尤其是人蛋白， 其具有可以以模塊方式組建的域結(jié)構(gòu)。本發(fā)明優(yōu)選使用的免疫球蛋白樣分子是T細(xì)胞受體 (TCR)或其可溶性部分，纖連蛋白，運(yùn)鐵蛋白，CTLA-4，單鏈抗原受體，例如與T細(xì)胞受體和 抗體有關(guān)的那些，抗體模擬物，adnectins，anticalins，phyl0mers，重復(fù)蛋白諸如錨蛋白重 復(fù)，avimersjersabodies ，基于全蝎毒素(scorpio toxin)的分子，以及其它具有抗原結(jié) 合特性的非抗體的蛋白支架。錨蛋白重復(fù)(AR)，armadillo重復(fù)(ARM)，亮氨酸富集重復(fù)(LRR)和三角形四肽 (tetratricopeptide)重復(fù)(TPR)蛋白是重復(fù)蛋白這一類(lèi)的最重要成員。重復(fù)蛋白由同源 結(jié)構(gòu)單位(重復(fù)單位)組成，這些單位堆積形成延長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)域。結(jié)合相互作用通常由數(shù)個(gè) 相鄰重復(fù)單位介導(dǎo)，導(dǎo)致大的靶相互作用表面。Avimers包含A結(jié)構(gòu)域，是在數(shù)個(gè)細(xì)胞表面受體中排成一列的多個(gè)結(jié)構(gòu)域。該家族 的結(jié)構(gòu)域天然結(jié)合超過(guò)100種不同的已知靶，包括小分子，蛋白和病毒。截短分析顯示，靶 通常與多個(gè)A結(jié)構(gòu)域接觸，其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地結(jié)合唯一表位。通過(guò)組合多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu) 域來(lái)產(chǎn)生親合力(avidity)，是增加親和力和特異性的有效方法，這些受體在進(jìn)化過(guò)程中已 經(jīng)利用了這一點(diǎn)。Anticalins是源自脂籠蛋白(lipocalin)支架、具有指定的結(jié)合特性(主要是對(duì) 于人源化抗體而言)的工程化人蛋白。脂籠蛋白包括160-180個(gè)氨基酸，與被4個(gè)環(huán)圍繞 的配體結(jié)合口袋一起形成錐狀beta-桶蛋白。小分子疏水化合物是脂籠蛋白的天然配體， 將該結(jié)合口袋中的殘基隨機(jī)化后，可以分離出具有新的化合物特異性的不同脂籠蛋白變體 (亦稱(chēng)為 “anticalins”)。單鏈或單域抗原受體包含單個(gè)可變區(qū)，并且比駱駝單域抗體(camelid single domain antibodies)小 20%。Phylomers是源自生物多樣化天然蛋白片段的肽。應(yīng)理解，術(shù)語(yǔ)“模塊抗體”，“免疫球蛋白”，“免疫球蛋白樣蛋白”還包括其衍生物。 衍生物是本發(fā)明一種或更多種模塊抗體的任意組合，和/或是融合蛋白，其中本發(fā)明模塊 抗體的任意結(jié)構(gòu)域或迷你結(jié)構(gòu)域(minodomain)可以在一種或多種其它蛋白(諸如其它的 模塊抗體，免疫球蛋白，配體，支架蛋白，酶，毒素等等)的任意位置融合。本發(fā)明模塊抗體的衍生物還可以通過(guò)各種化學(xué)技術(shù)關(guān)聯(lián)或結(jié)合其它物質(zhì)來(lái)獲得，所述技術(shù)諸如共價(jià)偶聯(lián)， 靜電相互作用，雙硫醚鍵等等。結(jié)合免疫球蛋白的其它物質(zhì)可以是脂質(zhì)，碳水化合物，核酸， 有機(jī)和無(wú)機(jī)分子或其任意組合(例如PEG，前體藥物或藥物)。衍生物還包括具有相同的氨 基酸序列但完全或部分從非天然的或化學(xué)修飾的氨基酸制備的抗體。術(shù)語(yǔ)衍生物還包括片 段和功能等價(jià)物。優(yōu)選的衍生物仍然是在靶結(jié)合和細(xì)胞毒活性兩方面都具有功能的那些。本發(fā)明的“結(jié)構(gòu)環(huán)”或“非CDR環(huán)”應(yīng)以下列方式理解模塊抗體，免疫球蛋白或免 疫球蛋白樣物質(zhì)由具有所謂免疫球蛋白折疊的結(jié)構(gòu)域組成。實(shí)質(zhì)上，反平行beta片層由環(huán) 連接形成緊湊的反平行beta桶。在可變區(qū)中，這些結(jié)構(gòu)域的一些環(huán)對(duì)抗體的特異性(即通 過(guò)抗體的天然結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合抗原)具有實(shí)質(zhì)上的貢獻(xiàn)。這些環(huán)被稱(chēng)為⑶R-環(huán)。⑶R環(huán)位 于⑶R環(huán)區(qū)內(nèi)，其在一些情況下還可以包括靠近⑶R環(huán)的可變框架區(qū)(稱(chēng)為“VFR”)。已知 VFR的一些環(huán)對(duì)抗體的抗原結(jié)合口袋(其通常主要由⑶R環(huán)確定)有貢獻(xiàn)。因此，那些VFR 環(huán)被認(rèn)為是CDR環(huán)區(qū)的一部分，不適合用于產(chǎn)生新的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？乖Y(jié)合口袋或CDR 環(huán)區(qū)以外的環(huán)通常稱(chēng)為結(jié)構(gòu)環(huán)或非-⑶R-環(huán)。與⑶R環(huán)區(qū)之中或靠近⑶R環(huán)的那些VFR不 同，可變區(qū)VFR的其它環(huán)被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)環(huán)、且尤其適用于本發(fā)明。這些優(yōu)選是與⑶R環(huán)區(qū)相 對(duì)，或位于免疫球蛋白可變區(qū)C端一側(cè)的VFR的結(jié)構(gòu)環(huán)。恒定區(qū)在結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)之中具有結(jié)構(gòu) 環(huán)，例如，在抗體結(jié)構(gòu)域C端一側(cè)，或在N端一側(cè)，甚至在抗體結(jié)構(gòu)域的側(cè)鏈之中。恒定區(qū)也 稱(chēng)框架區(qū)的組成部分。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”或“靶”將特別包括能夠被模塊抗體的結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別的 所有抗原和靶分子。被本發(fā)明分子的靶向的特別優(yōu)選抗原是以下抗原或分子，其已經(jīng)被證 明是或能夠是免疫上或治療上相關(guān)的，尤其是臨床功效已經(jīng)得到驗(yàn)證的那些。本文使用的術(shù)語(yǔ)“靶”或“抗原”將尤其包括選自以下的分子變應(yīng)原，腫瘤相關(guān)抗 原，自體抗原包括細(xì)胞表面受體，酶，F(xiàn)c-受體，F(xiàn)cfoi，HSA，IgG，白介素或細(xì)胞因子，補(bǔ)體系統(tǒng) 的蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，血清分子，細(xì)菌抗原，真菌抗原，原生動(dòng)物抗原和病毒抗原，以及引起傳 染性海綿狀腦炎(TSE)的分子，如感染性或非感染性朊病毒(prion)，和與炎性病癥有關(guān)的 標(biāo)記物或分子如促炎因子，多發(fā)性硬化或阿爾茨海默爾病，或半抗原。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞表面抗原”將包括能夠被細(xì)胞表面的抗體結(jié)構(gòu)和這類(lèi)分子的片段識(shí)別 的所有抗原。優(yōu)選細(xì)胞表面抗原是以下抗原，其已經(jīng)被證明是或能夠是免疫或治療上相關(guān) 的，尤其是臨床前或臨床功效已經(jīng)得到驗(yàn)證的那些。對(duì)于本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)，調(diào)節(jié)細(xì)胞殺傷 活性的那些細(xì)胞表面分子是特別適合的。當(dāng)本發(fā)明的免疫球蛋白優(yōu)選結(jié)合所述細(xì)胞表面分 子中的至少兩種時(shí)，免疫系統(tǒng)引起細(xì)胞裂解或細(xì)胞死亡，從而提供攻擊人細(xì)胞的有效工具 (means) 0抗原作為完整靶分子或這類(lèi)分子的片段被識(shí)別，所述片段尤其是通稱(chēng)為表位的靶 的子結(jié)構(gòu)(substructure)。只要它們是免疫上相關(guān)的(即還可以被天然的或單克隆的抗體 識(shí)別)，抗原子結(jié)構(gòu)就被通稱(chēng)為“表位”(例如B細(xì)胞表位，T細(xì)胞表位)。根據(jù)本發(fā)明在本 文使用的術(shù)語(yǔ)“表位”應(yīng)尤其指，完全組成針對(duì)本發(fā)明模塊抗體或免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的特 異性結(jié)合伴侶或者是其一部分的分子結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“表位”還可以指半抗原?；瘜W(xué)上，表位可 以由碳水化合物，肽，脂肪酸，有機(jī)物、生化物質(zhì)或無(wú)機(jī)物或其衍生物及其任意組合組成。若 表位是多肽，其通常包括至少3個(gè)氨基酸，優(yōu)選8-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選約10-20個(gè)氨基酸。 在肽的長(zhǎng)度方面沒(méi)有關(guān)鍵上限，其可以包括幾乎全長(zhǎng)的蛋白多肽序列。表位可以是線性表位或構(gòu)象性表位。線性表位由多肽鏈一級(jí)序列的單個(gè)片段組成。線性表位可以是連續(xù)或重 疊的。構(gòu)象性表位由因多肽折疊成三級(jí)結(jié)構(gòu)而聚在一起的氨基酸組成，這些氨基酸在線性 序列中彼此不必鄰接。具體來(lái)說(shuō)，表位是與診斷相關(guān)的分子的至少一部分，即樣品中表位的 有無(wú)，與患者的疾病或健康狀態(tài)，或與生產(chǎn)中的加工狀態(tài)，或與環(huán)境狀況和食品狀況，有定 性或定量的關(guān)系。表位還可以是與治療相關(guān)的分子的至少一部分，即可以被改變疾病進(jìn)程 的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶定的分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合(specifically binds或specific binding)”是 指一種結(jié)合反應(yīng)，其不同分子組成的群體中確定相關(guān)的(cognate)目標(biāo)配體。因此，在指定 條件(例如免疫分析條件)下，模塊抗體結(jié)合其特定靶，而不以高水平結(jié)合樣品中的其它分 子。特異性結(jié)合表示，根據(jù)所選的靶的特性，高、中或低水平的結(jié)合親和力或親合力，結(jié)合是 選擇性的。當(dāng)結(jié)合常數(shù)或結(jié)合動(dòng)力學(xué)有至少10倍的差異，優(yōu)選至少100倍的差異，更優(yōu)選 至少1000倍時(shí)，通常可以實(shí)現(xiàn)選擇性結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)系統(tǒng)”是指核酸分子，其中包含所需編碼序列和調(diào)控序列，它們可操作 相連，使得被這些序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主能夠產(chǎn)生所編碼的蛋白。為了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，表達(dá)系統(tǒng) 可以包括在載體上；但相關(guān)DNA隨后也可整合到宿主染色體中。備選地，表達(dá)系統(tǒng)可以用于 體外轉(zhuǎn)錄/翻譯。免疫球蛋白氨基酸序列的所有編號(hào)是根據(jù)IMGT編號(hào)方案(IMGT，the international ImMunoGeneTics, Lefranc et al. , 1999, Nucleic Acids Res.27 209-212)。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合劑”或“配體”是指結(jié)合對(duì)的一員，尤其是有可 能作為針對(duì)結(jié)合伴侶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合多肽。結(jié)合伴侶的實(shí)例包括具有功能性相互作用 的成對(duì)結(jié)合劑，如受體與配體結(jié)合，抗體與抗原或受體結(jié)合，藥物與靶結(jié)合，以及酶與底物
纟口口。用于本發(fā)明目的的術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”或“嵌合融合蛋白”應(yīng)是指，由基因包，外表面 結(jié)構(gòu)的至少一部分(諸如外殼蛋白)，可選還有接頭序列，以及結(jié)合劑組成的分子。融合蛋 白由載體編碼，所述載體有結(jié)合劑的基因和在基因包表面展示一個(gè)拷貝的結(jié)合劑的信息。用于本發(fā)明目的的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒活性(cytotoxic或cytotoxic activity) ”應(yīng)是 指，抗細(xì)胞抗原的任何特異性分子，它們與抗原結(jié)合后，激活補(bǔ)體途徑或激活殺傷細(xì)胞，導(dǎo) 致細(xì)胞裂解或觸發(fā)凋亡。具體地，它是指效應(yīng)細(xì)胞引起細(xì)胞毒T細(xì)胞或介導(dǎo)以下活性的細(xì) 胞活化的活性，所述活性是，介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞型細(xì)胞毒性(ADCC)，補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 (⑶C)和/或細(xì)胞吞噬(ADCP)。它還指凋亡效應(yīng)，由此觸發(fā)程序性細(xì)胞死亡(P⑶)。本發(fā)明 的模塊抗體因此殺傷被抗體包裹的靶細(xì)胞，可選地通過(guò)與效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體結(jié)合或通過(guò) 誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡來(lái)完成?！爸Ъ堋睉?yīng)是指，構(gòu)建多肽的變體或所有組成成分時(shí)，用于支持多肽分子結(jié)構(gòu)的天 然或人工臨時(shí)框架。它通常是維持親代分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)或功能的多肽結(jié)構(gòu)域的模塊系統(tǒng)。 示例性支架是模塊抗體，其可以被誘變以在所述支架內(nèi)產(chǎn)生變體，從而獲得文庫(kù)。用于本發(fā)明目的的術(shù)語(yǔ)“支架配體”應(yīng)是指，與模塊抗體的支架或主鏈結(jié)合，從而 確定所述模塊抗體的分子結(jié)構(gòu)或基本功能和特異性的配體。在優(yōu)選情況下，支架配體是功 能性配體，通過(guò)結(jié)合來(lái)介導(dǎo)生物功能，象效應(yīng)配體一樣。在備選實(shí)施方案中，支架配體是功能性配體，其是被CDR區(qū)或結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)結(jié)合的特異性靶。相同的支架配體可以與模塊抗體的 多個(gè)變體結(jié)合，而與它們的靶特異性無(wú)關(guān)。通常，支架配體結(jié)合位點(diǎn)的存在提示變體被表達(dá) 并且正確折疊。因此，支架配體與其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合提供一種從多肽的所有組成成分預(yù)選 (preselecting)、共選(coselecting)、鑒定和篩選功能性多肽的方法。設(shè)計(jì)模塊抗體的變 體使之保持對(duì)支架配體的結(jié)合特性，避免制備出無(wú)功能的變體，例如因引入基本上不能結(jié) 合任意靶或效應(yīng)配體的突變、折疊突變體或表達(dá)突變體所致。這類(lèi)無(wú)功能的突變體有時(shí)由 構(gòu)建多肽所有組成成分時(shí)的常規(guī)隨機(jī)化和變異步驟產(chǎn)生。提供與支架配體結(jié)合的功能性突 變體允許本領(lǐng)域技術(shù)人員制備富含功能性、良好折疊和高表達(dá)的庫(kù)成員的模塊抗體文庫(kù)。 例如，所述支架可以是親本Fab，且至少20 %，優(yōu)選至少30 %，更優(yōu)選至少40 %的親本Fab 變體與所述親本Fab的CDR-靶結(jié)合。用于本發(fā)明目的的術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)配體”應(yīng)是指，介導(dǎo)效應(yīng)子功能的配體，象效應(yīng)分子。 示例性的效應(yīng)配體是干擾免疫球蛋白的Fc受體或Fc受體樣分子。Fc受體是在一些細(xì)胞 (包括自然殺傷細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，和肥大細(xì)胞)表面發(fā)現(xiàn)的、負(fù)責(zé)免疫系統(tǒng)的保 護(hù)功能的蛋白。其名稱(chēng)來(lái)源于其對(duì)稱(chēng)為Fc (可結(jié)晶的片段)的抗體部分的結(jié)合特異性。Fc 受體結(jié)合那些與感染的細(xì)胞或侵入病原體粘附的抗體。它們的活性刺激吞噬細(xì)胞或細(xì)胞毒 細(xì)胞，通過(guò)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用(ADCP)或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，破 壞微生物或被感染的細(xì)胞。有數(shù)種不同類(lèi)型的Fc受體，根據(jù)它們識(shí)別的抗體類(lèi)型進(jìn)行分 類(lèi)；例如，結(jié)合IgG(最常見(jiàn)的抗體類(lèi)型)的那些被稱(chēng)為Fc-gamma受體(Fe Y R)，結(jié)合IgA 的那些被稱(chēng)為Fc-alpha受體(Fe α R)，結(jié)合IgE的那些被稱(chēng)為Fc-印siIon受體(Fe ε R)。 等同于效應(yīng)配體、并因此包括在該定義中的是，識(shí)別模塊抗體(諸如蛋白Α)內(nèi)相同或類(lèi)似 結(jié)合位點(diǎn)的任意替代配體。所有FcyRS都屬于免疫球蛋白超家族，是誘導(dǎo)吞噬已被調(diào)理(被包裹)的微生 物時(shí)最重要的Fc受體。該家族包括數(shù)個(gè)成員；例如Fc γ RI (⑶64)，F(xiàn)c γ RIIA(⑶32a)， Fc y RIIB (CD32b)，F(xiàn)c y RIIIA(CD 16a) ,FcyRIIIB (CD·)；它們因?yàn)椴煌姆肿咏Y(jié)構(gòu)而在 抗體親和力方面不同。例如，F(xiàn)c y RI對(duì)IgG的結(jié)合比Fc γ RII和Fc γ RIII更強(qiáng)，并具有由 3個(gè)免疫球蛋白(Ig)-樣結(jié)構(gòu)域組成的胞外部分，比Fc γ RII和Fc γ RIII多一個(gè)結(jié)構(gòu)域。 這些特性允許Fc y RI通過(guò)單個(gè)IgG分子(或單體)活化，而后兩種Fc γ受體必須結(jié)合免 疫復(fù)合物內(nèi)的多個(gè)IgG分子才能被活化。另一 FcR在多種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)，與MHC I類(lèi)分子結(jié)構(gòu)相似。該受體還結(jié)合IgG， 并與保護(hù)(preservation)該抗體有關(guān)。但是，因?yàn)樵揊c受體還參與IgG從母體通過(guò)胎盤(pán) 轉(zhuǎn)移到胎兒或通過(guò)在乳汁中轉(zhuǎn)移到吃母乳的嬰兒，所以它被稱(chēng)為新生兒Fc受體(Fcfoi)。最 近該受體已被顯示參與IgG血清水平的自穩(wěn)(homeostasis)?？贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力的一種機(jī)制，由此 免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞主動(dòng)裂解被特異性抗體結(jié)合的靶細(xì)胞。這是抗體作為體液免疫應(yīng)答的 一部分起限制和包含感染的作用的機(jī)制之一。典型的ADCC由自然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)；單 核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞也可以介導(dǎo)ADCC。例如嗜酸性粒細(xì)胞可以通過(guò)ADCC殺傷一些被稱(chēng) 為蠕蟲(chóng)(helminths)的寄生蟲(chóng)。ADCC屬于獲得性免疫應(yīng)答的組成部分，因?yàn)槠湟蕾囉谠谙?的抗體應(yīng)答。描述氨基酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)“外源”應(yīng)是指，新導(dǎo)入的氨基酸，它是天然的，但對(duì)修飾位點(diǎn)來(lái)說(shuō)是外來(lái)的，或者它是天然氨基酸的替代物。對(duì)于抗原結(jié)合位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，“外源”表示該抗原 結(jié)合位點(diǎn)不是該分子的特異性結(jié)合區(qū)天然形成的，而且，所述新修飾的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的是 外源結(jié)合伴侶，而不是該分子的天然結(jié)合伴侶。本文使用的術(shù)語(yǔ)“可變結(jié)合區(qū)”有時(shí)稱(chēng)“⑶R區(qū)”，是指具有能與抗原發(fā)生結(jié)合相互 作用的差異化結(jié)構(gòu)(varying structures)的分子。所述分子可以以其本來(lái)面目來(lái)使用，或 摻入更大的蛋白中，由此形成這類(lèi)蛋白的具有結(jié)合功能的特異性區(qū)域。所述差異化結(jié)構(gòu)可 以來(lái)源于結(jié)合蛋白(如免疫球蛋白或phylomers)的天然所有組成成分，或來(lái)源于合成的多 樣性，包括重復(fù)蛋白，avimers和anticalins。所述差異化結(jié)構(gòu)還可以通過(guò)隨機(jī)化技術(shù)產(chǎn) 生，尤其是本文描述的那些。這些包括，經(jīng)誘變的CDR或非CDR區(qū)，免疫球蛋白可變區(qū)或恒 定區(qū)的環(huán)區(qū)。在特異性位點(diǎn)具有不同修飾的修飾性結(jié)合劑被稱(chēng)作“變體”。支架的變體優(yōu)選被歸 為一組，形成結(jié)合劑的文庫(kù)，其可用于選出具有預(yù)定功能的文庫(kù)成員。據(jù)此，抗體序列優(yōu)選 通過(guò)例如誘變方法進(jìn)行隨機(jī)化。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，結(jié)合劑的環(huán)區(qū)，諸如包含一個(gè)或多個(gè) 環(huán)內(nèi)位置、或位于末端位置、可能對(duì)結(jié)合位點(diǎn)有貢獻(xiàn)的親本抗體序列，優(yōu)選被突變或修飾以 產(chǎn)生文庫(kù)，優(yōu)選通過(guò)隨機(jī)、半隨機(jī)或尤其是通過(guò)定點(diǎn)隨機(jī)誘變法，尤其是刪除、交換或引入 隨機(jī)生成的插入序列至多個(gè)環(huán)中或環(huán)區(qū)域內(nèi)，優(yōu)選至CDR環(huán)區(qū)或結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)，其可能包括末 端序列，它們位于抗體域或結(jié)構(gòu)的一個(gè)末端。另外優(yōu)選的是應(yīng)用組合方法。可以使用任一種的已知誘變方法，其中包括盒誘變 (cassette mutagenesis)。這些方法可用于在本發(fā)明免疫球蛋白的目標(biāo)位置進(jìn)行氨基酸修 飾。在一些情況下，位置是隨機(jī)選擇的，例如利用任意可能的氨基酸或選出優(yōu)選的氨基酸以 將環(huán)序列隨機(jī)化，或利用簡(jiǎn)化規(guī)則進(jìn)行氨基酸變化。例如所有殘基優(yōu)選可以突變?yōu)樘囟ò?基酸，諸如丙氨酸，這稱(chēng)為氨基酸掃描或丙氨酸掃描。這類(lèi)方法可以伴隨更復(fù)雜的工程化方 法，后者使用選擇法來(lái)篩選更高水平的序列多樣性。本發(fā)明的分子量小于60kD或最多為60kD的細(xì)胞毒模塊抗體比全長(zhǎng)抗體要小。優(yōu) 選的大小是最多^kD。模塊抗體單個(gè)結(jié)構(gòu)域通常具有10-15kD的分子大小，因此基于4個(gè) 模塊抗體結(jié)構(gòu)域或由4個(gè)所述域組成的分子具有40-60kD的大小，這取決于糖基化或任何 額外偶聯(lián)的藥理學(xué)活性物質(zhì)，例如毒素或肽。優(yōu)選形式是由模塊抗體結(jié)構(gòu)域組成的寡聚體，優(yōu)選最多4個(gè)結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選3個(gè)結(jié) 構(gòu)域，更優(yōu)選基于2個(gè)結(jié)構(gòu)域，所述寡聚體優(yōu)選包含異二聚體如Fab，或同二聚體如Fe?；?于5個(gè)模塊抗體結(jié)構(gòu)域或更多的組合的形式通常被認(rèn)為不具有小型抗體片段的特別優(yōu)勢(shì)， 即易于在各種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和穿透組織的優(yōu)勢(shì)。提供本發(fā)明優(yōu)選模塊抗體作為單域抗體是可行的。但是，抗體結(jié)構(gòu)域在表達(dá)時(shí)傾 向于二聚化，成為同二聚體(例如Fe)或異二聚體(例如Fab)。二聚結(jié)構(gòu)因此被認(rèn)為是提 供穩(wěn)定分子的基礎(chǔ)。優(yōu)選的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域二聚體選自單域二聚體，例如VH/VL，CHl/ CL (kappa或lambda)，CH2/CH2和CH3/CH3。模塊抗體結(jié)構(gòu)域的二聚體或寡聚體還可以為單 鏈或雙鏈分子，尤其是將一個(gè)結(jié)構(gòu)域的C端連結(jié)到另一結(jié)構(gòu)域的N端的那些。結(jié)合伴侶(binding partner)是通常通過(guò)非共價(jià)相互作用彼此特異性結(jié)合的試 劑。結(jié)合伴侶的實(shí)例包括具有功能性相互作用的成對(duì)結(jié)合劑，諸如受體結(jié)合配體，抗體結(jié)合 抗原，藥物結(jié)合靶，酶結(jié)合底物。結(jié)合伴侶已在多個(gè)治療、診斷、分析和工業(yè)用途中得到應(yīng)用。最重要的結(jié)合對(duì)是抗體或免疫球蛋白，其片段或衍生物。在大多數(shù)情況下需要這類(lèi)結(jié) 合劑的結(jié)合來(lái)介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)或功能，即“功能性相互作用”。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，細(xì)胞毒模塊抗體是結(jié)合劑，其是人或小鼠來(lái)源的免 疫球蛋白，可用于各種目的，尤其是用于藥物組合物。當(dāng)然，修飾的免疫球蛋白也可以是人 源化或嵌合的免疫球蛋白。結(jié)合劑(為人免疫球蛋白)優(yōu)選選自或源自IgAl，IgA2，IgD, IgE, IgGl，IgG2， IgG3，IgG4和IgM。小鼠免疫球蛋白結(jié)合劑優(yōu)選選自或源自IgA, IgD, IgE, IgGl, IgG2A， IgG2B, IgG2C, IgG3 和 IgM。這類(lèi)結(jié)合劑優(yōu)選包括重鏈和/或輕鏈或其部分。本發(fā)明修飾的免疫球蛋白可以包 括重鏈和/或輕鏈，至少一個(gè)可變區(qū)和/或恒定區(qū)，或其包括迷你結(jié)構(gòu)域的部分。恒定區(qū)是免疫球蛋白分子恒定部分的免疫球蛋白折疊單位，也稱(chēng)為恒定區(qū)的結(jié)構(gòu) 域(例如 CHl，CH2, CH3, CH4, Ck, Cl)?？勺儏^(qū)是免疫球蛋白可變部分的免疫球蛋白折疊單位，也稱(chēng)為可變區(qū)的結(jié)構(gòu)域 (例如 Vh, Vk, VI, Vd) O本發(fā)明的示例性模塊抗體由選自具有至少一個(gè)環(huán)區(qū)的CH1，CH2，CH3，CH4，Igk-C, Igl-C，其組合、衍生物或包括迷你結(jié)構(gòu)域的部分組成，其特征在于所述至少一個(gè)環(huán)區(qū)包括 至少一個(gè)氨基酸修飾以形成至少一個(gè)修飾的環(huán)區(qū)，其中所述至少一個(gè)修飾的環(huán)區(qū)特異性結(jié) 合抗原的至少一個(gè)表位。本發(fā)明的另一模塊抗體可以由具有至少一個(gè)環(huán)區(qū)的重鏈或輕鏈的可變區(qū)、其組 合、衍生物或其包括迷你結(jié)構(gòu)域的部分組成，其特征在于所述至少一個(gè)環(huán)區(qū)包括至少一個(gè) 氨基酸修飾以形成至少一個(gè)修飾的環(huán)區(qū)，其中所述至少一個(gè)修飾的環(huán)區(qū)特異性結(jié)合抗原的 至少一個(gè)表位。本發(fā)明的模塊抗體可以包括一個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域(例如至少2，3，4，5，6，10個(gè)結(jié) 構(gòu)域)。如果模塊抗體中存在不止一個(gè)結(jié)構(gòu)域，則這些結(jié)構(gòu)域可以是相同的類(lèi)型或不同的類(lèi) 型(例如CH1-CH1-CH2，CH3-CH3，(CH2)2-(CH3)2，有或者沒(méi)有鉸鏈區(qū))。當(dāng)然單個(gè)結(jié)構(gòu)域的 排列順序也可以是任意(例如CH1-CH3-CH2，CH4-CH1-CH3-CH2)。本發(fā)明優(yōu)選涉及抗體的部分，諸如IgG，IgA, IgM, IgD, IgE等等的部分。本發(fā)明的 模塊抗體也可以是功能性抗體片段諸如Fab，F(xiàn)ab2, scFv, Fv, Fe, Fcab ，抗原結(jié)合性Fe，或 其部分，或免疫球蛋白的其它衍生物或組合諸如minibodies，可變區(qū)重鏈和輕鏈的結(jié)構(gòu)域 (諸如dAb，F(xiàn)d, VL，包括Vlambda和Vkappa，VH, VHH)以及由至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)環(huán)連接的免疫 球蛋白區(qū)兩條beta-鏈組成的迷你結(jié)構(gòu)域，作為分離的結(jié)構(gòu)域或在天然結(jié)合的分子的群體 中。本發(fā)明的具體實(shí)施方案涉及抗體分子的Fc片段，作為通過(guò)修飾氨基酸序列而形成的抗 原結(jié)合性Fc片段(Fcab )，或作為受體、肽或其它抗原結(jié)合模塊(諸如scFv)的偶聯(lián)物或 融合體。模塊抗體可以作為分離的多肽或組合分子使用，例如通過(guò)與其它肽或多肽重組、 融合或偶聯(lián)的技術(shù)。所述肽優(yōu)選與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域序列同源，優(yōu)選至少5個(gè)氨基酸長(zhǎng)，更 優(yōu)選至少10或甚至至少50或100個(gè)氨基酸長(zhǎng)，并至少部分構(gòu)成免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)。 優(yōu)選的結(jié)合特征涉及預(yù)先確定的表位結(jié)合、親和力和親合力。本發(fā)明的模塊抗體還可進(jìn)一步與一個(gè)或更多個(gè)修飾的模塊抗體或未修飾的模塊抗體或其部分組合以獲得組合模塊抗體。組合優(yōu)選通過(guò)重組技術(shù)獲得，還可以通過(guò)吸附、靜 電相互作用等等或通過(guò)有或沒(méi)有接頭的偶聯(lián)或化學(xué)結(jié)合來(lái)獲得。優(yōu)選的接頭序列是天然接 頭序列或功能上合適的人工序列。通常本發(fā)明的模塊抗體可以用做結(jié)構(gòu)單元(building block)，以便與其它模塊抗 體或生物活性物質(zhì)或分子在分子水平組合。優(yōu)選將至少一個(gè)通過(guò)可變或非可變序列(例如 結(jié)構(gòu)環(huán))與特定伴侶結(jié)合的抗體與至少一個(gè)其它結(jié)合分子(其可以是抗體，抗體片段，可溶 性受體，配體或另一抗體結(jié)構(gòu)域，或其結(jié)合模塊)在分子水平組合。其它組合涉及蛋白性質(zhì) 的分子，核酸，脂質(zhì)，有機(jī)分子和碳水化合物。本發(fā)明的工程化分子可以作為獨(dú)立的蛋白，以及融合蛋白或衍生物來(lái)用，最常 見(jiàn)的是，在修飾之前或之后融合，以成為更大的結(jié)構(gòu)(例如完整抗體分子或其部分)的 部分。根據(jù)本發(fā)明制得的免疫球蛋白或融合蛋白因此也包含F(xiàn)c片段，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)v片 段，單鏈抗體，尤其單鏈Fv片段，雙特異性或多特異性scFv，雙價(jià)體(diabodies)，單價(jià)體 (unibodies)，多價(jià)體(multibodies)，多價(jià)或多聚的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域及其它。有可能利用 工程化的蛋白產(chǎn)生單特異性、雙特異性、三特異性和甚至同時(shí)載有更多特異性的分子。通過(guò) 恩發(fā)明，還可根據(jù)這類(lèi)分子的計(jì)劃用途的要求同時(shí)控制和預(yù)選結(jié)合的效價(jià)。根據(jù)本發(fā)明，模塊抗體可選的具有針對(duì)抗原的一個(gè)或更多個(gè)結(jié)合區(qū)，包括特異性 結(jié)合細(xì)胞表面靶的結(jié)合位點(diǎn)和介導(dǎo)效應(yīng)子功能的結(jié)合位點(diǎn)。針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)抗原的抗原 結(jié)合位點(diǎn)可以由CDR區(qū)或任意其它天然受體結(jié)合結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)，或可以被導(dǎo)入可變區(qū)或恒定區(qū) 結(jié)構(gòu)的抗體結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)。用于檢測(cè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合特性的抗原可以是天然存在的分子 或化學(xué)合成的分子或重組分子，其可以位于溶液或懸浮液中，例如位于顆粒(諸如固相)上 或顆粒(諸如固相)中，在細(xì)胞上或細(xì)胞中或病毒表面。優(yōu)選免疫球蛋白與抗原的結(jié)合在 該抗原仍然粘附或結(jié)合天然狀態(tài)下的分子和結(jié)構(gòu)時(shí)來(lái)測(cè)定。從而有可能鑒定和獲得最適于 診斷或治療用途的那些修飾的免疫球蛋白。模塊抗體或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾(本文術(shù)語(yǔ)免疫球蛋白 和抗體可以互換使用)，所述修飾優(yōu)選在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、或其末端序列(優(yōu)選C-端序 列)部分、和/或其包含環(huán)(CDR-環(huán)或非-CDR環(huán))的環(huán)區(qū)部分進(jìn)行，結(jié)構(gòu)環(huán)是優(yōu)選的修飾 或誘變位點(diǎn)。根據(jù)具體實(shí)施方案，結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)也包括末端序列，其負(fù)責(zé)抗原結(jié)合。在一些情況 下，優(yōu)選使用指定的經(jīng)修飾的結(jié)構(gòu)環(huán)或結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)或其部分，作為用于結(jié)合或組合目的的分 離的分子。尤其優(yōu)選本發(fā)明的模塊抗體通過(guò)結(jié)構(gòu)環(huán)和/或⑶R環(huán)的至少一部分結(jié)合所述細(xì)胞
表面靶。在備選實(shí)施方案中，優(yōu)選本發(fā)明的模塊抗體通過(guò)結(jié)構(gòu)環(huán)和/或⑶R環(huán)的至少一部 分結(jié)合所述效應(yīng)配體，或這類(lèi)效應(yīng)配體的替代配體，例如蛋白A，從而介導(dǎo)效應(yīng)子功能。在優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合劑利用其天然或修飾的結(jié)合結(jié)構(gòu)，或新形成的結(jié)合位點(diǎn)， 與相同抗原或不同抗原的至少兩個(gè)這類(lèi)表位(彼此相同或不同)特異性結(jié)合。在結(jié)合劑的優(yōu)選域結(jié)構(gòu)中，優(yōu)選修飾或隨機(jī)化模塊抗體的至少一個(gè)環(huán)區(qū)或末端 區(qū)，導(dǎo)致一個(gè)或更多個(gè)核苷酸或氨基酸的取代、缺失和/或插入，優(yōu)選點(diǎn)突變，或甚至全環(huán) 的交換，更優(yōu)選改變至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15，最多30個(gè)氨基酸。由此 修飾的序列包括未包含在環(huán)的保守區(qū)內(nèi)的氨基酸，新導(dǎo)入的氨基酸(是天然存在的，但對(duì)改造位點(diǎn)來(lái)說(shuō)是外源的)，或是天然氨基酸的取代。但是，插入結(jié)合劑環(huán)區(qū)的氨基酸最大數(shù)目?jī)?yōu)選不超過(guò)30，優(yōu)選25，更優(yōu)選最多20 個(gè)氨基酸。氨基酸的取代和插入優(yōu)選通過(guò)本領(lǐng)域已知的和本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)的方法，使用所 有可能的氨基酸或用于隨機(jī)化目的篩選的優(yōu)選氨基酸隨機(jī)或半隨機(jī)進(jìn)行。修飾位點(diǎn)可以位于特定的單個(gè)環(huán)或環(huán)區(qū)，尤其是結(jié)構(gòu)環(huán)或結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)。環(huán)區(qū)通常由 至少兩個(gè)，優(yōu)選至少3個(gè)或至少4個(gè)彼此鄰接的環(huán)組成，它們可能通過(guò)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)或 抗原結(jié)合口袋而負(fù)責(zé)結(jié)合抗原。優(yōu)選一個(gè)或更多個(gè)修飾位點(diǎn)位于10個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)，更 優(yōu)選位于20，30，40，50，60，70，80，90直至100個(gè)氨基酸內(nèi)，尤其是結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，以形成使抗原 可以空間上接近環(huán)區(qū)的表面或口袋。在這方面，優(yōu)選修飾在CH1、CH2、CH3和CH4的環(huán)區(qū)中進(jìn)行，尤其是以下范圍氨基 酸7-21，氨基酸25-39，氨基酸41-81，氨基酸83-85，氨基酸89-103和氨基酸106-117，或者 在末端序列中，優(yōu)選在與抗體結(jié)構(gòu)域的C-端或N-端相距6個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，包括氨基酸92-98的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的改造與包括氨基酸8-20 的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的改造組合。上述鑒定的相應(yīng)免疫球蛋白的氨基酸區(qū)包括待改造的環(huán)區(qū)。優(yōu)選，包括氨基酸 92-98的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的改造與一個(gè)或更多個(gè)其它結(jié)構(gòu)環(huán)中的改造組合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，包括氨基酸92-98的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的改造與包括氨基酸 41-45. 2的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的改造組合。最優(yōu)選包括氨基酸92-98，氨基酸41-45. 2和氨基酸8_20的各個(gè)結(jié)構(gòu)環(huán)中的每一 個(gè)包含至少一個(gè)氨基酸改造。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，包括氨基酸92-98，氨基酸41-45. 2，和氨基酸8_20的各 個(gè)結(jié)構(gòu)環(huán)中的每一個(gè)包含至少一個(gè)氨基酸改造。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，位于CH3 的 15-17，29-34,41-45. 2，84-85，92-100，和 / 或 108-115位的氨基酸殘基被改造。優(yōu)選人來(lái)源Igk-C和IgI-C的改造在環(huán)區(qū)的以下區(qū)域進(jìn)行氨基酸8-20，氨基酸 26-36,氨基酸41-82，氨基酸83-88，氨基酸92-100，氨基酸107-1M和氨基酸123-126，或 者在末端序列中，優(yōu)選在與抗體結(jié)構(gòu)域的C-端或N-端相距6個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。優(yōu)選小鼠來(lái)源Igk-C和IgI-C的環(huán)區(qū)改造在以下區(qū)域的位置進(jìn)行氨基酸8-20， 氨基酸沈-36，氨基酸43-79，氨基酸83-85，氨基酸90-101，氨基酸108-116和氨基酸 122-126。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選用作治療劑的另一優(yōu)選免疫球蛋白，由具有至少一個(gè)環(huán)區(qū)(優(yōu)選 結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū))的重鏈、或輕鏈、或其包含迷你結(jié)構(gòu)域的部分的可變區(qū)組成，其特征在于所述至 少一個(gè)環(huán)區(qū)包括至少一個(gè)氨基酸修飾以形成至少一個(gè)修飾環(huán)區(qū)，其中所述至少一個(gè)修飾的 環(huán)區(qū)形成如上所述的相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，本發(fā)明優(yōu)選使用的免疫球蛋白可以包含位于可變區(qū)內(nèi)的 改造，所述可變區(qū)選自VH，Vkappa，Vlambda，VHH和其組合。更具體地，它們包含至少一個(gè)修 飾，所述修飾位于氨基酸7-22，氨基酸39-55，氨基酸66-79，氨基酸77-89或氨基酸89-104 內(nèi)(其中結(jié)構(gòu)域氨基酸位置的編號(hào)是IMGT編號(hào))，或者位于末端序列中，優(yōu)選在與抗體結(jié)構(gòu) 域的C-端或N-端相距6個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明優(yōu)選使用的免疫球蛋白的特征在于，人來(lái)源VH 或Vkappa或Vlambda的環(huán)區(qū)包括位于氨基酸7-22，氨基酸43-51，氨基酸67-77，氨基酸 77-88，和氨基酸89-104，最優(yōu)選氨基酸12-17位，氨基酸45-50位，氨基酸68-77位，氨基酸 79-88，和氨基酸92-99位內(nèi)的至少一個(gè)修飾，其中結(jié)構(gòu)域氨基酸位置的編號(hào)是IMGT編號(hào)。作為可能選出用于修飾的人來(lái)源免疫球蛋白可變區(qū)的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)，優(yōu)選位于以下區(qū) 域氨基酸8-20，氨基酸44-50，氨基酸67-76，氨基酸78-87，和氨基酸89-101，或者位于末 端序列中，優(yōu)選在與抗體結(jié)構(gòu)域的C-端或N-端相距6個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，作為可能篩選用于改造目的的小鼠來(lái)源免疫球蛋白可變區(qū)的 結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)優(yōu)選位于以下區(qū)域氨基酸6-20，氨基酸43-52，氨基酸67-79，氨基酸79-87，和氨 基酸91-100，或者在末端序列中，優(yōu)選在與抗體結(jié)構(gòu)域的C-端或N-端相距6個(gè)氨基酸的范 圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選用作治療劑的免疫球蛋白還可以是駱駝來(lái)源。駱駝抗體只包括一 條重鏈，與由輕鏈和重鏈組成的正常抗體具有相同的抗原親和力。因此駱駝抗體比例如人 抗體小得多，這允許它們穿透嚴(yán)密的組織到達(dá)抗原，而更大的蛋白無(wú)法到達(dá)。此外，在臨床 重要化合物的設(shè)計(jì)、生產(chǎn)或應(yīng)用中，駱駝的重鏈抗體比普通抗體具有優(yōu)勢(shì)相對(duì)較簡(jiǎn)單，高 親和力和特異性以及到達(dá)活性位點(diǎn)并與其相互作用的潛力。根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案，駱駝來(lái)源的模塊抗體或免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)被 改造，例如在VHH內(nèi)，在氨基酸7-19，氨基酸43-55，氨基酸68-76，氨基酸80-87和氨基酸 91-101的區(qū)域內(nèi)，或者在末端序列中，優(yōu)選在與抗體結(jié)構(gòu)域的C-端或N-端相距6個(gè)氨基酸 的范圍內(nèi)。本發(fā)明優(yōu)選的產(chǎn)生模塊抗體的方法涉及，改造模塊抗體(其特異性結(jié)合至少一個(gè) 第一表位，并在結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)內(nèi)的至少兩個(gè)位點(diǎn)或環(huán)的每一個(gè)中包含修飾)，并確定所述結(jié)構(gòu)環(huán) 區(qū)與至少一個(gè)第二表位的特異性結(jié)合，其中未改造的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)(非⑶R區(qū))不與所述至少 一個(gè)第二表位特異性結(jié)合。因此，對(duì)第一抗原特異的抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)可以通過(guò)以下方 式改進(jìn)添加抗第二抗原的另一效價(jià)或特異性(其特異性可以是相同的，針對(duì)不同表位或 相同表位)，以增加效價(jià)或獲得雙特異性、寡特異性或多特異性分子。另一方面優(yōu)選使用包含與效應(yīng)分子或免疫細(xì)胞相互作用的天然結(jié)構(gòu)的模塊抗體， 優(yōu)選與效應(yīng)配體結(jié)合。所述天然結(jié)構(gòu)保持不變或?yàn)榱嗽鰪?qiáng)效應(yīng)子功能而進(jìn)行改造。針對(duì)例 如Fc受體的結(jié)合位點(diǎn)被描述位于CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域區(qū)，可以通過(guò)公知的技術(shù)進(jìn)行誘變。ADCC，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性，是通過(guò)具有識(shí)別結(jié)合抗體恒定區(qū)的Fc 受體的細(xì)胞對(duì)抗體包被的靶細(xì)胞的殺傷。大部分ADCC由在其表面具有Fc受體FcgammaRlII 或CD16的NK細(xì)胞介導(dǎo)。典型分析法使用靶細(xì)胞，例如Ramos細(xì)胞，在添加新分離的效應(yīng)細(xì) 胞前與系列稀釋的抗體溫育。然后將ADCC分析物進(jìn)一步溫育數(shù)小時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞毒活性％。 通常靶效應(yīng)物比例為約1 16，但可以是1 1直至1 50。補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)是一種殺傷細(xì)胞的機(jī)制，其中與靶細(xì)胞表面結(jié)合的抗 體固定補(bǔ)體，導(dǎo)致組裝膜攻擊復(fù)合物，其在靶細(xì)胞膜上穿孔，導(dǎo)致隨后細(xì)胞裂解。常規(guī)使用 的CDC分析法按照ADCC測(cè)定法的相同步驟，但是，利用包含補(bǔ)體的血清代替效應(yīng)細(xì)胞。本發(fā)明模塊抗體的細(xì)胞毒活性經(jīng)ADCC或CDC分析法測(cè)定，當(dāng)與對(duì)照相比細(xì)胞裂解 百分比顯著增加時(shí)，證明有細(xì)胞毒活性。與ADCC或CDC相關(guān)的細(xì)胞毒活性優(yōu)選測(cè)量的是絕對(duì)百分比的增長(zhǎng)，其優(yōu)選高于5 %，更優(yōu)選高于10 %，甚至更優(yōu)選高于20 %?？贵w依賴性細(xì)胞吞噬作用，即ADCP (有時(shí)稱(chēng)為ADPC)，通常與培養(yǎng)的人細(xì)胞的細(xì)胞 裂解一起被研究?？梢匀缦麓_定抗體介導(dǎo)的吞噬細(xì)胞(通常人單核細(xì)胞或單核細(xì)胞來(lái)源的 巨噬細(xì)胞)的吞噬。可以將純化的單核細(xì)胞與細(xì)胞因子一起培養(yǎng)以增強(qiáng)Fc γ Rs的表達(dá)或 誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞。然后用靶細(xì)胞進(jìn)行ADCP和ADCC分析。測(cè)定吞噬作用，表示為通過(guò) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的陽(yáng)性細(xì)胞百分比。通過(guò)吞噬細(xì)胞對(duì)抗體-抗原復(fù)合物的顯著攝取，證明 陽(yáng)性ADCP活性。與ADCP相關(guān)的細(xì)胞毒活性優(yōu)選測(cè)量的是吞噬細(xì)胞攝取抗體-抗原復(fù)合物 的絕對(duì)百分比，其優(yōu)選高于5 %，更優(yōu)選高于10 %，甚至更優(yōu)選高于20 %。在典型分析法中，將PBMC或單核細(xì)胞或單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞，按照IX IO5活 細(xì)胞的濃度，重懸于96孔板的RF2培養(yǎng)基(添加2% FCS的RPMI 1640)中，IOOml/孔。表 達(dá)靶抗原(例如Her2/neu抗原)的相應(yīng)靶細(xì)胞，以及SKBR3細(xì)胞，利用PKH2綠色熒光染料 染色。隨后將1 X 104PKH2-標(biāo)記的靶細(xì)胞和不同濃度(例如1-100 μ g/ml)的Her 2特異性 (IgGl)抗體(或模塊抗體)或小鼠IgGl同種型對(duì)照(或模塊抗體對(duì)照)添加到PBMCs的 孔中，在200ml的終體積中37°C溫育M小時(shí)。溫育后，利用EDTA-PBS收集PBMCs或單核細(xì) 胞或單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞和靶細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到96孔V形底的板。將板離心并吸出上 清。細(xì)胞用IOOml偶聯(lián)RPE的抗⑶lib、抗⑶14和人IgG的混合物復(fù)染，混合后在冰上溫育 60分鐘。清洗細(xì)胞，并用2%甲醛-PBS固定。在最適門(mén)控條件下，利用例如FACS Calibur 進(jìn)行雙色流式細(xì)胞分析。在FL-I通道(發(fā)射波長(zhǎng)，530nm)中檢測(cè)到PKH2標(biāo)記的靶細(xì)胞(綠 色)，在FL-2通道(發(fā)射波長(zhǎng)，575nm)中檢測(cè)到RPE標(biāo)記的PBMC或單核細(xì)胞或單核細(xì)胞來(lái) 源的巨噬細(xì)胞(紅色)。剩余的靶細(xì)胞被定義為PKH2+/RPE—雙重標(biāo)記的細(xì)胞(PKH2+/RPE-)， 它們被認(rèn)為代表被PBMC或單核細(xì)胞或單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞吞噬的靶。利用下列等式 計(jì)算靶細(xì)胞的吞噬吞噬百分比=100X [(雙陽(yáng)性百分比)/(雙陽(yáng)性百分比+剩余靶百分 比)]。所有試驗(yàn)通常一式雙份或一式三份，結(jié)果表示為平均值6SD。凋亡活性優(yōu)選用確定染色的細(xì)胞或死亡細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)測(cè)量。為了測(cè)量壞死和 凋亡，也可以應(yīng)用細(xì)胞毒分析。這些試驗(yàn)可以是測(cè)量細(xì)胞膜通透性的放射性和非放射性試 驗(yàn)，因?yàn)槿旧募?xì)胞變得容易滲漏，或可以是測(cè)量線粒體代謝活性下降的比色試驗(yàn)；死細(xì)胞 中的線粒體不能代謝染料，活細(xì)胞中的線粒體能。也可以測(cè)定凋亡的早期指標(biāo)，如細(xì)胞群體或單個(gè)細(xì)胞中的DNA片段化(其中凋亡 的DNA斷成不同長(zhǎng)度的片段)，膜不對(duì)稱(chēng)性的改變(基于磷脂酰絲氨酸和膜聯(lián)蛋白V的試 驗(yàn))，測(cè)量凋亡性caspases的活化，或測(cè)量線粒體釋放細(xì)胞色素C和AIF到胞漿中的情況。本發(fā)明的模塊抗體優(yōu)選的細(xì)胞毒活性相當(dāng)于，在相應(yīng)的回體(ex vivo)細(xì)胞裂解 試驗(yàn)中測(cè)得的胞解活性的至少20%。優(yōu)選地，本發(fā)明的模塊抗體的細(xì)胞毒活性是，在基于細(xì)胞的試驗(yàn)中，以EC50 < 10_8M，優(yōu)選在納摩爾范圍或更低范圍，介導(dǎo)細(xì)胞裂解或細(xì)胞殺傷的活性。本發(fā)明模塊抗體的效應(yīng)子功能優(yōu)選是生物學(xué)細(xì)胞毒活性，其通常不同于任意合成 的細(xì)胞毒活性，例如通過(guò)可以與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的毒素帶來(lái)的活性。毒素通常不活化 效應(yīng)分子和生物學(xué)防御機(jī)制。因此，本發(fā)明模塊抗體優(yōu)選的細(xì)胞毒活性是生物學(xué)細(xì)胞毒活 性(通常是免疫刺激性)，導(dǎo)致有效的細(xì)胞裂解。細(xì)胞毒活性進(jìn)一步與簡(jiǎn)單的細(xì)胞抑制效應(yīng)區(qū)分，在后者中，物質(zhì)通過(guò)例如下列機(jī)制來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)與生長(zhǎng)因子受體結(jié)合，由此阻斷生長(zhǎng)因子的功能；或者抑制血管新生。 細(xì)胞毒活性基本上被認(rèn)為是主動(dòng)攻擊以殺滅細(xì)胞，因此導(dǎo)致細(xì)胞死亡或裂解，故而被認(rèn)為 是高效率地快速減少惡性細(xì)胞或被感染的細(xì)胞的數(shù)量的方法。與細(xì)胞毒化合物相比，細(xì)胞 生長(zhǎng)抑制劑不會(huì)馬上殺死細(xì)胞，僅僅是減少細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，因此被認(rèn)為對(duì)于治療目的而
言作用較小。本發(fā)明的模塊抗體可以特異性結(jié)合任何種類(lèi)的結(jié)合分子或結(jié)構(gòu)，尤其是抗原，蛋 白性質(zhì)的分子，蛋白，肽，多肽，核酸，聚糖，碳水化合物，脂質(zhì)，有機(jī)分子，尤其是小有機(jī)分 子，無(wú)機(jī)分子，或其組合或融合物，包括PEG，前體藥物或藥物。本發(fā)明優(yōu)選的模塊抗體可以 包括至少兩個(gè)環(huán)或環(huán)區(qū)，從而每一環(huán)或環(huán)區(qū)可以特異性結(jié)合不同的分子或表位。優(yōu)選靶抗原選自細(xì)胞表面抗原，包括受體，尤其是選自erbB受體酪氨酸激酶(諸 如EGFR，HER2，HER3和HER4，尤其是這類(lèi)受體胞外結(jié)構(gòu)域的那些表位，例如4D5表位)，TNF 受體超家族的分子，諸如Apo-I受體，TNFRl, TNFR2，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體NGFR，⑶40，T細(xì)胞 表面分子，T細(xì)胞受體，T細(xì)胞抗原0X40，TACI受體，BCMA, Apo-3, DR4，DR5，DR6，誘餌受體， 諸如 DcRl，DcR2, CARl，HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-I，TNFLl 但不限于這些分子，B 細(xì)胞表面 抗原，諸如⑶10，⑶19，⑶20，⑶21，⑶22，實(shí)體瘤或血液學(xué)癌細(xì)胞的抗原或標(biāo)記物，淋巴瘤或 白血病的細(xì)胞，其它血細(xì)胞包括血小板，但不限于這些分子。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，靶抗原選自由諸如上皮細(xì)胞，實(shí)體瘤細(xì)胞，被感染的細(xì) 胞，血細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞和單核細(xì)胞等細(xì)胞呈遞的抗原。由細(xì)胞表達(dá)或過(guò)表達(dá)的靶抗 原是優(yōu)選的靶，其選自腫瘤相關(guān)抗原，尤其是EpCAM，腫瘤相關(guān)糖蛋白-72 (TAG-72)，腫瘤 相關(guān)抗原CA 125，前列腺特異性膜抗原(PSMA)，高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)， 表達(dá)Lewis Y相關(guān)碳水化合物的腫瘤相關(guān)抗原，癌胚抗原(CEA)，CEACAM5，HMFG PEMjiiI 蛋白MUC1，MUC18和細(xì)胞角蛋白腫瘤相關(guān)抗原，細(xì)菌抗原，病毒抗原，變應(yīng)原，變態(tài)反應(yīng)相 關(guān)分子IgE，cKIT和Fc-印silon-受體1，Irp60, IL-5受體，CCR3，紅細(xì)胞受體(CRl)， 人血清白蛋白，小鼠血清白蛋白，大鼠血清白蛋白，F(xiàn)c受體，例如新生兒Fc-gamma-受體 FcRn, Fc-gamma-受體 Fc-gamma RI, Fc-gamma-RII, Fc-gamma RIII, Fc-alpha-受體， Fc-印silon-受體，熒光素，溶菌酶，toll樣受體9，紅細(xì)胞生成素，CD2，CD3，CD3E，CD4， CDl 1, CDlla, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (p67 蛋白)，CD38，CD40，CD40L，CD52，CD54，CD56，CD64，CD80，CD147，GD3，IL-1，IL-1R， IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5，IL-6，IL-6R，IL-8，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-23，LIF, 0SM, siFfJtM alpha, siFfJtM beta, siFfJtM gamma ；TNF-alpha, TNFbeta2, TNFalpha, TNFalphabeta, TNF-Rl，TNF-RII，F(xiàn)asL, CD27L, CD30L，4-1BBL，TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEGl, 0X40L, TRAIL 受體-1，Al 腺苷受體，淋巴細(xì)胞毒素 Beta 受體，TACI, BAFF-R, EPO ； LFA-3, ICAM-1, ICAM-3，整聯(lián)蛋白betal，整聯(lián)蛋白beta2，整聯(lián)蛋白alpha4/beta7，整聯(lián)蛋 白alpha2,整聯(lián)蛋白alpha3,整聯(lián)蛋白alpha4,整聯(lián)蛋白alpha5,整聯(lián)蛋白alpha6,整聯(lián) 蛋白 alphav，alphaVbeta3 整聯(lián)蛋白，F(xiàn)GFR-3，角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，GM-CSF, M-CSF, RANKL, VLA-I，VLA-4, L-選擇蛋白，抗-Id，E-選擇蛋白，HLA, HLA-DR，CTLA-4，T 細(xì)胞受體，B7-1， B7-2，VNR 整聯(lián)蛋白，TGFbetal，TGFbeta2，eotaxinl, BLyS(B-淋巴細(xì)胞刺激劑)，補(bǔ)體 C5, IgE, IgA, IgD, IgM, IgG，因子 VII，CBL, NCA 90，EGFR(ErbB-I), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3)，Her4 (ErbB4)，組織因子，VEGF, VEGFR,內(nèi)皮縮血管肽(endothelin)受體，VLA-4，碳水化合物諸如血型抗原和相關(guān)碳水化合物，Galili-糖基化，胃泌素，胃泌素受 體，腫瘤相關(guān)碳水化合物，半抗原NP-cap或NIP-cap，T細(xì)胞受體alpha/beta，E-選擇蛋 白，P-糖蛋白，MRP3，MRP5，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi(多抗藥性蛋白)，alpha-顆粒膜蛋白 (GMP) 140，地高辛，胎盤(pán)堿性磷酸酶(PLAP)和睪丸PLAP樣堿性磷酸酶，運(yùn)鐵蛋白受體，類(lèi) 肝素酶I，人心臟肌球蛋白，糖蛋白Ilb/IIIa(GPIIb/IIIa)，人巨細(xì)胞病毒(HCMV)gH包膜糖 蛋白，HIVgpl20，HCMV，呼吸道合胞病毒 RSV F，RSVF Fgp，VNR 整聯(lián)蛋白，H印 Bgp 120，CMV， gpIIbIIIa，HIV IIIB gpl20 V3環(huán)，呼吸道合胞病毒(RSV) Fgp，單純皰疹病毒(HSV)gD糖蛋 白，HSV gB糖蛋白，HCMV gB包膜糖蛋白，產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素和其片段。本發(fā)明優(yōu)選的模塊抗體以高親和力結(jié)合所述靶抗原，特別是以高結(jié)合率和/或低 解離率，或高的結(jié)合親合力。通常，Kd< 10_1的結(jié)合劑被認(rèn)為是高親和力結(jié)合劑。根據(jù)本 發(fā)明同樣可以提供Kd低于10_6直至10_9M的中等親和力結(jié)合劑，優(yōu)選與親和力成熟方法聯(lián) 用。親和力成熟是一種方法，用這種方法可以產(chǎn)生對(duì)抗原的親和力增加的抗體?？贵w 發(fā)生結(jié)構(gòu)變化(包括氨基酸誘變，或因免疫球蛋白基因節(jié)段發(fā)生體細(xì)胞突變所致)，導(dǎo)致產(chǎn) 生抗原結(jié)合位點(diǎn)的變體，選出更大的親和力。親和力成熟的模塊抗體可以顯示比親本抗體 大幾個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的親和力。單個(gè)親本抗體可以進(jìn)行親和力成熟。備選地，具有相似的靶抗原 結(jié)合親和力的模塊抗體庫(kù)也可以被看作要進(jìn)行改變的親本結(jié)構(gòu)，以獲得親和力成熟的單個(gè) 抗體或這類(lèi)抗體的親和力成熟庫(kù)。本發(fā)明模塊抗體優(yōu)選的親和力成熟變體顯示結(jié)合親和力至少增加10倍，優(yōu)選至 少增加100倍。親和力成熟可以在利用相應(yīng)的親代分子庫(kù)進(jìn)行篩選的過(guò)程中使用，所述篩 選利用中等結(jié)合親和力的模塊抗體來(lái)獲得具有Kd < IO-8M的特異性靶結(jié)合性和/或IC50 < 10- 功效的本發(fā)明模塊抗體?？蛇x的，結(jié)合功效或親和力可以通過(guò)本發(fā)明模塊抗體的親 和力成熟進(jìn)一步增加，以獲得與低于10_9M的Kd或IC50對(duì)應(yīng)的高值，優(yōu)選低于10_1(IM或甚 至低于10_"M，最優(yōu)選在皮摩范圍。IC50亦稱(chēng)EC50或50%飽和濃度，是度量模塊抗體結(jié)合功效的測(cè)量值。它是在平 衡或飽和條件下，產(chǎn)生50%最大可能結(jié)合的結(jié)合劑摩爾濃度。拮抗劑的功效通常由其IC50 值定義(此處理解為EC50值)。對(duì)于指定拮抗劑來(lái)說(shuō)，這可以通過(guò)確定引發(fā)最大結(jié)合的半 飽和水平所需拮抗劑濃度來(lái)計(jì)算。闡明IC50或EC50值有利于比較具有類(lèi)似效應(yīng)的抗體或 抗體變體的功效，尤其當(dāng)在飽和結(jié)合試驗(yàn)而非競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中測(cè)定時(shí)。在這種情況中，它被當(dāng)作 濃度來(lái)考慮，其在體內(nèi)(in vivo)測(cè)定胞漿濃度，以獲得半最大(50%)效應(yīng)。IC50或EC50 越低，模塊抗體的功效越高，抑制最大生物反應(yīng)(例如效應(yīng)子功能或細(xì)胞毒活性)所需的抗 體濃度越低?？贵w濃度更低還可能與更少的副作用有關(guān)?？贵w的親和力通常以抗體濃度表征，在該濃度，半數(shù)抗原結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)，該濃度 稱(chēng)為解離常數(shù)(Kd，或KD)?？贵w的親和力在飽和結(jié)合試驗(yàn)中測(cè)定時(shí)，通常與IC50很好地關(guān)聯(lián)。拮抗劑對(duì)其結(jié) 合位點(diǎn)的親和力(Ki)，被理解為其結(jié)合受體的能力，這決定了結(jié)合的持續(xù)時(shí)間和相應(yīng)激動(dòng) 劑的活性。利用親和力成熟來(lái)增加親和力的措施常常也增加結(jié)合功效，導(dǎo)致在相同的Kd值 范圍內(nèi)，IC50值相應(yīng)降低。可以利用本領(lǐng)域公知的飽和結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定IC50和Kd值。與競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)相反，飽和結(jié)合試驗(yàn)提供出不依賴于競(jìng)爭(zhēng)劑濃度的值，因此是可比的值，其可能指示體內(nèi)結(jié)合親和力。本發(fā)明的模塊抗體優(yōu)選與標(biāo)記或報(bào)告分子偶聯(lián)，所述標(biāo)記或報(bào)告分子選自有機(jī)分 子，酶標(biāo)記，放射性標(biāo)記，有色標(biāo)記，熒光標(biāo)記，生色標(biāo)記，發(fā)光標(biāo)記，半抗原，地高辛配基，生 物素，金屬?gòu)?fù)合物，金屬，膠體金和其混合物。與標(biāo)記或報(bào)告分子偶聯(lián)的修飾型免疫球蛋白 可以在例如分析系統(tǒng)或診斷方法中使用。本發(fā)明的模塊抗體可以與允許在例如結(jié)合試驗(yàn)(例如ELISA)和結(jié)合研究中簡(jiǎn)單 地檢測(cè)所述偶聯(lián)物的其它分子偶聯(lián)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體變體利用一種或多種基于細(xì)胞的試驗(yàn)或體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)篩 選。為進(jìn)行這類(lèi)試驗(yàn)，通常外源添加純化或未純化的修飾型免疫球蛋白，使細(xì)胞暴露于一個(gè) 個(gè)的免疫球蛋白或?qū)儆谖膸?kù)的免疫球蛋白群體。這些試驗(yàn)通常是，但不總是，基于免疫球蛋 白的功能；即，抗體結(jié)合其靶并介導(dǎo)一些生化事件的能力，例如效應(yīng)子功能，配體/受體結(jié) 合抑制，凋亡，等等。這類(lèi)試驗(yàn)常涉及，監(jiān)測(cè)細(xì)胞對(duì)抗體的應(yīng)答，例如細(xì)胞存活，細(xì)胞死亡，細(xì) 胞形態(tài)學(xué)的變化，或轉(zhuǎn)錄活化諸如天然基因或報(bào)告基因的細(xì)胞表達(dá)。例如，這類(lèi)試驗(yàn)可以測(cè) 量抗體變體引發(fā)ADCC，ADCP，⑶C或凋亡的能力。對(duì)于一些試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，除了靶細(xì)胞之外，可能 需要添加其它細(xì)胞或組分，例如血清補(bǔ)體，或效應(yīng)子細(xì)胞諸如外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，NK 細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，等等。所述其它細(xì)胞可以來(lái)自任何生物，優(yōu)選人，小鼠，大鼠，兔，和猴。模 塊抗體可以引起表達(dá)所述靶的一些細(xì)胞系的凋亡，或它們可以介導(dǎo)已經(jīng)添加到試驗(yàn)中的免 疫細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的攻擊。監(jiān)測(cè)細(xì)胞死亡或活力的方法是本領(lǐng)域已知的，包括染料，免疫化學(xué) 制品，細(xì)胞化學(xué)制品，和放射性試劑的使用。例如，caspase染色試驗(yàn)可能能檢測(cè)凋亡，放射 性底物或熒光染料諸如alamar blue的攝取或釋放可能能監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)或活化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以使用基于DELFIART EuTDA的細(xì)胞毒性試驗(yàn)(Perkin Elmer,MA)。備選地，死亡或損壞的靶細(xì)胞可通過(guò)測(cè)量一種或多種天然胞內(nèi)成分例如乳酸脫 氫酶的釋放來(lái)監(jiān)測(cè)。轉(zhuǎn)錄活化也可以作為基于細(xì)胞的試驗(yàn)中分析功能的方法。在這種情況下，應(yīng)答可 以通過(guò)分析可能被上調(diào)的天然基因或免疫球蛋白來(lái)監(jiān)測(cè)，例如可以檢測(cè)一些白細(xì)胞介素的 釋放，或經(jīng)由報(bào)告子構(gòu)建體來(lái)獲得結(jié)果。基于細(xì)胞的試驗(yàn)還可以涉及檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)改變， 作為對(duì)模塊抗體的存在的應(yīng)答。這類(lèi)試驗(yàn)所用的細(xì)胞可以是原核或真核類(lèi)型，本領(lǐng)域已知 的多種細(xì)胞系都可以使用。備選地，基于細(xì)胞的篩選用已被編碼變體的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞進(jìn)行。也就是說(shuō)，抗體變體不從外源添加給細(xì)胞。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，基于細(xì) 胞的篩選利用細(xì)胞表面展示?？梢允褂媚茉诩?xì)胞表面展示修飾的免疫球蛋白的融合伴侶 (Wittrup，2001，Curr Opin Biotechnol，12 :395-399)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，模塊抗體的免疫原性可利用一種或多種基于細(xì)胞的試驗(yàn)來(lái)確 定。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用回體T細(xì)胞活化試驗(yàn)定量免疫原性。在該方法中，來(lái)自匹配供 體的抗原呈遞細(xì)胞和初始化(Iiaive)T細(xì)胞用目標(biāo)肽或完整抗體攻擊一次或多次。然后，T 細(xì)胞活化可以用多種方法檢測(cè)，例如通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子的生成，或檢測(cè)氚化胸苷的攝取。在 最優(yōu)選實(shí)施方案中，干擾素gamma的生成用Elispot試驗(yàn)監(jiān)測(cè)。本發(fā)明模塊抗體的生物學(xué)特性可以在細(xì)胞、組織和完整生物的實(shí)驗(yàn)中回體表征。 本領(lǐng)域已知，藥物常常在包括但不限于小鼠，大鼠，兔，狗，貓，豬，和猴等的動(dòng)物體內(nèi)測(cè)試， 以便檢測(cè)藥物治療疾病或疾病模型的功效，或檢測(cè)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)，藥效學(xué)，毒性和其它特性。所述動(dòng)物可以被稱(chēng)為疾病模型。治療劑經(jīng)常在小鼠中檢驗(yàn)，所述小鼠包括但不限于裸 鼠，SCID小鼠，異種移植小鼠，和轉(zhuǎn)基因小鼠(包括敲入(knockins)和敲出(knockouts))。 這種實(shí)驗(yàn)可提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)用于確定具有合適半衰期，效應(yīng)物功能，凋亡活性，細(xì)胞毒或 溶胞活性的用做治療劑的抗體的潛力。任何生物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，可用于測(cè)試。例如，靈長(zhǎng) 類(lèi)動(dòng)物、猴因與人類(lèi)遺傳相似，可以作為合適的治療模型，并因此可以用于測(cè)試本發(fā)明模塊 抗體的功效，毒性，藥代動(dòng)力學(xué)，藥效學(xué)，半衰期，或其它特性。最終需要所述物質(zhì)在人體中 的試驗(yàn)來(lái)獲批藥物，因此這些實(shí)驗(yàn)當(dāng)然也在考慮范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的模塊抗體可以在人 體中試驗(yàn)，以確定它們的治療效力，毒性，免疫原性，藥代動(dòng)力學(xué)，和/或其它臨床特性。尤 其那些與單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞復(fù)合物通過(guò)至少兩個(gè)結(jié)合基元結(jié)合(優(yōu)選結(jié)合至少三個(gè)結(jié)構(gòu)交 聯(lián)的靶細(xì)胞)的本發(fā)明模塊抗體，被認(rèn)為一旦進(jìn)行細(xì)胞靶向和交聯(lián)，就具有效應(yīng)物活性或 前凋亡或凋亡活性。多價(jià)結(jié)合提供了結(jié)合伴侶的相對(duì)較大結(jié)合(也稱(chēng)為交聯(lián))，這是凋亡和 細(xì)胞死亡的先決條件。本發(fā)明的模塊抗體可用于廣泛多種抗體產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的模塊 抗體用于治療或預(yù)防，例如作為主動(dòng)或被動(dòng)免疫療法，用于制備、工業(yè)或分析用途，作為診 斷劑、工業(yè)化合物或研究試劑，優(yōu)選作為治療劑。模塊抗體可用于單克隆或多克隆的抗體組 合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的模塊抗體用于捕獲或殺傷載有靶抗原的靶細(xì)胞，例如癌 細(xì)胞。在備選實(shí)施方案中，本發(fā)明的模塊抗體用于阻斷，拮抗，或刺激靶抗原，例如通過(guò)拮抗 細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的模塊抗體用于阻斷，拮抗，或刺激生長(zhǎng)因子或生 長(zhǎng)因子受體，從而介導(dǎo)對(duì)載有或需要靶抗原的靶細(xì)胞的殺傷。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的模塊抗體用于阻斷，拮抗，或刺激酶和酶的底 物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，給患者施用模塊抗體以治療特定病癥。用于本發(fā)明目的的“患 者”包括人和其它動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人。本文“特定病癥”表示可以通過(guò)施用含本 發(fā)明修飾的免疫球蛋白的藥物組合物而改善的病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的模塊抗體是唯一給患者施用的治療活性劑。備選地， 本發(fā)明的模塊抗體施用時(shí)組合了一種或多種其它治療劑，包括但不限于細(xì)胞毒性劑，化療 劑，細(xì)胞因子，生長(zhǎng)抑制劑，抗激素劑，激酶抑制劑，抗血管生成劑，心臟保護(hù)劑，或其它治療 劑。模塊抗體可以與一種或多種其它治療方案相伴施用。例如，本發(fā)明的模塊抗體可以與 化療，放療，或化療加放療一起給患者施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的模塊抗體可以與 一種或多種抗體聯(lián)合施用，后者包含或不含本發(fā)明的模塊抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方 案，本發(fā)明的模塊抗體和一種或多種其它抗癌療法被用于回體治療癌細(xì)胞。本發(fā)明考慮，這 種回體治療可用于骨髓移植，尤其是自體骨髓移植。當(dāng)然也考慮，本發(fā)明的抗體可與其它治 療技術(shù)諸如手術(shù)聯(lián)合使用。我們發(fā)現(xiàn)，多種其它治療劑可與本發(fā)明的模塊抗體一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述模塊抗體與抗血管生成劑一起施用，后者是阻斷或在一定程度上干擾血管發(fā)育的化合 物?？寡苌梢蜃涌梢允牵?，小分子或蛋白，例如抗體，F(xiàn)c融合分子，或細(xì)胞因子，它 們結(jié)合參與促進(jìn)血管發(fā)生的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體。本文優(yōu)選的抗血管生成因子是結(jié)合 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的抗體。在備選實(shí)施方案中，所述模塊抗體與誘導(dǎo)或增強(qiáng)獲得性免疫應(yīng)答的治療劑(例如靶向CTLA-4的抗體)一起施用。在備選實(shí)施方案中，修飾的免疫 球蛋白與酪氨酸激酶抑制劑一起施用，后者是在一定程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶 活性的分子。在備選實(shí)施方案中，本發(fā)明的模塊抗體與細(xì)胞因子一起施用。本文使用的“細(xì) 胞因子”是，一個(gè)細(xì)胞群體作用于另一細(xì)胞而釋放的作為細(xì)胞間介質(zhì)的蛋白的總稱(chēng)，包括趨 化因子。藥物組合物也包括在內(nèi)，其中本發(fā)明的模塊抗體與一種或多種治療活性劑一起配 制。通過(guò)將具有所需純度的所述免疫球蛋白與可選的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，形 成凍干配制劑或水溶液的形式，可以制得用于保存的本發(fā)明模塊抗體的穩(wěn)定配制劑。用于 體內(nèi)施用的配制劑優(yōu)選是無(wú)菌的。這可通過(guò)濾過(guò)除菌膜或其它方法輕易地實(shí)現(xiàn)。本文公開(kāi) 的模塊抗體和其它治療活性劑還可以配制為免疫脂質(zhì)體，和/或包裹在微膠囊中。含本發(fā)明模塊抗體的藥物組合物，優(yōu)選無(wú)菌水溶液，可以通過(guò)多種方式施用，包 括但不限于，口服，皮下，靜脈內(nèi)，鼻內(nèi)，光內(nèi)(intraotically)，經(jīng)皮膚，粘膜，表面局部 (topically)(如，凝膠，油膏劑(salve)，洗劑，霜?jiǎng)?，等?，腹腔內(nèi)，肌肉，肺內(nèi)(例如，購(gòu)自 Aradigm的AERx 可吸入技術(shù)，或購(gòu)自Inhale Therapeutics的hhance 肺遞送系統(tǒng))， 陰道，腸胃外，直腸，或眼內(nèi)。本發(fā)明優(yōu)選的方法涉及對(duì)模塊抗體通過(guò)誘變進(jìn)行修飾，以獲得新的結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu) 選的誘變涉及隨機(jī)化技術(shù)，其中，肽或多肽的氨基酸序列在至少一個(gè)位置被突變，由此獲 得隨機(jī)化序列，其介導(dǎo)抗原結(jié)合。例如，特異性抗體序列被隨機(jī)修飾，以獲得編碼免疫球 蛋白、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸分子，其包含至少一個(gè)核苷酸重復(fù)單元，優(yōu)選在 結(jié)構(gòu)環(huán)編碼區(qū)內(nèi)或在末端區(qū)域內(nèi)，具有序列5' -NNS-3 ‘，5' -NNN-3 ‘，5' -NNB-3 ‘或 5' -NNK-3'。在一些實(shí)施方案中，修飾的核酸包含選自以下的核苷酸密碼子TMT，WMT， BMT, RMC, RMG, MRT, SRC, KMT, RST, YMT, MKC, RSA, RRC, NNK, NNN, NNS 或其任意組合(根據(jù) IUPAC進(jìn)行編碼)。核酸分子的修飾可以是，向大核酸節(jié)段中引入合成的寡核苷酸，或從頭合成(de novo)完整核酸分子。核酸的合成可以用三核苷酸結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行，其在編碼氨基酸子集 時(shí)，減少無(wú)義序列組合的數(shù)目(例如Yanez et al. Nucleic Acids Res. (2004)32 :el58 ； Virnekas et al. Nucleic Acids Res. (1994)22:5600—5607)。本發(fā)明另一重要方面是，每個(gè)潛在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與編碼它的具體DNA或RNA分子 保持物理結(jié)合，而且，融合蛋白在基因包的表面寡聚，以呈遞天然的功能性寡聚結(jié)構(gòu)的結(jié)合 多肽。一旦鑒定出成功結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，可以很容易地獲得基因用于表達(dá)、重組或進(jìn)一步的工 程化目的。這種結(jié)合采取的形式是“復(fù)制型基因包”，諸如病毒、細(xì)胞或孢子，它們復(fù)制并表 達(dá)編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因，然后將結(jié)合結(jié)構(gòu)域輸送到其外表面。另一形式是體外復(fù)制型基 因包，諸如將編碼RNA與翻譯出的蛋白相連的核糖體。在核糖體展示中，遺傳物質(zhì)通過(guò)聚合 酶的酶促擴(kuò)增進(jìn)行復(fù)制。載有識(shí)別靶分子的結(jié)合劑的那些細(xì)胞或病毒核酸被分離和，必要時(shí)，被擴(kuò)增?；?包優(yōu)選是M13噬菌體，且所述蛋白包括M13基因III蛋白的外表面運(yùn)輸信號(hào)。用于融合蛋白的優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是非抑制者宿主細(xì)胞，其對(duì)終止密碼子(諸如琥珀 終止密碼子)敏感，并因此終止翻譯。在缺乏這類(lèi)終止密碼子時(shí)，優(yōu)選使用這類(lèi)非抑制者宿 主細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌。在存在這類(lèi)終止密碼子時(shí)，將使用抑制者宿主細(xì)胞。
優(yōu)選在本發(fā)明的方法中，基因包的載體或質(zhì)粒受轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的嚴(yán)密控制，培養(yǎng) 條件經(jīng)過(guò)調(diào)整以使得那些在顆粒表面展示少于兩個(gè)拷貝的融合蛋白的載體或噬菌粒顆粒 的量或數(shù)低于約20%。更優(yōu)選，那些展示少于兩個(gè)拷貝的融合蛋白的載體或噬菌粒顆粒的 量，是那些展示一個(gè)或多個(gè)拷貝的融合蛋白的顆粒的量的10%以下。最優(yōu)選所述量低于1%。本發(fā)明優(yōu)選使用的表達(dá)載體優(yōu)選能表達(dá)結(jié)合多肽，且可以如下產(chǎn)生首先，引入多 個(gè)編碼不同結(jié)合序列的多核苷酸，以合成結(jié)合多肽的基因文庫(kù)。可以合成合適量的多個(gè)多 核苷酸，將它們以可操作的組合方式連接至載體中，通過(guò)載體擴(kuò)增來(lái)表達(dá)所述結(jié)合多肽的 融合蛋白。備選地，可通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多個(gè)多核苷酸，以獲得足夠的材料用于表 達(dá)。但是，這只在結(jié)合多肽由大的多核苷酸序列(例如200個(gè)以上的堿基對(duì)，或有時(shí)300個(gè) 以上的堿基對(duì))編碼的情況下才是有利的。因此，優(yōu)選形成多樣性合成文庫(kù)，使得可以從所 述多樣性文庫(kù)選出至少一種能產(chǎn)生具有所需預(yù)選功能和結(jié)合性(諸如特異性)的結(jié)合多肽 的表達(dá)載體。隨機(jī)改造的核酸分子可以包括上述鑒定的重復(fù)單位，其編碼所有已知天然存在的 氨基酸或其子集。包含修飾序列的那些文庫(kù)(其中特定氨基酸子集被用于修飾目的)被稱(chēng) 為“集中型”文庫(kù)。這類(lèi)文庫(kù)的成員在修飾位置具有這類(lèi)子集的氨基酸的概率增加，比正常 高至少兩倍，優(yōu)選高至少3倍或甚至至少4倍。這類(lèi)文庫(kù)還具有受限或更少數(shù)目的文庫(kù)成 員，使得文庫(kù)成員的實(shí)際數(shù)目達(dá)到文庫(kù)成員的理論數(shù)目。一些情況下，集中型文庫(kù)的文庫(kù)成 員數(shù)目是理論數(shù)目的IO3倍以上，優(yōu)選不低于IO2倍，最優(yōu)選不低于10倍。本發(fā)明的文庫(kù)通常包含至少10個(gè)融合蛋白或潛在結(jié)合劑或支架蛋白變體，優(yōu)選 至少100個(gè)，更優(yōu)選至少1000個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O4個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O5個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O6個(gè)， 更優(yōu)選至少I(mǎi)O7個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O8個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O9個(gè)，更優(yōu)選至少101°個(gè)，更優(yōu)選至少 IO11個(gè)，最多IO12個(gè)，在體外展示方法，如核糖體展示方法中，甚至更高的數(shù)目也是可達(dá)到 的。在制備編碼隨機(jī)化文庫(kù)的基因方面存在多種選擇。有可能通過(guò)完全合成的方法產(chǎn) 生DNA，其中的序列被分成重疊的片段，它們隨后被制成合成的寡核苷酸。將這些寡核苷酸 混合在一起，先加熱到約100°C，再緩慢冷卻到室溫，從而彼此退火。在該退火步驟后，合成 組裝的基因可以被直接克隆，或在克隆前先通過(guò)PCR擴(kuò)增。備選地，可以用其它定點(diǎn)誘變的方法產(chǎn)生文庫(kù)插入物，諸如Kimkel法(Kimkel TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 1985 Jan ；82 (2) :488-92)或 DpnI 法(Weiner MP, Costa GL, Schoettlin W, Cline J, Mathur E, Bauer JC. Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by the polymerase chain reaction. Gene. 1994 Dec 30 ； 151(1-2) :119-23.)。對(duì)于各種目的來(lái)說(shuō)，將沉默突變導(dǎo)入編碼文庫(kù)插入物的序列中是有利的。例如， 可以導(dǎo)入限制性酶切位點(diǎn)，這有利于所述序列多個(gè)部分的克隆或模塊交換。導(dǎo)入沉默突變 的另一實(shí)例是“標(biāo)記”文庫(kù)的能力，這意味著在所選位置給予它們特定的密碼子，允許它們 (或從它們衍生的所選克隆)在例如后續(xù)多個(gè)步驟期間被識(shí)別，在這些步驟中，例如具有不 同特征的不同文庫(kù)可以混合在一起，用做淘選過(guò)程中的混合物。
本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生與靶結(jié)合的模塊抗體結(jié)構(gòu)域的寡聚體的方法，包括以下步 驟-提供按本發(fā)明方法制備的模塊抗體結(jié)構(gòu)域的寡聚體的文庫(kù)-在有支架配體存在的條件下，將所述文庫(kù)與所述靶接觸-選出在有支架配體存在的條件下與所述靶結(jié)合的文庫(kù)成員，和-生產(chǎn)所述功能性寡聚體的制品。支架配體可以選自效應(yīng)分子、Fcfoi、蛋白A、蛋白G、蛋白L和⑶R靶。舉例來(lái)說(shuō)，效 應(yīng)分子可以選自CD64，CD32, CD16, Fc受體。寡聚體可以是選自VH/VL，CH1/CL，CH2/CH2，CH3/CH3，F(xiàn)c和Fab的二聚體，或其單鏈。本發(fā)明的方法可以提供含至少I(mǎi)O2個(gè)獨(dú)立克隆的文庫(kù)，所述獨(dú)立克隆表達(dá)模塊抗 體結(jié)構(gòu)域或其變體的功能性寡聚體。本發(fā)明還提供預(yù)選的獨(dú)立克隆的群體，其是例如親和 力成熟的，所述群體優(yōu)選含至少10個(gè)，更優(yōu)選至少100個(gè)，更優(yōu)選至少1000個(gè)，更優(yōu)選至少 10000個(gè)，還更優(yōu)選至少100000個(gè)獨(dú)立克隆。這些含有預(yù)選的群體的文庫(kù)是選出本發(fā)明的 高親和力模塊抗體的優(yōu)選來(lái)源。本發(fā)明使用的文庫(kù)優(yōu)選包含至少I(mǎi)O2個(gè)文庫(kù)成員，更優(yōu)選至少I(mǎi)O3個(gè)，更優(yōu)選至少 IO4個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O5個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O6個(gè)文庫(kù)成員，更優(yōu)選至少I(mǎi)O7個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O8 個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O9個(gè)，更優(yōu)選至少101°個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O11個(gè)，最多IO12個(gè)文庫(kù)成員，它們優(yōu) 選源自親代分子(指功能性模塊抗體，被當(dāng)作了含至少一種特定功能或結(jié)合模塊的支架)， 和其衍生物，以便在所述親本模塊的原始功能性結(jié)合區(qū)以外造出新的結(jié)合位點(diǎn)。通常本發(fā)明的文庫(kù)還包含由誘變或隨機(jī)化技術(shù)產(chǎn)生的模塊抗體的變體。這些變體 包括無(wú)活性或無(wú)功能的抗體。因此，優(yōu)選用合適的試驗(yàn)篩選任意這類(lèi)文庫(kù)以確定功能性效 應(yīng)。本發(fā)明優(yōu)選的文庫(kù)包含至少I(mǎi)O2個(gè)模塊抗體的變體，更優(yōu)選至少I(mǎi)O3個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O4 個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O5個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O6個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O7個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O8個(gè)，更優(yōu)選至 少I(mǎi)O9個(gè)，更優(yōu)選至少101°個(gè)，更優(yōu)選至少I(mǎi)O11個(gè)，最多IO12個(gè)變體或更多，以提供抗體的高 度多樣化多成員庫(kù)，用于篩選最適合的結(jié)合劑。任何這類(lèi)合成文庫(kù)都可以用本文公開(kāi)的誘 變方法產(chǎn)生。優(yōu)選的文庫(kù)是酵母文庫(kù)，酵母宿主細(xì)胞在細(xì)胞表面顯示具有生物活性的寡聚體。 酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選選自糖酵母屬(Saccharomyces)，畢赤酵母屬(Pichia)，漢遜氏酵母 屬(Hansenula),裂殖酵母屬(Schizisaccharomyces),克魯維酵母屬(Kluyveromyces), 耶羅威亞酵母屬(Yarrowia)和假絲酵母屬(Candida)。最優(yōu)選，宿主細(xì)胞是釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0本發(fā)明還提供含至少I(mǎi)O2個(gè)獨(dú)立克隆的高質(zhì)量文庫(kù)，所述克隆是模塊抗體結(jié)構(gòu)域 或其變體的功能性二聚體的獨(dú)立克隆，或提供優(yōu)化的或預(yù)選的克隆(如親和力成熟克隆) 的群體，所述群體含至少10個(gè)與靶結(jié)合并與支架配體結(jié)合的獨(dú)立克隆。靶可以是與經(jīng)受氨 基酸變異的親代分子結(jié)合的配體。親代分子可以是功能性寡聚體，尤其是功能性Fc或功能 性Fab或其部分。文庫(kù)可以包含與靶結(jié)合并與支架配體結(jié)合的模塊抗體結(jié)構(gòu)域的功能性二聚體，且 至少20%，優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至少40%的功能性二聚體與⑶64結(jié)合。這對(duì)于包含CH2結(jié)構(gòu)域的模塊抗體如Fc支架是尤其優(yōu)選的。備選地，文庫(kù)可以包含與靶結(jié)合并與支架配體結(jié)合的模塊抗體結(jié)構(gòu)域的功能性二 聚體，且至少20 %，優(yōu)選至少30 %，更優(yōu)選至少40 %的功能性二聚體與蛋白A結(jié)合。這對(duì)于 包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的模塊抗體如Fc支架是尤其優(yōu)選的。備選地，文庫(kù)可以包含與靶結(jié)合并與支架配體結(jié)合的模塊抗體結(jié)構(gòu)域的功能性二 聚體，且至少20%，優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至少40%的功能性二聚體與相同的⑶R靶結(jié)合。 這對(duì)于包含可變區(qū)的模塊抗體，如對(duì)單個(gè)CDR靶具有特異性的Fab支架，是尤其優(yōu)選的。本領(lǐng)域公知，有多種展示和選擇技術(shù)可用于鑒定和分離具有某些結(jié)合特征和親和 力的蛋白，包括，例如，展示技術(shù)，諸如細(xì)胞的和非細(xì)胞的展示技術(shù)，尤其是移動(dòng)展示系統(tǒng)。 在眾多細(xì)胞系統(tǒng)中，可以使用噬菌體展示，病毒展示，酵母或其它真核細(xì)胞展示，諸如哺乳 動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞展示。移動(dòng)系統(tǒng)涉及可溶形式的展示系統(tǒng)，諸如體外展示系統(tǒng)，其中包括核 糖體展示、mRNA展示或核酸展示。用于產(chǎn)生和篩選抗體變體的方法是本領(lǐng)域公知的?？贵w分子生物學(xué)、表達(dá)、 純化禾口蹄選的一般方法參見(jiàn) Antibody Engineering,編輯 Duebel & Kontermann， Springer-Verlag, Heidelberg,2001 ；Hayhurst & Georgiou,2001, Curr Opin Chem Biol 5 :683-689 ；Maynard & Georgiou，2000，Arrnu Rev Biomed Eng 2 :339_76。本發(fā)明的文庫(kù)可以被設(shè)計(jì)為專(zhuān)用文庫(kù)(dedicated library)，其包含至少50%的 特異性形式，優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %，或主要 由特異性抗體形式組成的那些。特異性抗體形式是優(yōu)選，使得本發(fā)明優(yōu)選的文庫(kù)選自VH文 庫(kù)，VHH文庫(kù)，Vkappa文庫(kù)，Vlambda文庫(kù)，F(xiàn)ab文庫(kù)，CH1/CL文庫(kù)，F(xiàn)c文庫(kù)和CH3文庫(kù)。以 包含超過(guò)一個(gè)抗體結(jié)構(gòu)域的混合分子內(nèi)容物為特征的文庫(kù)(諸如IgG文庫(kù)或Fc文庫(kù))是 特別優(yōu)選的。其它優(yōu)選的文庫(kù)是，含T細(xì)胞受體(形成T細(xì)胞受體文庫(kù))的那些文庫(kù)。進(jìn) 一步優(yōu)選的文庫(kù)是表位文庫(kù)，其中融合蛋白包括具有表位變體的分子，也使得能篩選具有 相似結(jié)合能力、但功能不同的競(jìng)爭(zhēng)性分子。實(shí)例是TNFalpha文庫(kù)，其中TNFalpha融合蛋白 的三聚體由單個(gè)基因包展示。以上描述參照下列實(shí)施例將更全面的理解。但是，這類(lèi)實(shí)施例僅僅是代表實(shí)施本 發(fā)明一種或多種實(shí)施方案的方法，不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1 構(gòu)建非集中的Fcab文庫(kù)(FcabOl)并在噬菌體表面展示IgGl Fc片段的晶體結(jié)構(gòu)在BrooWiaven Database的登錄號(hào)為10Q0. pdb，用該結(jié) 構(gòu)輔助設(shè)計(jì)所述Fcab文庫(kù)。用作構(gòu)建Fcab文庫(kù)的基礎(chǔ)是SEQ ID No. 1所示序列。在該序列中，第一個(gè)氨基 酸對(duì)應(yīng)于人 IgGl 的 Glu 216 (EU 編號(hào)，依據(jù) IMGT 數(shù)據(jù)庫(kù)(http //imgt. cines. fr/textes/ IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/H u_IGHCallgenes. html ；lookup 2007 06 25)，它是人IgGl鉸鏈區(qū)恒定重鏈(E) PKSCDKTHTCPPCP)的第一個(gè)殘基)。SEQ ID No. 1的倒數(shù)第二個(gè)殘基對(duì)應(yīng)于人IgGl的Gly 446 (EU編號(hào)；IMGT 人IgGlCH3結(jié)構(gòu)域第1 位殘基)。詳細(xì)分析了 loqo. pdb的結(jié)構(gòu)，并目測(cè)觀察了形成連接beta鏈的環(huán)的殘基之后，決定將連接beta鏈E-F的環(huán)上的殘基144，145和146、以及連接beta鏈SEQ ID No. 1的環(huán)上 的殘基198，199，200，203和204隨機(jī)化。除了這些突變的殘基，另有5個(gè)殘基插入到SEQ ID No. 1的第198位殘基處。在SEQ ID No. 2中，給出了文庫(kù)FcabOl的文庫(kù)插入節(jié)段的序 列，所有隨機(jī)化的殘基位置、以及5個(gè)插入的殘基都用字母X表示。通過(guò)用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行一系列PCR、再連接這些PCR產(chǎn)生，產(chǎn)生所述工程化改造 的基因。為便于連接，編碼SEQ ID No. 1的核苷酸序列中一些密碼子在不改變氨基酸序 列的情況下被修飾(沉默突變)，以產(chǎn)生限制性位點(diǎn)。為了將克隆載體pHEm (Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11 ；19 (15) :4133-7. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage :methodologies for displaying antibody(Fab)heavy and light chains. Hoogenboom HR，Griffiths AD，Johnson KS，Chiswell DJ，Hudson P, Winter G.) 與pelB分泌信號(hào)插入在一個(gè)讀碼框內(nèi)，在pelB分泌信號(hào)3’附近用到了 NcoI限制性位點(diǎn)。 為了進(jìn)行殘基隨機(jī)化，選用密碼子NNS (IUPAC編碼，其中S表示核苷酸C和G)，其編碼所有 20個(gè)天然氨基酸，但棄用3個(gè)終止密碼子中的2個(gè)。其它密碼子例如NNB (B表示核苷酸T， C和G)也可以采用。經(jīng)改造的核苷酸序列見(jiàn)SEQ ID No. 3。該序列也包括用于克隆到噬菌 體展示載體pHENl中的限制性位點(diǎn)，即5，端的NcoI位點(diǎn)和3，端的位點(diǎn)。用于裝配突變的CH3結(jié)構(gòu)域的PCR引物序列見(jiàn)SEQ ID No. 4至SEQ ID No. 9。
SEQ ID No. 4 (PCR 弓 | 物 EPKSNC0)ccatggccgagcccaaatcttgtgacaaaactcSEQ ID No. 5 (PCR 引物 CH3LSAC)agtcgagctcgtcacgggatgggggcagggSEQ ID No. 6 (PCR 引物 CH3CSAC)gtacgagctcnnsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctggSEQ ID No. 7 (PCR 引物 CH3CHIN)tgccaagcttgctgtagaggaagaaggagccgSEQ ID No. 8 (PCR 引物 CH3RHIN)tgccaagcttaccgtgnnsnnsnnsaggtggnnsnnsgggaacgtcttctcatgctccgSEQ ID No. 9 (PCR 引物 CH3RN0T)agttgcggccgctttacccggagacagggagag圖1圖示用于裝配突變的基因的PCR片段，及其所用的的引物。用人單克隆抗體 3D6 (Felgenhauer M，Kohl J, Ruker F. Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H-and L-chains of a人mono-clonal antibody specific to HIV-l-gp41. Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25 ；18(16) :4927.)重鏈cDNA作 模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。3種PCR產(chǎn)物分別用McI和/或HindIII消化，連接在一起。該連接 產(chǎn)物進(jìn)一步用NcoI和NotI消化，連接到用于表面展示的已先用NcoI和NotI消化的噬菌 粒載體PHEm中。然后，將該連接產(chǎn)物經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)中。多個(gè)選出的 克隆通過(guò)限制性和DNA測(cè)序進(jìn)行監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)它們包含預(yù)計(jì)的插入序列，包括正確插入的隨 機(jī)化序列。下列噬菌體制備步驟按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，連接混合物通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌TGl細(xì)胞中。隨后，用輔助噬菌體M13-K07從大腸桿菌TGl細(xì)胞中挽救噬菌體 顆粒。然后，用PEG/NaCl，經(jīng)兩個(gè)步驟，從培養(yǎng)上清中沉淀出噬菌體顆粒，將其溶于水，用于通過(guò)淘選法進(jìn)行選擇，或貯存在-80°C ,
[0255 [0256
由諸如NNS，NNB, NNK, NNN等密碼子編碼，或采用其它密碼子t
[0257 [0258 [0259 [0260 [0261 [0262 [0263 [0264 [0265 [0266 [0267 [0268 [0269 [0270 [0271 [0272 [0273 [0274 [0275 [0276 [0277 [0278 [0279
實(shí)施例2 構(gòu)建集中型Fcab文庫(kù)(Fcab02)并進(jìn)行噬菌體展示 按實(shí)施例1所述制得Fcab文庫(kù)，其中的隨機(jī)化文庫(kù)位置都徹底隨機(jī)化，即它們都
為清楚起見(jiàn)，諸如N，B，S或K等字母的含義由IUPAC核苷酸模糊碼定義，見(jiàn)下表 表 1. IUPAC 核苷酸模糊碼(nucleotide ambiguity code)
權(quán)利要求
1.細(xì)胞毒模塊抗體，分子量最高達(dá)60kD，以Kd< IO-8M的結(jié)合親和力特異性結(jié)合細(xì)胞 表面的靶。
2.權(quán)利要求1的模塊抗體，具有ADCC，ADCP，⑶C或凋亡活性中的至少一種活性。
3.權(quán)利要求1或2的模塊抗體，包含具有隨機(jī)化抗體序列的結(jié)合位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求1-3之一的模塊抗體，包含具有結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)。
5.權(quán)利要求1-4之一的模塊抗體，是模塊抗體結(jié)構(gòu)域的寡聚體。
6.權(quán)利要求1-5之一的模塊抗體，是選自VH/VL，CH1/CL，CH2/CH2，CH3/CH3，F(xiàn)c和Fab 的二聚體，或它們的單鏈。
7.權(quán)利要求1-6之一的模塊抗體，其中所述靶是erbB類(lèi)型的受體。
8.權(quán)利要求7的模塊抗體，其中所述靶選自EGFR，Her2，Her2neu，HER3和HER4。
9.權(quán)利要求8的模塊抗體，包含特異性結(jié)合Her2的結(jié)合位點(diǎn)，并包含選自表4和表5 所示序列編號(hào)的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1-9之一的模塊抗體，從與效應(yīng)配體結(jié)合的模塊抗體結(jié)構(gòu)域寡聚體的庫(kù) 獲得。
11.產(chǎn)生權(quán)利要求1-10之一的模塊抗體的方法，包括以下步驟a)提供模塊抗體結(jié)構(gòu)域寡聚體的庫(kù)，b)在有效應(yīng)配體存在的條件下，將所述庫(kù)與所述靶接觸，c)選出具有以下兩項(xiàng)特性的庫(kù)成員i)靶結(jié)合親和力為Kd < IO-8M或IC50 < IO-8M,且 )具有細(xì)胞毒活性，和d)產(chǎn)生該模塊抗體的制劑。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述庫(kù)包含具有隨機(jī)化抗體序列的成員。
13.權(quán)利要求11或12的方法，還包含使所述庫(kù)成員發(fā)生親和力成熟的步驟。
14.制備權(quán)利要求1-10之一的模塊抗體用于治療實(shí)體腫瘤患者的方法，所述腫瘤表達(dá) erbB類(lèi)型的受體。
15.權(quán)利要求1-10之一的模塊抗體，是用于治療實(shí)體腫瘤患者的模塊抗體，所述腫瘤 表達(dá)erbB類(lèi)型的受體。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子量最高達(dá)60kD的細(xì)胞毒模塊抗體，其以Kd＜10-8M的結(jié)合親和力結(jié)合細(xì)胞表面的靶，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生所述抗體的方法，以及所述抗體作為治療劑的用途。
文檔編號(hào)C07K16/32GK102083464SQ200980125946
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月2日
發(fā)明者安東·鮑爾, 戈特弗里德·希姆勒, 格爾特·馬德, 格爾達(dá)·雷德?tīng)?申請(qǐng)人:F-星生物技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)有限公司