專利名稱：一種用于治療或者預防個體功能性維生素b的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于治療或者預防個體功能性維生素B12缺陷的方法以及在該方法中使用的藥物組合物。這種功能性維生素B12缺陷最終可能表現為癡呆、其它神經精神性異常和/或血管疾病。
高半胱氨酸是一種來源于甲硫氨酸降解過程的中間氨基酸。在患有葉酸鹽、維生素B12(鈷胺素)和維生素B6缺陷以及這些化合物代謝過程中的酶遺傳性缺失的個體中，高半胱氨酸的血清水平增高。術語高半胱氨酸過多癥(hyperhomocysteinemia)是指血液中高半胱氨酸的濃度升高，該癥狀與心血管、外周血管和腦血管疾病有關。推測高半胱氨酸過多癥在阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)的病因學中有潛在的作用。最近的一些調查支持了這種觀點(1、2、3、4)。在這些調查中最引人注目的可能就是一項關于組織學上確診為AD的病人和年齡匹配對照組之間的病案對比研究，研究表明血清高半胱氨酸大于14μmol/L的個體患上AD的風險要比血清高半胱氨酸小于11μomol/L的個體高4.6倍(2)。最近，在Framinhan研究中的一項有1092名老年受試者的預期觀察研究也為血漿高半胱氨酸水平和癡呆之間的關聯提供了有力的證據(4)。在這項研究中，同基線相比升高的血漿高半胱氨酸水平被作為臨床癡呆發(fā)展的獨立預測指標，大多數高半胱氨酸水平升高都是由于AD所造成的。過了八年隨訪期的中間時段，癡呆患者發(fā)展到111名受試者。那些血漿高半胱氨酸水平最高的人患上AD的風險幾乎翻了一倍；血漿高半胱氨酸每增加5μmol，AD風險就會增加40％。上述調查表明高半胱氨酸同AD和血管性癡呆的認知分值(cognitive score)有關。而且，它還表現為健康老人的認知分值下降的一個獨立預測指標(5)。
鈷胺素的組織缺陷還會造成血清甲基丙二酸的升高。在患有代謝性鈷胺素缺陷的AD病人血清中也已證明甲基丙二酸的水平升高(6)。血清高半胱氨酸和甲基丙二酸升高同神經病學的和精神病學的病征和癥狀(例如震動意識損傷、感覺異常、位置意識損傷、觸摸或疼痛知覺損傷、“糖尿病性”神經病、共濟失調、步態(tài)異常、反射和肌肉力量降低、虛弱、疲勞)以及多種神經病學的和精神病學的疾病有關，包括慢性疲勞綜合征、抑郁癥和多發(fā)性硬化癥，表明鈷胺素缺陷同這些疾病有著普遍的關聯(7)。有趣的是，包括貧血和巨紅細胞癥在內的鈷胺素缺陷一般的血液學病征在這些病人中都普遍缺乏。
以前，患有血管閉塞病或AD的病人都是用葉酸、葉酸鹽或其衍生物以及可選的維生素12等治療(U.S Patent No.6,127 370.Smith等)。然而，給患有高半胱氨酸過多癥的病人服用這些化合物并不是總能夠減緩這種同高半胱氨酸水平升高相關的癥狀。前面提出的證據清楚地顯示了維生素12缺陷的代謝跡象，這種維生素12的缺陷同AD血管病、增齡相關的認知下降和多種神經精神疾病相關，雖然導致這種關聯的精確機理目前還不清楚。
本發(fā)明人證實，在AD病人中，通過高半胱氨酸過多癥反映出來的B12/葉酸鹽缺乏的代謝跡象只是起因于營養(yǎng)狀況(通過體重指標確定)而同可能發(fā)生B12或葉酸鹽吸收障礙的血液學的異常沒有關聯。此外，這種缺陷同血紅細胞葉酸鹽的低水平沒有關系，再次說明攝取/吸收正常，但是與半胱氨酸的血液水平升高有關，證明是高半胱氨酸轉硫作用增加。這些證實由于二次甲基化(remethylation)產生高半胱氨酸過多癥的生化過程缺少了經由轉硫途徑的補償性流出增加。另外，關鍵的抗氧化劑谷胱甘肽的血液水平同病情的嚴重程度呈反相關。
綜上所述，上述發(fā)現表明AD病人是“功能性”維生素B12缺陷，而不是由于維生素吸收降低(例如惡性貧血)造成的“典型”缺陷。最近的報道進一步顯示了支持AD病人功能性維生素12缺陷的證據(8)。報道清楚地顯示了氧化壓力同AD病人血漿以及腦脊髓液中高半胱氨酸濃度升高之間的關系。血管內皮和神經組織對氧化壓力特別敏感。這種壓力作用于維生素B12的細胞內代謝而產生維生素B12的功能性缺陷。內皮細胞和神經元都缺乏完整的轉硫途徑從而削弱了它們合成抗氧化劑谷胱甘肽的能力。兩種組織也都缺乏其它的方式通過甜菜堿，即甜菜堿-高半胱氨酸甲基轉移酶，來再甲基化高半胱氨酸(9)。當甲硫氨酸合 酶反應被氧化壓力削弱時，高半胱氨酸的細胞輸出增加就因此成為這些組織能夠得到的唯一途徑。
本發(fā)明人所認識到的這種由于B12代謝受到氧化壓力的影響而產生“功能性”維生素B12缺陷，可以通過高半胱氨酸和/或甲基丙二酸的血清水平升高，和/或血清總B12的低水平和/或B12運載蛋白質鈷胺素傳遞蛋白全酶(holo-transcobalamin)的低水平來反映。功能性的維生素B12缺陷通常不會發(fā)生任何可證明的維生素吸收障礙以及相關聯的血液組織異常。對這種功能性障礙的認識，使本發(fā)明人發(fā)明了一種用于治療和/或預防與之相關癥狀的方法和組合物。
本發(fā)明的目的就在于提供一種改進的方法來治療或預防個體的功能性維生素B12缺陷，這些個體可能最終會發(fā)生癡呆、其它神經精神性異常和/或血管疾病。這些癥狀都是由于生化途徑中的氧化壓力造成的。
本發(fā)明的進一步目的是提供一種改進了的藥物組合物來用于治療或預防個體的功能性維生素B12缺陷，這些個體可能最終會發(fā)生癡呆、其它神經精神性異常和/或血管疾病。
因此，本發(fā)明的第一個方面提供了一種方法來治療或預防個體的功能性維生素B12缺陷，該方法包括給病人施用治療有效量的藥物組合物，該組合物能夠直接或間接地提供鈷胺素分子的上β-軸配體的鈷-硫鍵，從而促進鈷胺素分子的細胞內加工。
本發(fā)明的第二個方面提供了藥物組合物來治療或預防個體的功能性維生素B12缺陷，該組合物包括化合物或者化合物的組合，直接或間接地為細胞內鈷胺素分子的上β-軸配體提供鈷-硫鍵從而促進鈷胺素分子的細胞內加工。
鈷胺素分子的上β-軸配體的鈷-硫鍵可以通過施用治療有效量的已經含有鈷-硫鍵的巰基化鈷胺素(thiolatocobalamin)直接提供，或者通過聯合施用維生素B12(氰鈷胺)或其帶有含硫分子的衍生物，比如谷胱甘肽或其前體來間接提供。
該藥物組合物能夠促進承受氧化壓力的組織，特別是神經組織和血管內皮的細胞內鈷胺素加工。
任何適當的巰基化鈷胺素都可能直接提供鈷-硫鍵，包括優(yōu)選的化合物谷胱甘肽鈷胺素(CAS；129128-04-7)和相關的具有通式Coα-[α-(5，6-二甲基苯并咪唑基)]-Coβ-配基(ligandyl))鈷胺酰胺的含硫鈷胺素，在這種含硫鈷胺素中上β-軸配體基團通過一個硫鈷鍵同鈷胺酰胺配位，諸如(不限于)亞硫酸鈷胺素(Sulphitocobalamin)(syn-亞硫酸鈷胺素；CAS15671-27-9)、半胱氨酰鈷胺素(CAS；60659-91-8)、環(huán)己基巰基化鈷胺素(cyclohexylthiolatocobalamin)和五氟苯基巰基化鈷胺素(pentafluorophenylthiolatocobalamin)等。
為此，本發(fā)明的第三個方面提供了一種方法用于治療或預防個體的功能性維生素B12缺陷，該方法包括給所述個體施用治療有效量的巰基化鈷胺素。
第四個方面提供了一種藥物組合物用于治療或預防個體的功能性維生素B12缺陷，該藥物組合物包括巰基化鈷胺素。
本發(fā)明的第五個方面提供了一種方法用于治療或預防個體的功能性維生素B12缺陷，包括給所述個體施用治療有效量的維生素B12或其衍生物，該衍生物選自羥鈷胺素、甲基鈷胺素和腺苷鈷胺素結合治療有效量的谷胱甘肽和/或谷胱甘肽化合物的前體，該前體選自N-乙酰半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸、L-氨基乙磺酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、α-硫辛酸、L-α氧噻唑烷-4-羧酸鹽、L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酰乙酯、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥甲苯、γ-谷氨?；腚装彼?、半胱氨酰甘氨酸和乙酰肉堿等化合物用于促進細胞內鈷胺素加工。
本發(fā)明的第六個方面提供了一種藥物組合物用于治療或預防個體的功能性維生素B12缺陷，該組合物包括維生素B12或其衍生物，該衍生物選自羥鈷胺素、甲基鈷胺素和腺苷鈷胺素結合谷胱甘肽和/或谷胱甘肽化合物的前體，該前體選自N-乙酰半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸、L-氨基乙磺酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、α-硫辛酸、L-α氧噻唑烷-4-羧酸鹽、L-γ-谷氨?；?L-半胱氨酰甘氨酸乙酯、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥甲基、γ-谷氨酰基半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸和乙酰肉堿等化合物用于促進細胞內鈷胺素加工。
根據本發(fā)明的這一方面，該藥物組合物優(yōu)選地包括維生素B12，或其衍生物，以及N-乙酰半胱氨酸或α-硫辛酸。
該藥物組合物特別地適用于促進易受氧化壓力影響的神經組織和血管內皮的鈷胺素加工。
應當理解巰基化鈷胺素、谷胱甘肽、谷胱甘肽前體和/或鈷胺素的聯合治療也可以用于病人的治療。
另外，該藥物組合物可以同其它化合物共同使用來幫助針對神經精神性和/或血管疾病的治療作用。例如，該組合物可以同其它一些參與高半胱氨酸代謝的因子共同使用，諸如葉酸鹽和/或維生素B6。該組合物也可以同任何甲基供體共同使用，諸如，但不限于，葉酸、甲基葉酸鹽、S-腺苷甲硫氨酸、甜菜堿、膽堿和肉堿。
任何合適的給藥模式都可以使用，比如(但不限于)口服、舌下、靜脈和腸胃外給藥。
為了更好地理解本發(fā)明和更清楚地表明其是如何起作用的，用下面的實施例作為參考，其中實施例1研究了臨床診斷為阿耳茨海默氏病(AD)病人中高半胱氨酸、血液學指標同癡呆持續(xù)時間之間的關系，實施例2研究了谷胱甘肽前體(N-乙酰半胱氨酸或α-硫辛酸)和羥鈷胺素(維生素B12的一種衍生物)的聯合用藥對患有功能維生素B12缺陷和同時患有神經精神性異常病人的治療效果，實施例3為DSM-IV標準的阿耳茨海默氏型初級退化性癡呆患者的功能性維生素B12缺陷提供了證據，同時還研究了它和認知分值之間的聯系，參考如下附圖，其中


圖1甲硫氨酸合酶反應的主要活化循環(huán)圖解；圖2甲硫氨酸合酶還原酶再活化cob(II)-alamin圖解；圖3高半胱氨酸代謝為谷胱甘肽(GSH)的轉硫途徑圖解；圖4氧化壓力對高半胱氨酸流出的影響以及對神經和血管內皮鈷胺素代謝的影響圖解；圖5點圖顯示了ADAS-Cog分值同DSM-IV標準的阿耳茨海默氏型級退化性癡呆患者(實心圈)和對照(空心圈)血漿谷胱甘肽之間的聯系；本發(fā)明涉及對高半胱氨酸過多癥在與AD、血管疾病和老化共同的致病機理的意義的認識。特別是已經發(fā)現這種機制涉及對高半胱氨酸代謝中關鍵酶周圍的氧化還原狀態(tài)的影響。該機制的一個不可避免的影響就是通過β-配體轉移酶和鈷胺素還原酶的神經細胞內和內皮細胞內鈷胺素加工的異常。由于缺乏關鍵的Co-S鍵而導致該特定的代謝阻斷，目前所用的鈷胺素藥物制劑，比如羥鈷胺素(CAS13422-51-0)、氰鈷胺素(“維生素B12”CAS68-19-9)、甲基鈷胺素(CAS13422-55-4)和腺苷鈷胺素(“輔酶B12”CAS13870-90-1)，不能被神經細胞和血管內皮細胞利用。然而，使用谷胱甘肽鈷胺素或任何相關的有著通式Coα-[α-(5，6-二甲基苯并咪唑基)]-Coβ-配基)鈷胺酰胺的含硫鈷胺素，在這種含硫鈷胺中上β-軸配體基團通過一個硫-鈷鍵同鈷胺酰胺配位(即巰基化鈷胺素)，都能克服這種與氧化還原相關的代謝阻斷。鈷胺素分子上β-軸配體的鈷-硫鍵的存在是鈷胺素的細胞內加工所必須的先決條件。神經元和血管內皮在氧化壓力條件下不能產生該鍵。因此，本發(fā)明所提供的方法和組合物保證了神經元和血管內皮中鈷胺素上存在鈷硫鍵，要么是通過施用巰基化鈷胺素直接提供鈷硫鍵，要么是通過共同施用目前所用形式的維生素B12加上含硫分子谷胱甘肽或它的一種前體，比如N-乙酰半胱氨酸(NAC)或α-硫辛酸，間接地提供鈷硫鍵。
為了能夠確定身體內高水平的高半胱氨酸的影響以及理解氧化壓力對高半胱氨酸水平和鈷胺素代謝的影響，了解這些物質在體內的作用是非常重要的。高半胱氨酸是甲硫氨酸代謝過程中一個關鍵的連接代謝物。高半胱氨酸可以通過甲硫氨酸合酶(MS)的方法被甲基化，或者通過胱硫醚β-合酶(CBS)轉硫而形成胱硫醚。后者隨后被轉換成半胱氨酸，一種還原性谷胱甘肽(GSH)的前體。
針對純化的哺乳動物MS和CBS的研究揭示，這些連接酶(junctionenzyme)對氧化敏感，這暗示這些途徑的氧化還原調節(jié)可能具有重要的生理學意義(10)。大約人肝臟細胞中細胞內GSH池的一半來源于經由轉硫途徑的高半胱氨酸。這些途徑的氧化還原敏感性可以被合理地認為是一種細胞應對氧化壓力而增加GSH合成的自動校正應答。因此轉硫途徑對于保持細胞內GSH池十分重要，而且該途徑的調節(jié)在氧化壓力的條件下會發(fā)生改變。
已經有了相當多的證據暗示了AD中的氧化壓力(11)。由于一些原因，大腦特別容易受到氧化壓力的攻擊。同其它組織相比大腦含有高濃度的催化態(tài)的鐵和相對低水平的抗氧化酶。膜脂非常豐富，而且多不飽和脂肪酸與過氧化反應有關，并具有很高的能量需求，而這種需求幾乎全都由氧化磷酸化滿足的。雖然在大腦老化中普遍發(fā)現氧化反應的損害，但是在AD病人中損害更為嚴重。
而且，氧化壓力最近也和健康老年人的認知下降聯系起來。一項有1166名年齡在60至70歲的高認知功能受試者的研究證實氧化壓力的增加或者抗氧化劑缺陷都是伴隨年齡增長而發(fā)生認知下降的風險因素(12)。
氧化壓力危及癡呆及血管疾病中鈷胺素(維生素B12)代謝的途徑有三個。第一，在正常的甲基化循環(huán)(如附圖中圖1所示)中高半胱氨酸的硫醇鹽與結合MS的甲基鈷胺素的甲基(CH3)基團反應產生甲硫氨酸和4配位的cob(I)alamin。組氨酸(MS的His759)形成低軸鈷配體，替代位于甲硫氨酸合酶疏水口袋(*＝電子)中的二甲基苯并咪唑(DMB)。然后，Cob(I)alamin，高度反應性的鈷胺素種類，與甲基THF的活化形式反應產生游離的THF，同時再生甲基鈷胺素。
經由質子化作用和去質子化作用，甲基鈷胺素在酶結合Cob(III)alamin和游離Cob(I)alamin狀態(tài)之間循環(huán)，如圖1所示。當Cob(I)alamin被異常地氧化為Cob(II)alamin時，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和一個電子源(*)再生MS的激活形式(見圖2)。在其它人鈷胺素依賴酶系統(tǒng)中，包括甲基丙二酰輔酶A變位酶(MCM)，上軸碳-鈷鍵異裂而不是均裂，而且鈷原子保留在相對惰性形式的Cob(II)alamin中。氧化壓力削弱MS的功能，同時相對保留變位酶的活性。因此，氧化壓力的結果就是增加高半胱氨酸的水平。氧化性損害也與鈷胺素類似物的形成有關，這些類似物已經在體內得到證明而且最近在AD中也被發(fā)現(14)。
第二，氧化壓力刺激胱硫醚β-合酶(CBS)活性的一個結果就是增加高半胱氨酸經由轉硫途徑流出(見圖3)。CBS的氧化還原敏感性或許代表了一種自我校正應答，其使細胞在受到氧化壓力的攻擊時增加細胞內谷胱甘肽(GSH)的水平(10)。然而，在神經元中由于缺少胱硫醚酶并因此谷胱甘肽水平低，造成神經元特別容易受到這種影響(圖4，a)，就如在血管內皮細胞中CBS的低活性所造成的結果一樣(圖4，b)。
第三，在神經細胞和血管內皮細胞中，氧化壓力對鈷胺素代謝有著更為嚴重的影響。已經報道過，參與多種類型鈷胺素加工的關鍵酶通過鈷胺傳遞蛋白(TC)隨著傳輸系統(tǒng)進入細胞(15)，見圖4。結合到TC中的鈷胺素不同β-配體形式被內化并且轉化為甲基和腺苷基形式。假如鈷胺素是通過適當的氧化還原形式(Cob(I)alamin或Cob(II)alamin)得到的話，甲基鈷胺素作為甲基轉移反應的中間產物在甲硫氨酸合酶的催化反應中形成。
谷胱甘肽鈷胺素(GS-Cb1)，細胞內自然發(fā)生的一種鈷胺素形式，是鈷胺素酶生物合成中的近前體(15)。β-配體轉移酶(β-LT)是一種利用FAD、NADPH和還原性谷胱甘肽(GSH)的胞質酶。雖然這項研究利用的是氰鈷胺素，但是很有可能CN-Cb1β-配體轉移酶催化新內化鈷胺素與GS-Cb1(專性細胞內中間產物)的一般的β-配體消除反應。
也研究了Cob(III)alamin還原酶(CR)的作用(15)。該研究利用aq-Cb1、GS-Cb1和HSO3-Cb1為底物，但是優(yōu)選地是后兩者。當利用Me-Cb1、Ado-Cb1或CN-Cb1為底物時，很少或著沒有還原酶活性能夠觀察到。反應產物Cob(II)alamin結合到胞質MS上(或者在線粒體中被進一步還原為Cob(I)alamin，之后再轉換為甲基丙二酰輔酶A變位酶的輔因子腺苷鈷胺素)，見圖4。
因此，鈷胺素的細胞內加工需要還原性谷胱甘肽(GSH)來產生鈷胺素的專性細胞內中間產物形式(GS-Cb1)，它有一個必要的鈷-硫鍵。GSH是一種廣泛存在的三肽，由甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸組成。谷胱甘肽參與許多重要的細胞功能，包括蛋白質合成、酶活性、代謝和針對氧化壓力的保護作用。神經元和血管內皮細胞中GSH的合成依賴于其前體的存在。谷氨酸和甘氨酸是通過幾個代謝途徑合成的，因此它們對GSH合成的影響有限。然而神經元和內皮細胞GSH水平卻受到半胱氨酸或其氧化形式胱氨酸的供應情況的強烈影響。半胱氨酸迅速地氧化為胱氨酸，胱氨酸主要存在于細胞外。胱氨酸通過胱氨酸/谷氨酸反向轉運體吸收進神經膠質細胞，繼而還原為半胱氨酸。神經元不能將胱氨酸還原成半胱氨酸，也不能將胱硫醚轉換為半胱氨酸(見圖4，a)，因此依賴神經膠質細胞的半胱氨酸來保持它們的GSH水平。半胱氨酸已經被證實是神經元GSH合成的限速前體。所以神經元中谷胱甘肽的量很低。類似地，血管內皮細胞也缺乏從高半胱氨酸合成內源性半胱氨酸的能力(見圖4，b)。
在氧化壓力條件下，神經元和血管內皮細胞通過轉硫途徑的方法不能增加還原性谷胱甘肽的水平，導致這些組織中還原性谷胱甘肽迅速耗凈。既然這是專性細胞內鈷胺素中間產物谷胱甘肽鈷胺素(GS-Cb1)的必需前體，神經元和血管內皮細胞的鈷胺素代謝就受到了威脅。高半胱氨酸水平因此將會增加，甚至在有害的“前饋”級聯反應中。本發(fā)明人已經認識到只有當神經元和內皮細胞中存在鈷-硫鍵，鈷胺素才能克服這種障礙并且在這些組織中減少高半胱氨酸，同時也認識到這可以通過直接施用巰基化鈷胺素，比如合成的谷胱甘肽鈷胺素(生產方法在GB945772中有敘述)，或者間接地通過聯合施用維生素B12和谷胱甘肽或其一種前體，比如N-乙?；腚装彼?CAS616-91-1)、甘氨酸(CAS56-40-6)、L-谷氨酸(CAS56-85-9)、L-氨基乙磺酸(CAS107-35-7)、L-甲硫氨酸(CAS63-68-3)、α-硫辛酸(CAS62-46-4)、半胱氨酰甘氨酸(CAS19246-18-5)和S-腺苷甲硫氨酸(CAS2998-03-0)，來完成。
實施例1.
研究了臨床確診的AD病人中高半胱氨酸、血液學指標和癡呆持續(xù)期時間的相關性。這是一個假定，如果“典型的”維生素B12吸收障礙產生了維生素B12缺陷的代謝跡象，那么癡呆持續(xù)時間增加就應該與血液學異常的發(fā)展有關。
病人從Wrexham Maelor Psychogeriatric Assessment Service募集，病情特點同阿耳茨海默氏型初級退化性癡呆患者的DSM-IV標準一致。對照是健康的、認知完整、按年齡和性別相配的老年自愿者，來自位于主要是較底社會經濟階層的類似半農村地區(qū)的GeneralPractice人群。病人或者對照人員服用維生素B12或葉酸鹽補充物，或服用已知對高半胱氨酸沒有影響的藥物。
記錄病例組和對照組的認知分值(簡易智能狀態(tài)檢查(MiniMental State Examination，MMSE)和阿耳茨海默氏病評定量表的認知次級量表(Alzheimer Disease Assessment Scale，ADAS-Cog))(16，17)。
在評價時，體重指數(BMI)通過測量身高和體重來確定。癡呆的持續(xù)時間(以月計)盡可能從記錄中確定，或者從最近的親屬或護理人員處得知。
用非禁食的(non-fasting)血液標本進行全血記數、紅細胞葉酸鹽(RCF)、肌酸酐、B12、葉酸鹽和高半胱氨酸檢測。靜脈穿刺后一小時內分離并凍存血液標本。
用自動細胞記數器來測量血紅蛋白(Hb)濃度和MCV(CoulterGen-S，Beckman Coulter，High Wycombe，Bucks，UK)。通過在該儀器上紅細胞體積柱形圖上的頻率計算得到紅細胞分布寬度(RDW)。從寬范圍的細胞體積的細胞可以得到一條寬的曲線，這條曲線產生隆起的RDW。按照制造商提供的方法，用一種自動生化分析儀分析肌酸酐(Synchron LX-20 analyser，Beckman Coulter，HighWycombe，Bucks，UK)，一種自動化學熒光分析儀計量葉酸鹽、維生素B12和RCF(ACS180 SE，Bayer plc，Newbury，Berks UK)。高半胱氨酸用自動HPLC系統(tǒng)(Ds30 Hcy Analyser，Drew Scientific Groupplc，Barrow in Furness，Cumbria，UK)檢測。高半胱氨酸的所有形式都進行檢測，包括蛋白結合的、非蛋白結合的、游離的氧化態(tài)(二聚體和混合的二硫化物)和還原態(tài)的形式。因此，給出的數值通常是指“總”血漿水平。
用Mann-Whitney U檢驗來比較兩組結果。(Statistic for Windowsv5.5，StatSoft，Inc.，Tulsa，OK)。中值(median value)是用四分位距得出。通過使用線性連接單位函數(linear link function)，用廣義線性模型(generalized linear model)來評價變量之間的關系?；貧w系數的可信區(qū)間是95％。
這項研究募集了44個病人和55個對照受試者。關于年齡、性別、BMI和肌酸酐在這兩組人群中都沒有顯著差異。在認知功能分值上病人的分值明顯更低(p＜0.000 1)，見下表1。
表1
Hb、WBC、血小板、MCV、RDW、B12或RCF在兩組之間沒有顯著差異。同對照組相比，病人組的血清高半胱氨酸水平更高(p＝0.0008)而血清葉酸水平更低(p＝0.02)，見下表2。
表2對照 病人Hb(g/dl) 13.4(12.5-14.4)12.8(12-14.0)WBC(×109/1) 6.9(6.1-8.0) 6.9(6.0-8.2)血小板(×109/1) 219(184-277) 219(181-271)MCV(fl) 90.6(87.8-94.0)90.0(87.7-93.5)RDW 13.4(12.9-14.0)13.6(12.9-14.4)B12(ng/l)324(291-445) 328(268-421)葉酸鹽(μg/l) 11.1(8.2-14.5) 9.1(6.4-11.7)RCF(μg/l)332(272-429) 282(243-399)高半胱氨酸(μmol/l) 9.8(8.5-12.5) 12.2(9.4-15.7)廣義線性模型用于確定病人組中血液學變量和疾病持續(xù)時間之間的關系。性別作為另一個變量包括在內。
癡呆持續(xù)時間的增加同血紅蛋白(Hb＝13.67-0.023(-0.003到-0.04)X持續(xù)時間+0.02(-0.2到0.61)X性別；p＝0.02)和血小板數(血小板＝246.6-0.96(-1.79到-0.13)X持續(xù)時間-5.3(-22.2到11.7)X性別；p＝0.03)的輕微下降相關。
疾病持續(xù)時間同WBC、MCV或RDW之間沒有聯系。隨著癡呆持續(xù)時間的增加，高半胱氨酸而不是維生素B下降(高半胱氨酸＝16.4-0.085(-0.17到-0.002)X持續(xù)時間+1.95(0.25到3.65)X性別；p＝0.048)。
這項研究證實了早先的觀察，在臨床診斷為AD的病人中血漿高半胱氨酸增高而血清葉酸鹽水平降低(3、4)。隨著癡呆持續(xù)時間的增加血紅蛋白和血小板數輕微下降，而且血液學指標沒有其它的變化；特別是巨紅細胞癥和RDW同疾病持續(xù)時間也沒有關聯，而且沒有病人貧血。
因此AD病人表現出“功能性”維生素B12/葉酸鹽缺陷而沒有出現“典型的”血液學指標。AD中血清葉酸鹽低而紅細胞葉酸鹽正常說明這些病人是葉酸鹽負平衡，也就是分解代謝的葉酸鹽比吸收的多。
Lindenbaum等(7)認為維生素B缺陷的神經精神病特征要先于血液學變化。然而，目前的資料清楚地顯示在AD病人中的情況并非如此。這證明維生素B缺陷和AD之間的聯系是由于與典型的營養(yǎng)不良或吸收障礙相關綜合征以及它們相關血液學后遺癥完全不同的致病機制所造成。在造血組織相對貧乏AD病人中存在“功能性”大腦B12/葉酸鹽缺陷。
一般認為與AD相關的大腦氧化壓力對維生素B12代謝的影響是這種“功能性”缺陷的原因。氧化壓力增加甲硫氨酸合酶反應過程中產生的維生素B12中間產物形式的氧化，由此削弱了高半胱氨酸的代謝。而且，氧化壓力危害了神經細胞內維生素B12還原為其代謝活性狀態(tài)。由于這種壓力局限在腦組織而造血甲硫氨酸合酶活性相對不受影響，這樣就可以解釋這些病人中沒有貧血和巨紅細胞癥了。
現有的資料還顯示AD和葉酸鹽狀態(tài)之間的關系反映出過度的葉酸鹽代謝。甲硫氨酸合酶失活導致葉酸鹽處于甲基四氫葉酸形態(tài)。多聚谷氨酸反應——細胞內留滯的前提——難以得到葉酸鹽，同時又被釋放到細胞外。既而分泌到尿液中，最后導致葉酸鹽的耗盡。在這一過程中沒有造血組織的參與，這就解釋了紅細胞葉酸鹽值的正常和沒有貧血的原因。
維生素B12(氰鈷胺素)、腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素在β-軸位置上有鈷-硫鍵而羥鈷胺素有一個鈷-氧鍵。因此，由于細胞內谷胱甘肽供應的減少，而細胞內谷胱甘肽是將鈷鍵轉換為鈷-硫鍵并因而成為代謝的活性形式的必須的，所以這些通常使用的藥物衍生物不能被氧化壓力條件下的神經組織利用。谷胱甘肽鈷胺素或相關的巰基化鈷胺素，在它們上面鈷胺素分子的上β-軸配體已經有了一個硫-鈷鍵，可以克服這種氧化還原相關的代謝阻斷，而且因此減少氧化壓力作用于神經組織帶來的癥狀。聯合施用維生素B12和谷胱甘肽或其前體也能夠通過提供不可缺少的鈷-硫鍵來克服這種代謝阻斷。上β-軸配體硫-鈷鍵的供應應該在治療和/或預防與代謝或其它維生素B12缺陷相關的神經精神性和/或血管疾病中特別的應用，特別是那些上面實施例所證明的沒有或沒有明顯貧血和巨紅細胞癥體征的疾病。由于骨髓不象神經組織，它能夠代謝高半胱氨酸，這樣就有充足的谷胱甘肽來抵抗氧化壓力并且產生專性細胞內鈷胺素中間產物——谷胱甘肽鈷胺素——的硫-鈷鍵，所以這種情況不會產生貧血。
實施例2本實例研究了通過聯合施用羥鈷胺素和谷胱甘肽前體(N-乙?；腚装彼峄颚?硫辛酸)產生的鈷-硫鍵對7個患有神經精神性異常病人的癥狀的影響。
病人1在1994年，一位78歲的老年婦女就診了全科醫(yī)生(GP)，幾個月來感覺疲勞、嗜睡、顫抖、睡眠方式紊亂、抑郁和不適。在1991年內科醫(yī)生已經對她的不適癥狀進行了評價，當時她還主訴有痛苦、悲傷、憋氣等感覺，偶爾還有有團塊在喉嚨里的感覺。然而臨床檢查并沒有發(fā)現明顯的特征而且感覺她的問題與焦慮有關。病人的生化和血液學檢查完全正常，于是讓病人離開了。當時沒有檢查病人的維生素B12和葉酸鹽的水平。
1994年的檢查也沒有明顯的臨床上的異常，只有輕微的口角干裂?？紤]到這些年癥狀的持久性，進行了進一步的血常規(guī)檢查。雖然沒有貧血(Hb 11.9)也沒有巨紅細胞癥(MCV 90.0)，但是發(fā)現她的血清維生素B12的水平極低(11ng/l)(實驗范圍＞190ng/l)。一個月后再次檢查該指標，仍然很低只有29ng/l。其血清和紅細胞葉酸鹽的水平正常(分別為12μg/l和299μg/l)。安排了進一步的檢查，發(fā)現病人有胃壁細胞抗體但是沒有內因子抗體。其Schilling檢驗完全正常。開始進行每月的羥鈷胺素注射后病人的感覺非常好。她還發(fā)現當她有時錯過了注射后她的口腔疼痛就會復發(fā)。雖然仍保持輕微的焦慮，但是她的神經精神病癥狀開始很大改善。
然而，病人從1998年起開始緩慢產生記憶損傷同時又出現了悲傷的癥狀。她的記憶損傷有著短期記憶問題的特點，而且伴隨有明顯的漸進惡化。雖然沒有嚴重的行為問題，但是病人在記起名字以及人和名字對號上出現困難。
在2000年3月的智力檢查(mental examination)中，病人表現出親切、合作、健談和高興等情緒。沒有精神運動激動或遲緩的體征，而且也沒有功能性精神病的特點。她沒有過度地悲傷或悲觀，而且在形式和內容上她的談話都顯得合理。然而關于認知功能卻表現出明顯的缺乏。雖然有定時能力，但是仍然可以證明她有短期記憶缺失。在簡易智力狀態(tài)檢查(Mini-Mental State Examination，MMSE)中，她的分值是21/30(16)，同時還感覺她患有早期的癡呆，也許伴隨有相關的抑郁特點。她開始接受抗抑郁劑治療和社會支持。
在接受了6個月的抗抑郁劑治療后，雖然她的抑郁癥特點慢慢改善，但是認知減退卻無情地繼續(xù)著。在這整個時期她一直在接受每月定時的羥鈷胺素注射。一年后，她的認知技能進一步減退。此時(2001年2月)她的MMSE分值為18/30，ADAS-Cog分值為28/70(17)?？紤]到她的神經精神性異常的持久性，除了按時施用羥鈷胺素外，為了確保神經細胞鈷胺素分子上鈷-硫鍵的存在并因此促進神經細胞鈷胺素代謝，在病人知情同意的情況下，在她的治療藥物中每天加入了N-乙?；腚装彼?600mg)。
在兩周后的重新評估中，她丈夫報告了她記憶的一些顯著的改善。她能夠記住曾需努力回憶的名字和面孔。她的自我感覺也相當良好。重復的認知評估表明她的MMSE分值提高到了21/30，同時ADAS-Cog分值也改善了8個點達到20/70。ADAS-Cog分值發(fā)生7個點的變化就被認為有臨床意義(18)。改善的主要方面在定向、記錄，復制能力、單詞回憶、命名(naming)和命令(commands)的分值。在病人的4周評估時這些明顯得到改善的方面仍然保留下來，同時病人的ADAS-Cog分值又增加一分，這證明病人在構成性行為(constructional praxis)上有顯著的改善。
因此該研究證明，聯合給藥維生素B12和其它能夠保證神經細胞鈷胺素分子上鈷-硫鍵存在的化合物(即N-乙?；腚装彼?可以幫助減輕與氧化壓力相關的癥狀，比如認知減退。
病人21995年一位70歲的老年婦女向全科醫(yī)生介紹了她短期記憶丟失的1年病史。她沒有重大的以往病史。在她的初次評估中認知缺陷相對輕微；其簡易智力狀態(tài)檢查分值為27/30。而且，一位看過她病的老年精神病醫(yī)生感覺，此時她的認知缺失并不能斷定為癡呆。然而，在之后的18個月里她的記憶問題惡化。在重新評估中她的智力狀態(tài)檢查分值為26/30，給人感覺她可能患有“增齡相關的記憶損害”。
18個月后再次復查她的認知功能。她丈夫報告說她的記憶似乎更加惡化了，她有時會答非所問。日常生活能力下降。簡易智力狀態(tài)分值下降到22/30，這可以得出結論她一直遭受著緩慢的增齡相關的認知減退。她開始接受乙酰膽堿酯酶抑制物試驗，但遺憾的是由于副作用試驗不得不中斷，而且在第一個數周的治療中沒有明顯的有益效果。
1999年病人接受了進一步的正式認知評估，MMSE分值為22/30，ADAS-Cog分值為19/70。她最明顯的缺陷方面仍然是和短期記憶相關。幾個月之前她開始服用葉酸補充劑，但是癥狀沒有發(fā)生明顯的改變?，F在她的血清維生素B12(195ng/l)和血漿谷胱甘肽(2.1μmol/l)都已經達到臨界低點。她因此開始進行每月注射羥鈷胺素。她丈夫感覺這個治療沒有使她的病情發(fā)生明顯的變化。6個月后，她的認知功能沒有發(fā)生變化；MMSE分值為21/30。由于她谷胱甘肽水平低，在治療方案中加入了口服N-乙?；腚装彼?600mg)。一個月后，她丈夫報告說她似乎更有生氣了、更高興而且更健談。事實上，她的實踐護士注意到許多個月來她第一次可以同她進行合理的交談，而且她的一般行為也有明顯的改善。在正式的認知評估中她的MMSE分值引人注目地提高到了25/30——最顯著的變化在于她重新獲得了幾分鐘后能記住3個物體的能力。
這位婦女患有的是增齡相關的記憶損害而不是癡呆病。雖然每月肌肉注射羥鈷胺素她的癥狀有了輕微的好轉，但是在口服了N-乙酰基半胱氨酸后她的認知分值才得到顯著的改善，特別是在她的短期記憶。本實施例證明保證鈷-硫鍵不僅對阿耳茨海默氏病人而且對普通的年齡相關的認知缺陷的效力。
病人31994年一位77歲的老年婦女向她的全科醫(yī)生介紹了幾個月來不斷嚴重的意識混亂和失意病史。該婦女患有早發(fā)阿耳茨海默氏病。在檢查中她表現出時間定向障礙，但是在方向和人定向上沒有問題。她有明顯的短期記憶損傷。常規(guī)檢查顯示她的維生素B12缺乏(172ng/l(實驗參考范圍＞190ng/l))，但是血清葉酸鹽(10.1μg/l)和RCF(321μg/l)都正常。特別是沒有巨紅細胞性貧血的跡象(Hb 13.4，MCV89.2)。
她開始接受每月羥鈷胺素注射(1000mcg/mg)。然而在之后的2年里精神狀況仍然持續(xù)惡化，同時她開始訴述有疲勞和虛弱等癥狀。后來發(fā)展到視覺幻覺，接著就是迫害妄想。當時(1996)的認知試驗表明雖然她知道自己的地址，也有正常的工作記憶，但是時間定向力卻很差。雖然她私人細節(jié)的逆行性(retrograde)記憶很好，但是順行性記憶卻很差。她的語言使用較好，但是對一些低頻詞有命名障礙，而且重復能力差。書寫也受到影響。她表現出構造性運用障礙形式的頂葉(parietal lobe)功能障礙體征。額葉功能較好。感覺她可能患有阿耳茨海默氏型癡呆病。她被送到護理病房，但是她的一般狀況繼續(xù)在惡化。在1997年的進一步認知檢查中MMSE分值只有13/30。
她開始接受乙酰膽堿酯酶抑制物的治療，而且其家人感覺她的狀態(tài)有了輕微的改善。在重復評估中她的MMSE分值為15/30；她仍然分不清時間，但是沒有命名性言語困難(nominal dysphasia)，而且其注意力和集中能力也合理。結合按時服用羥鈷胺素的藥物治療繼續(xù)進行。
然而她的身體狀況以及精神狀況在持續(xù)惡化，而且在1998年發(fā)展到言語困難和體重下降。當時在一項簡化的智力試驗中她的分值只有3/10。她被允許住院并發(fā)現患有了3級食管炎。在接受了質子泵抑制物治療后她的吞咽困難癥狀慢慢解除了。
然而她的一般身體狀況和精神狀況在持續(xù)惡化。2001年6月每日口服600mg的N-乙?；腚装彼岜患尤氲街委熤?，雖然當時她正患有嚴重的癡呆。然而她的家人和護理人員注意到并認為通過治療她的狀況有了明顯的改善。她變的比通常更加靈敏和聰明，而且似乎可以認出她的至親家人；考慮到癡呆的嚴重程度和身體狀況，沒有讓她接受正式認知評估。幾周后她的身體狀況惡化并死于支氣管肺炎。
這個婦女很可能患有阿耳茨海默氏型癡呆病同時伴隨有維生素B12缺陷。然而這種缺陷不太可能是由于營養(yǎng)不良(她的葉酸鹽耗盡)或吸收障礙(沒有巨紅細胞貧血或血液學問題的跡象)。很可能的是她有“功能性”維生素B12缺陷，這種缺陷是與阿耳茨海默氏病相關的大腦氧化壓力的結果。在試圖用羥鈷胺素校正該缺陷時不能阻止她的認知減退。然而即使在疾病后期，身體狀況惡化，由于聯合給藥N-乙酰基半胱氨酸和羥鈷胺素來提供了神經元鈷胺素上軸配體的鈷-硫鍵，她的精神狀態(tài)仍然得到了改善。
病人41994年一位65歲的老年男性向他的全科醫(yī)生介紹了他漸進性記憶損害的三年病史。他的妻子報告說他經常會忘記關門或鎖車。他沒有迷路病史(wandering history)或任何抑郁病的特征提示。他的食欲很好，也沒有體重下降病史。他最近在洗澡和穿衣方面出現了困難。他沒有重大的以往醫(yī)療史，也沒有精神病或癡呆的家族病史。
體檢沒有發(fā)現明顯的問題，也沒有神經學方面的缺陷。在智力狀態(tài)檢查中他分得清地點和人，但分不清時間。他在復制圖形(copyingfigures)上有困難，而且有中度到嚴重的近期和遠期記憶損害。他不能正視自己的記憶喪失，還否認有任何特別的憂慮或問題。他的簡易智力狀態(tài)分值為17/30，CAMDEX分值54。
包括血細胞數、尿液和電解質、葡萄糖、肝和甲狀腺功能測試在內的血常規(guī)檢查都在正常范圍內。他的血清維生素B12和葉酸鹽水平也分別在274ng/l和3.9μg/l的正常范圍內(正常范圍＞190ng/l和＞2.2μg/l)。他的紅細胞葉酸鹽也正常，為396μg/l(正常范圍＞170μg/l)。然而他被發(fā)現有明顯升高的禁食血清高半胱氨酸23.7μmol/l)。腦部CT顯示有中度的大腦萎縮但沒有其它的異常。
幾位老年精神病專家對他進行了檢查，診斷為可能具有阿耳茨海默氏型癡呆。根據其高半胱氨酸異常的結果，他開始接受每月的羥鈷胺素注射(1,000mg/ml)以及葉酸補充(每天5mg)。然而他的認知功能仍然繼續(xù)緩慢地惡化。到了1997年他的妻子發(fā)現在家照顧他變的越來越困難。當時給人的感覺是由于嚴重的癡呆他不適合使用乙酰膽堿酯酶抑制物。他被送到專門的護理病房接受全天的護理。在這整個時期他一直在接受每月的B12注射和口服葉酸鹽補充物治療。
1999年對他的認知功能再次進行了正式的評估。當時他的簡易智力狀態(tài)檢查分值只有5/30，ADAS-Cog評估分值只有70，確定了嚴重的癡呆?，F在他的血清高半胱氨酸水平為5.7μmol/l，剛好在正常范圍內，但是血漿谷胱甘肽的水平低，為2.5μmol/l(正常范圍在3-5μmol/l)。因此作為口服谷胱甘肽前體，每天加入600mg的N-乙?；腚装彼岬剿腂-維生素補充治療中。雖然認知分值沒有提高，但是他明顯地減少了焦慮不安，更加聽從對他的護于照顧，而且他的護理人員注意到他的查字能力也很有提高。他的一般行為有了顯著的改善。在治療中加入N-乙?；腚装彼峤o他妻子留下了深刻的印象；許多年來他第一次嘗試和妻子交流?，F在當妻子來看望他時他一再地好象認識她，這讓妻子非常震動。在他的治療從N-乙酰基半胱氨酸變?yōu)?0mg每天兩次另一種谷胱甘肽前體α-硫辛酸后的一年中她的臨床改善得到保持。
血清高半胱氨酸水平顯著升高表明病人患有伴隨功能性維生素B12缺陷的阿耳茨海默氏型癡呆。雖然每月的羥鈷胺素注射和口服葉酸鹽補充物治療校正了血清高半胱氨酸的水平，但是卻不能停住癡呆的進程。然而，在他的疾病后期，發(fā)現他谷胱甘肽的血漿水平低。因為這是維生素B12細胞內加工的必需前體，所以嘗試通過聯合給藥N-乙酰基半胱氨酸來增加他的谷胱甘肽水平。這導致病人的一般健康狀況和行為癥狀都有了明顯的改善，而且當藥物改為谷胱甘肽的另一個前體——α-硫辛酸——后這種臨床上的改善依然能夠保持。這證明即使在癡呆的發(fā)展階段，保證維生素B12上軸配體上鈷-硫鍵的供應仍然可以得到臨床改善。
病人5一位46歲的老護士向慢性疲勞門診的專家介紹了她許多年來極度疲勞的病史。這種疲勞開始于年青的時候，她描述這是一種“難以置信的疲勞”。
作為檢查的一部分，分別在1994年的4月和9月這兩個不同的時間進行了腰椎穿刺。兩次她的CSF-高半胱氨酸水平都有升高，分別是0.42和1.00μmol/L(參考值＜0.25)。血清高半胱氨酸水平正常，為13.2μmol/L，血清MMA也正常，為0.10μmol/L(參考值＜0.37)。CSF中維生素B12水平相對較低，為8.8(正常值在10-15pmol/L)。
1994年5月她開始接受每周兩次的甲基鈷胺素形式的維生素B12皮下注射(Methycobal0.5mg/ml)。僅僅在第三次注射后她就感到有了明顯的好轉。她描述說這就好象“…我的頭以前被袋子套住了而現在我被釋放了”。而且她的顎右側和舌部的麻木感覺也消失了。4個月后她報告說她的專心能力和記憶也有了提高，同時工作能力和一般健康狀況也得到了改善。她的說話能力逐漸改善而且更加流暢，錯誤也減少(有些人稱之為注意力)。
1994年9月其停止注射維生素B12。兩周后她對光線和聲音非常敏感，同時注意力集中困難，也無法進行日報上任何文章的閱讀。發(fā)展到嘴唇、舌和咽有麻刺感，“…就象麻醉感覺消退時一樣”。1994年10月她接受了神經心理學家的試驗(STROOP檢驗)，結果顯示她比治療期間明顯加重了。
在重新接受維生素B12注射后她的感覺再次變好了，直到1995年1月，當她開始清除另一顆牙的汞合金時。這次她感覺到“一種麻痹性的疲勞”而且面部麻痹的感覺又重新出現。雖然這種感覺在慢慢的好轉，但她仍然需要頻繁地注射維生素B12(每周3次)。這次對亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因的不耐熱變種進行了基因分型，結果顯示正常(677C為純合的)。
在以后的幾年中她一直在緩慢地好轉。到1998年12月，雖然她的感覺更好了，但她依然需要每晚睡10小時以上以便保證有良好的感覺。除了工作以外，她現在還能夠更加積極地照顧家庭和兩個孩子。她一直去慢性疲勞門診看病。2001年4月她的維生素B12治療方案中又加入了每天口服400mg的N-乙?；腚装彼?。僅僅一個月后她就感到“更有活力而且頭疼也減少了”。她對這個補充治療非常認可，盡管有胃腸方面的副作用，仍然肯定地要堅持使用。她在持續(xù)地好轉，3個月后不再需要以前的那么多的睡眠了。最重要的是她現在已經能夠將維生素B12的注射次數減少到每周一次了。她現在報告說頭疼也幾乎完全消失了。
該病人有慢性疲勞綜合征的臨床特點，而且還表現出中樞神經系統(tǒng)維生素B12代謝問題。這通過腦脊髓液中高半胱氨酸水平增高暗示了功能性維生素B12缺陷這點反應出來的。這幾年來她的臨床狀態(tài)雖然穩(wěn)定的非常緩慢但卻是顯著的。她可能對金屬過度敏感，包括鎳，牙汞合金的清除也可能對病情的改善起到了作用。然而她的明顯好轉與開始甲基鈷胺素的注射相關；注射效果通過1994年停止注射后病情明顯惡化得到證實。在維生素B12治療中加入谷胱甘肽前體N-乙?；腚装彼崾顾呐R床狀態(tài)得到進一步顯著的好轉，同時她注射次數也能夠大大減少。
病人6
一位54歲的女內科醫(yī)生在39歲時第一次急性發(fā)病。癥狀和體征表明腦干感染，同時被診斷多發(fā)性硬化。她表現出“大腦活動緩慢”、感覺疲勞和嗜睡。雖然在之后的3-4年有緩慢的好轉，她仍然發(fā)展出一些新的癥狀包括腿部“沉重”感、步態(tài)輕微受損、從坐的地方站起困難、單眼視覺模糊、本體感受困難和時間以及空間定向力減弱。
44歲時接受了尿液高半胱氨酸檢查。高半胱氨酸水平升高，因此她開始按時注射維生素B12。不久她就注意到癥狀有了明顯的改善；她所有的視覺和本體感受問題以及定向力問題都有了好轉。
然而她仍然保留了某些“腦損傷綜合征”的體征。神經專家將這種病描述為一種情感無力綜合(astheno-emotional syndrome)，包括右側面部麻痹、發(fā)音困難和聽覺失語等個別體征。聽覺失語通過頭掛聽筒和一種使聲音同步化更佳的電子裝置來彌補。雖然進展緩慢，但是她的持久的慢性疲勞和無法忍受壓力使和她不能回到內科醫(yī)生的工作崗位。
在54歲時，她的治療包括了每日口服1mg的鈷胺素和5mg的葉酸。NAC也加入到了治療方案中。4個月后她報告說由于胃腸的副作用她只能每天服用100mg。不過，她感覺到“明顯的好轉”。她發(fā)現頭疼減少了。她的專心能力有了提高，這使她現在可以閱讀和理解甚至復雜的材料。她的疲勞程度也減輕了，而且晚上也能睡更長的時間了。
推測這為內科醫(yī)生為多發(fā)性硬化。通過尿液高半胱氨酸水平升高可以顯示她有功能性維生素B12缺陷的跡象。雖然維生素B12補充改善了她的癥狀，但是聯合服用N-乙?；腚装彼醽硖峁┾捤刈由陷S配體的鈷-硫鍵，使她的癥狀得到了進一步顯著的改善。
病人71996年，一位81歲的老年男性因為5年來短期記憶的惡化引起了他的全科醫(yī)生的注意。他沒有非常相關的以往醫(yī)療史。家族病史中，他的兄弟姐妹中有兩人有過帕金森病和腦血管意外。
檢查發(fā)現他的脈跳輕微不規(guī)則、達到高血壓的臨界(150/90)而且還注意到有肢端寒冷，但是沒有發(fā)現其它明顯的異常。在幾分鐘后他不能記住3個詞。常規(guī)檢查沒有發(fā)現異常；特別是沒有貧血(Hb 14.7)、MCV正常、血清總B12(324ng/l)和葉酸鹽(13.3μg/l)水平正常，而且甲狀腺功能試驗也正常。
感覺上他患有老年癡呆。他的狀態(tài)逐漸惡化，但是大約在1997年的幾周內顯著惡化。當時他經常跌倒，而且意識錯亂現象增加。引人注意的是他傾向于向右跌倒，他右側虛弱，而且有不明確的跖反射。給人的感覺是他可能患有TIA，并允許住進了醫(yī)院。CT檢查顯示出腔隙性梗塞。同時他還得了胸部感染。感染用抗生素治療，他的意識錯亂和移動性有了輕微的好轉。他開始服用阿斯匹林并出院回家。
然而在之后的幾個月里他的病情繼續(xù)惡化，不時地有言辭攻擊性，表現出說話重復，同時變的越來越激動。1998年的一個認知評估顯示，他缺乏年代定向力，無法叫出首相或美國總統(tǒng)的名字，在幾分鐘后就想不起檢查大夫的名字，在試驗中他不能在一個鐘面上正確地畫出數字，這證明有視覺空間認識困難，也不能復制出三維立方圖形。他沒有抑郁的特點、沒有妄想、沒有交往方面的問題或睡眠障礙。引人注意的是他的步態(tài)不穩(wěn)，而且大多數的日?；顒佣奸_始需要幫助。不過在后面的幾周內他的狀況有了一些改善，因此當時就撤除了老年精神病鑒定服務機構的護理。
1999年他發(fā)展到睡眠障礙和漸增的認知缺失。他的精神激動加重，但是能用甲硫達嗪控制。他跌倒的次數增加，為此在年末時要求住院治療。他的一般狀況全面惡化，而且他妻子發(fā)現在家里很難應付和照顧他。他有單詞查找困難和經常閑談、自我照顧能力下降、經常迷路、腳下不穩(wěn)、缺乏自知力、發(fā)展到易怒、怨恨和多疑的情緒，和他病前開朗的性格有了很大的不同。
他接受了全天的護理，開始住在住宅房內，但是由于無法應付他不斷增加的提要求的行為，不久就搬到了護理房間。
2001年，發(fā)現他的血漿高半胱氨酸水平高達19.8μmol/l(正常水平＜16μmol/l)，B12和葉酸鹽水平比以前低(分別為297ng/l和4.7μg/l)，他的紅細胞葉酸鹽正常(204μg/l)，也沒有巨紅細胞貧血的跡象(Hb 13.4，MCV 91)。因此，他有功能性維生素B12缺陷的跡象，并開始接受每周注射羥鈷胺素和口服葉酸鹽添加物的治療。然而他的認知功能沒有明顯的好轉。這時他的ADAS-Cog評估分值為68，這顯示癡呆到了顯著的程度。通過在治療方案中加入每天600mg的NAC來間接提供鈷胺素上軸配體的鈷-硫鍵。經過一個月的治療，他的ADAS-Cog分值增加了6分。護理房間的工作人員評價說他的情緒激動減少了，而且更滿足了。特別是她的妻子感覺到他好多了，更安定、也更靈敏了。
老人狀態(tài)的“階梯式”惡化、不規(guī)則分布的缺失、臨界高血壓、肢端寒冷、腦血管意外的家族病史、局灶神經學體征和癥狀以及與CT掃描出的腔隙性梗塞相關的癥狀學上的突然惡化，都有力地支持了病人血管性癡呆的診斷。而且他有功能性維生素B12缺陷的生化證據，沒有貧血。這實施例證明患有血管性癡呆的病人，通過聯合施用羥鈷胺素和N-乙?；腚装彼醽黹g接產生鈷胺素上軸配體的鈷-硫鍵，病情有顯著的臨床改善。
實施例3.
在阿耳茨海默氏病中血漿高半胱氨酸水平升高，但是幾乎不知道該病中其它的氨基硫醇(aminothiols)的水平。評估這些相關代謝產物的水平將有助于確定升高的高半胱氨酸的生化部位。因此，測定病人和對照組的總血漿高半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽和半胱氨酰甘氨酸水平，同時研究它們和認知分值之間的關系。
50名具有DSM-IV標準的阿耳茨海默氏型的初級退化性癡呆特征的病人，57名認知完整、并按年齡-性別相匹配的對照受試者，都接受MMSE和ADAS-Cog分值試驗。用Drew Scientific DS30 Hcy Analyser來檢查氨基硫醇。使用了高半胱氨酸破壞性藥物包括維生素B12、葉酸和激素替代治療的受試者不進入資料分析。記錄病歷組和對照組的MMSE和ADAS-Cog分值(16、17)。后者反映出幾種認知域而且非常有效。它對伴隨時間的認知變化非常敏感，這樣就給進一步的研究提供了有用的原始資料(baseline)。
受試者們以前受過的教育也要確定(“無、初級、中間、中級和更高”)，因為這關系到正常的增齡性認知下降(19)。吸煙(“當前、沒有(ex)和從不”)以及高血壓狀態(tài)有都要記錄，這些關系到對高半胱氨酸的最恰當的評價(20)。為了統(tǒng)計學分析的目的，將受教育情況和吸煙作為順序變量，將高血壓狀態(tài)作為分類變量。在評估時測量身高和體重來計算體重指數(BMI)。實驗得到了倫理學上的許可，也獲得了知情同意書。
非禁食的血液樣品用于檢驗全血細胞數、紅細胞葉酸鹽(RCF)、肌酸酐、B12、葉酸鹽和氨基硫醇。靜脈穿刺后一小時內就要進行樣品的分離和凍存，直到進行氨基硫醇的分析。
用自動細胞記數器來測量血紅蛋白(Hb)濃度和平均細胞體積(MCV)(Coulter Gen-S，Beckman Coulter，High Wycombe，Bucks，UK)。按照制造商建議的方法，用自動生化分析儀分析肌酸酐(SynchronLX-20 analyser，Beckman Coulter，High Wycombe，Bucks，UK)，用自動化學熒光分析儀測量葉酸鹽、維生素B12和RCF(ACS180SE，Bayerplc，Newbury，Berks UK)。用自動HPLC系統(tǒng)分析氨基硫醇(Ds30 HcyAnalyser，Drew Scientific Group plc，Barrow in Furness，Cumbria，UK)。對每種氨基硫醇，包括蛋白質結合的、非蛋白質結合的、游離的氧化態(tài)(二聚體和混合的二硫化物)和還原態(tài)的形式都進行測量。給出的數值通常是指“總”血漿水平。
兩組比較(Wilcoxon-Mann-whitney檢驗)，中值(median)之間差異的可信區(qū)間為95％(Hodges-Lehmann estimates)，用精確的非參數的方法(StatXact 4 for Windows，Cytel Software Corporation，Cambridge，MA)來進行相關性(association)測定。使用常規(guī)技術來進行回歸分析和廣義線性模擬分析(Statistica for Windows v5.5，StatSoft，Inc.，Tulea，OK)。嶺(ridge)回歸——常規(guī)回歸分析的延伸——用于校正自變量之間的可能關聯。為了廣義線性模擬分析，連續(xù)變量被指定作為因變量，使用線性連接單位函數(linear linkfunction)并將分類變量、順序變量和連續(xù)變量合在一起作為自變量。模型參數的意義用χ2檢驗來評價。中值是用四分位距表示，單回歸系數用95％(95％CI)的可信區(qū)間表示。
結果50名AD病人(17位男性和33位女性)和57名對照(23位男性和34位女性)。兩組的年齡中值都是79歲(AD病人為75-83歲，對照為72-85歲)。AD病人發(fā)病時間中值為24(13-36)個月，而發(fā)病年齡中值為77歲。
在BMI、教育程度或吸煙狀態(tài)上病歷組和對照組沒有差異。病人組收縮壓中值比對照組低(病人130(120-140)mmHg，對照組145(130-160)mmHg，95％CI差異0-20，p＝0.01)，舒張壓也比對照組低(病人80(70-82)mmHg，對照組85(79-95)mmHg，95％CI差異5-10，p＝0.0005)。
在檢驗氨基硫醇之前血漿樣品儲存時間的中值為12個月(范圍在1-23個月)?；貧w分析用于評價儲存時間對檢驗的影響。在總的資料中(病歷組加對照組)，儲存時間對高半胱氨酸和谷胱甘肽的水平沒有影響。隨著儲存時間的延長半胱氨酸和半胱氨酰甘氨酸水平有小幅下降半胱氨酸＝142.3-2.33X儲存月數(p＝0.0002，95％CI-0.52～-1.14)，半胱氨酰甘氨酸＝20.9-0.26X儲存月數(p＝0.007，95％CI-0.43～-0.09)。作為附加分類自變量所增加的診斷表明在病歷組和對照組之間儲存時間的影響沒有差異。
AD病人的葉酸鹽顯著降低，而血漿高半胱氨酸和半胱氨酸卻顯著升高。Hb、血小板、MCV、肌酸酐、B12、RCF、半胱氨酰甘氨酸和谷胱甘肽在兩組之間都沒有差異，見下表3。
表3對照病人P-值(95％CI的中值間的差異)BMI24.1(22.1-28.4) 24.6(22.5-27.4)MMSE 28(27-29)18(14-21) p＜0.0001(8-12)ADAS-Cog 9(7-12) 32(24-39) p＜0.0001(19-26)Hb，g/dl 13.4(12.5-14.4) 12.9(12.0-14.2)血小板，×109/1 218(184-277) 216(182-273)MCV，f190.4(87.8-94.0) 90.4(88.4-93.6)肌酸酐，μmol/l84(72-102) 87(72-115)B12，ng/l 324(276445) 334(268-421)葉酸鹽，μg/l 10.5(8.1-14.5) 9.0(6.3-11.6) p＝0.018(0.4-3.8)RCF，μg/l 330(272-425) 282(243-399)高半胱氨酸，(μmol/l) 9.6(8.2-12.5)12.6(9.6-15.8)p＝0.0006(1.2-4.3)半胱氨酸，(μmol/l)107.2(94.7-129.4)120.1(102.0-142.4)p＝0.007(3.6-23.7)半胱氨酰甘氨酸，(μmol/l) 17.7(15.5-20.3) 17.5(15.4-21.1)谷胱甘肽，(μmol/l)2.5(2.2-2.9) 2.7(2.2-3.3)在病人中，MMSE分值的減少和血漿谷胱甘肽的減少相關MMSE＝8.27+3.56X谷胱甘肽(p＝0.002，95％CI0.29～6.82)。與之類似，ADAS-Cog分值的增加與血漿谷胱甘肽的下降有關ADAS-Cog＝54.9-8.39X谷胱甘肽(p＝0.002，95％CI-13.6～-3.22)，見圖5。已知高半胱氨酸本身就可以影響認知功能(1)(3)，為了防止出現這些相關性是由它們之間的相互關聯所造成的假象的可能性，將血漿高半胱氨酸、半胱氨酸和半胱氨酰甘氨酸作為附加自變量進行嶺回歸分析。分析證實，血漿谷胱甘肽是唯一可以作為MMSE和ADAS-Cog分值的有獨立統(tǒng)計意義的預報指標的氨基硫醇。
在對照組中，MMSE同谷胱甘肽、高半胱氨酸、半胱氨酸和半胱氨酰甘氨酸之間沒有相關性。隨著血漿谷胱甘肽的減少ADAS-Cog分值增加ADAS-Cog＝29.6-0.61X谷胱甘肽(p＝0.04，95％CI-1.21～-0.002)，但是在嶺回歸模型中，這種關聯在加入高半胱氨酸、半胱氨酸和半胱氨酰甘氨酸后消失。
另一個可能混淆的因子是年齡、吸煙狀態(tài)、高血壓情況和受教育年限，這些因素可能影響血漿谷胱甘肽和認知分值之間的關系。用廣義線性模擬技術來評價這些因子加上血漿谷胱甘肽對ADAS-Cog和MMSE分值的影響。結果證實谷胱甘肽在本研究中是認知表現的獨立預報指標，見下表4。
表4記分系統(tǒng)自變量 Log似然 χ2(1 d.f.) P-值ADAS-Cog年齡-72.33 0.35 0.55教育-76.55 8.78 0.003吸煙-72.42 0.52 0.47谷胱甘肽-75.15 5.98 0.014高血壓 -76.83 9.34 0.002MMSE年齡-56.98 0.0001 0.99教育-58.26 2.56 0.11吸煙-57.33 0.69 0.40谷胱甘肽-60.57 7.18 0.007高血壓 -58.59 3.22 0.07因此，谷胱甘肽是病人中認知分值的一個非常重要而又獨立的預測指標(p＝0.002)；低血漿水平和更加嚴重的認知損害有關。血漿高半胱氨酸和半胱氨酸在阿耳茨海默氏病中升高，意味著病人的轉硫作用完整并增加，但高半胱氨酸的再甲基化異常。這些發(fā)現反映出氧化壓力對含硫氨基酸代謝的關鍵酶有不同的影響。
谷胱甘肽鈷胺素和相關的巰基化鈷胺素可以用來預防所有與細胞內谷胱甘肽偏低包括增齡相關的疾病和病癥中功能性維生素B12缺陷。應當理解這些病人最后肯定將發(fā)展到維生素B12缺陷，但是在疾病的早期階段，這種缺陷可能沒有明顯的代謝跡象。
哺乳動物細胞中還原性谷胱甘肽水平與廣泛的病理生理學狀態(tài)相關，包括肝細胞功能障礙、惡性腫瘤、HIV感染、肺病、帕金森病、相關的免疫學疾病和生理狀態(tài)。下面列出目錄只是用于舉例目的而且也沒有窮盡撲熱息痛中毒、ADD、艾迪生氏病(Addison’s Disease)、老化、AIDS、斑禿(Alopecia Areata)、ALS、阿耳茨海默氏病、貧血(溶血)、強直性脊柱炎、血管硬化(動脈硬化)、關節(jié)炎(類風濕)、哮喘、孤獨癥、自身免疫疾病、貝切特氏病(Behcet’s Disease)、燒傷、惡病質、癌癥、念珠菌感染、心肌病(原發(fā)性的)、慢性疲勞綜合征、結腸炎、冠狀動脈病、纖維囊泡癥、糖尿病、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、唐氏綜合征(Down’s syndrome)、濕疹、肺氣腫、Epstein Barr Viral(EBV)綜合征、纖維肌痛(fibromyalgia)、自由基過載、肺出血腎炎綜合征、格雷夫斯氏病(Grave’s Disease)、肝細胞功能障礙(肝病)、乙型肝炎、丙型肝炎、血膽固醇過多(高血膽固醇)、皰疹、感染(病毒性、細菌性和真菌性)、炎性腸病(IBD)、狼瘡、黃斑變性(老年性和糖尿病性黃斑變性)、營養(yǎng)不良、梅尼爾氏病(Meniere’s disease)、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、神經變性病、營養(yǎng)性疾病、帕金森氏病、尋常型天皰瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬變、早老癥、牛皮癬、風濕熱、結節(jié)病、硬皮病、帶狀皰疹、中風、毒物中毒、脈管炎、白癜風和韋格納肉芽腫病。
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權利要求
1.用于治療和/或預防功能性維生素B12缺陷的藥物組合物，該組合物包含化合物或化合物的組合，通過直接或間接地提供細胞內鈷胺素分子的上β-軸配體的鈷-硫鍵，從而促進鈷胺素的細胞內加工。
2.權利要求1的藥物組合物，其中所述的化合物是巰基化鈷胺素。
3.權利要求2的藥物組合物，其中巰基化鈷胺素是谷胱甘肽鈷胺素。
4.權利要求1的藥物組合物，其中該組合物是維生素B12或其衍生物組合含硫分子。
5.權利要求4的藥物組合物，其中含硫分子是谷胱甘肽或其前體。
6.權利要求5的藥物組合物，其中谷胱甘肽前體選自N-乙?；腚装彼?、甘氨酸、L-谷氨酸、L-氨基乙磺酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、α-硫辛酸、L-α氧噻唑烷-4-羧酸鹽、L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酰乙酯、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥甲苯、γ-谷氨?；腚装彼?、半胱氨酰甘氨酸和乙?；鈮A。
7.權利要求1～6任一項中的藥物組合物，其中所述組合物有利于神經組織和血管內皮中鈷胺素的加工。
8.權利要求1～7任一項中的藥物組合物，該組合物用于治療和/或預防神經精神性和/或血管性疾病。
9.權利要求8中的藥物組合物，進一步地包含一種或多種的附加化合物，用以幫助治療或預防神經精神性和/或血管性疾病。
10.權利要求9中的藥物組合物，其中的一種或多種的附加化合物是參與高半胱氨酸代謝的因子。
11.權利要求10中的藥物組合物，其中附加的因子是葉酸鹽和/或其衍生物，和/或維生素B6。
12.權利要求9、10或11中的藥物組合物，其中包括一種或多種的甲基供體。
13.權利要求12中的藥物組合物，其中的甲基供體選自葉酸、甲基葉酸鹽、S-腺苷甲硫氨酸、甜菜堿、膽堿、肉堿。
14.用于治療和/或預防功能性維生素B12缺陷的藥物組合物，該組合物包含通式為Coα-[α-(5，6-二甲基苯并咪唑基)]-Coβ-配基]鈷胺酰胺的巰基化鈷胺素，它的上β-軸配體基團通過硫鈷鍵同鈷胺酰胺配位。
15.權利要求14中的藥物組合物，其中所述的巰基化鈷胺素是谷胱甘肽鈷胺素。
16.權利要求14中的藥物組合物，其中的巰基化鈷胺素選自亞硫酸鈷胺素、半胱氨酰鈷胺素、環(huán)己基巰基化鈷胺素和五氟苯基巰基化鈷胺素。
17.權利要求14～16任一項中的藥物組合物，用于治療或預防神經精神性和/或血管性疾病。
18.用于治療和/或預防個體功能性維生素B12缺陷的藥物組合物，該組合物包含維生素B12或其選自羥鈷胺素、甲基鈷胺素和腺苷鈷胺素的衍生物，結合谷胱甘肽和/或谷胱甘肽化合物前體，這種谷胱甘肽化合物的前體選自N-乙?；腚装彼?、甘氨酸、L-谷氨酸、L-氨基乙磺酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、α-硫辛酸、L-α氧噻唑烷-4-羧酸鹽、L-γ-谷氨?；?L-半胱氨酰甘氨酰乙酯、丁基化羥茴香醚、丁基化羥甲苯、γ-谷氨酰基半胱氨酸和半胱氨酰甘氨酸和乙酰肉堿用以促進鈷胺素的細胞內加工。
19.權利要求18中的藥物組合物，包含維生素B12或其衍生物和N-乙?；腚装彼?。
20權利要求18中的藥物組合物，包含維生素B12或其衍生物和α-硫辛酸。
21.治療和/或預防個體功能性維生素B12缺陷的方法，該方法包含給個體施用治療有效量的組合物，該組合物直接或間接地提供細胞內鈷胺素分子的上β-軸配體的鈷-硫鍵，從而促進鈷胺素的細胞內加工。
22.權利要求21中的方法，其中鈷胺素的上β-軸配體是通過施用治療有效量的巰基化鈷胺素直接提供的。
23.權利要求22中的方法，其中的巰基化鈷胺素是谷胱甘肽鈷胺素。
24.權利要求21中的方法，其中鈷胺素分子上β-軸配體的鈷-硫鍵是通過聯合施用維生素B12(氰鈷胺素)或其衍生物和含硫分子間接提供的。
25.權利要求24中的方法，其中含硫分子是谷胱甘肽或其前體。
26.權利要求25中的方法，其中谷胱甘肽前體選自N-乙?；腚装彼?、甘氨酸、L-谷氨酸、L-氨基乙磺酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、α-硫辛酸、L-α氧噻唑烷-4-羧酸鹽、L-γ-谷氨?；?L-半胱氨酰甘氨酰乙酯、丁基化羥茴香醚、丁基化羥甲苯、γ-谷氨?；腚装彼帷腚装滨８拾彼岷鸵阴Ｈ鈮A。
27.權利要求21～26任一項的方法，其中的組合物促進神經組織和血管內皮中鈷胺素的加工。
28.權利要求27中的方法，進一步包含與該組合物聯合施用一種或多種的附加化合物，用以幫助治療或預防神經精神性和/或血管性疾病。
29.權利要求28中的方法，其中的一種或多種的附加化合物是參與高半胱氨酸代謝的因子。
30.權利要求29中的方法，其中附加的因子是葉酸鹽和/或其衍生物，和/或維生素B6。
31.權利要求28、29或30中的方法，其中的組合物包括一種或多種的甲基供體。
32.權利要求31中的方法，其中的甲基供體選自葉酸、甲基葉酸鹽、S-腺苷甲硫氨酸、甜菜堿、膽堿、肉堿。
全文摘要
一種用于治療和/或預防介體功能性維生素B
文檔編號A61P17/02GK1537009SQ02810724
公開日2004年10月13日 申請日期2002年4月22日 優(yōu)先權日2001年4月25日
發(fā)明者A·麥卡登, A 麥卡登 申請人:科拜慈有限公司