專利名稱：用于預(yù)防反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，涉及一種具有預(yù)防和治療反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病作用的DNA疫苗。具體而言，本發(fā)明涉及一種包含其中插入了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區(qū)的重組真核質(zhì)粒載體的DNA疫苗。
背景技術(shù)：
捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病是由圓線目毛圓科血矛屬的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)引起的一種寄生蟲病。病原寄生于宿主第四胃，偶見小腸中，以宿主血液為其營養(yǎng)來源。感染牛、羊、鹿、牦牛、駱駝等反芻動物，引起貧血及貧血綜合征，嚴重的可致動物，特別是羔羊大批死亡，死亡率高達30％以上。該病呈世界性分布，國內(nèi)各地均有報道，尤其在一些牧區(qū)此病在羊群中流行嚴重，感染率可達70-80％以上。
捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)是反芻動物的一種重要消化道寄生蟲。目前主要采用化學(xué)藥物治療，雖取得了一定的效果，但藥物殘留和環(huán)境污染嚴重?？顾幮韵x株的出現(xiàn)和蔓延，使得傳統(tǒng)的化學(xué)治療受到了嚴重挑戰(zhàn)，這給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了極大的經(jīng)濟損失，應(yīng)用免疫學(xué)方法防治該病十分迫切和必要。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病呈界性分布，我國許多地方均有發(fā)生，隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，許多地方將反芻動物飼養(yǎng)作為支柱產(chǎn)業(yè)來發(fā)展，因此，研制有效的疫苗預(yù)防該病已經(jīng)成為重要課題。
目前，研究相繼發(fā)現(xiàn)了多種具有較好的免疫保護作用的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲天然抗原，例如，H11、H-gal-GP、H45(P1)、P52/46、15/24Kd ES和Hc-sL3。其中H11是寄生階段捻轉(zhuǎn)血矛線蟲小腸微絨毛上皮細胞中的一種跨膜糖蛋白，分子量為110kDa，該抗原對不同年齡段動物均有保護作用，而且對抗藥性蟲株、不同地理分離株具有交叉保護作用。
但是包括H11在內(nèi)的這些抗原在蟲體內(nèi)的含量極低，分離純化過程復(fù)雜而煩瑣，難以商品化生產(chǎn)。研究又發(fā)現(xiàn)該抗原的重組表達產(chǎn)物無論是原核表達產(chǎn)物還是真核表達產(chǎn)物，其免疫效果均不理想。Munn等使用十二烷基磺酸鈉(SDS)、SDS和二硫蘇糖醇(DTT)處理H11，改變H11的天然構(gòu)象，再分別免疫綿羊，發(fā)現(xiàn)蟲卵減少率均明顯低于天然構(gòu)象的H11。其中原因尚不完全明了。
核酸疫苗是近幾年發(fā)展起來的一種新型疫苗，因其操作簡便，既具有重組亞單位疫苗的安全性，又具有減毒活疫苗誘導(dǎo)全方位免疫應(yīng)答的高效、持續(xù)性的優(yōu)點，成為當(dāng)今疫苗研究的熱點之一。DNA疫苗在體內(nèi)可模擬天然抗原的構(gòu)象，以MHCI和MHCII途徑進行抗原遞呈，不但引起體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，而且可引起機體細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，開發(fā)出具有預(yù)防和治療作用的DNA疫苗具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有預(yù)防或治療反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型的DNA疫苗。
本發(fā)明提供了一種制備具有預(yù)防或治療反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的方法。
另外，本發(fā)明還提供了所述DNA疫苗的用途。
本發(fā)明是部分地建立在本發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)之上含有捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區(qū)的重組真核質(zhì)粒載體能夠為反芻動物提供針對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的有效免疫保護；將3段不同位置的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區(qū)分別插入真核質(zhì)粒載體，然后將3種重組真核質(zhì)粒的混合物免疫接種動物，能夠提供更好的免疫保護。
本發(fā)明使用的是具有免疫原性的H11基因，該基因編碼的蛋白抗原H11是寄生階段捻轉(zhuǎn)血矛線蟲小腸微絨毛上皮細胞中的一種跨膜糖蛋白，分子量為110kDa。研究發(fā)現(xiàn)蛋白抗原H11對不同年齡動物均有一定的保護作用，將母羊血清抗體和初乳抗體轉(zhuǎn)移至新生羔羊(5周齡)體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5周齡羔羊獲得保護力，可以抵抗3000只第3期幼蟲的攻擊。H11對7～9周齡的羔羊同樣具有保護作用。其次，H11對不同地理分離株具有交叉保護性。
在本申請的一個具體實施方案中，設(shè)計出覆蓋保護性抗原基因H11的開放閱讀框的3對引物(P15’ATACCGCGGATGACGTCGCAGGGGAG-3’和P1’5’-CGCTCTAGAAGAGCATATTGTGTCA-3’；P25’ATACCGCGGCCAGAGGCAAAGAAGA-3’和P2’5’-TTCTCTAGACCGTTCACCACAAAGGGA-3’；以及P35’-ATACCGCGGACATGGTTGAGAAGAGA-3’和P3’5’-GGCTCTAGAAAGGTGGCTTTCTTGA-3’)用這三個引物對擴增出保護性抗原基因H11的三段部分編碼區(qū)H11-1、H11-2和H11-3，分別具有如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
因此，一個方面，本發(fā)明提供了3段不同位置的保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區(qū)，即H11-1、H11-2和H11-3，分別具有如SEQ ID NO1、SEQ IDNO2和SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
另一個方面，本發(fā)明提供了一種具有預(yù)防和治療反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型的DNA疫苗，該疫苗包含其中插入了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區(qū)的重組真核質(zhì)粒載體。
在一個具體實施方案中，提供了一種重組DNA疫苗，其中包含其中插入了H11-1(SEQ ID NO1)的重組真核質(zhì)粒載體。
在一個具體實施方案中，提供了一種重組DNA疫苗，其中包含其中插入了H11-2(SEQ ID NO2)的重組真核質(zhì)粒載體。
在一個具體實施方案中，提供了一種重組DNA疫苗，其中包含其中插入了H11-3(SEQ ID NO3)的重組真核質(zhì)粒載體。
在一個優(yōu)選實施方案中，提供了一種一種具有預(yù)防和治療反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病作用的DNA疫苗，其中包括上述3種重組真核質(zhì)粒載體的混合物，即含H11-1的重組真核質(zhì)粒載體、含H11-2的重組真核質(zhì)粒載體和含H11-3的重組真核質(zhì)粒載體，簡稱為pcDNA-H11-1+2+3。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，3種重組真核質(zhì)粒載體的混合比例為111。
本發(fā)明所述DNA疫苗使用真核質(zhì)粒表達載體作為結(jié)構(gòu)框架，所述真核質(zhì)粒載體除具有表達載體基本元件，在限制性酶切位點處插入了目的基因。本領(lǐng)域已知的任一種真核質(zhì)粒載體都可用于本發(fā)明，例如，包括但不限于pcDNA3.0、pcDNA3.1、pVAX1.0和pcDNA4/His Max。在本發(fā)明的一個具體優(yōu)選的實施方案中，所述的真核質(zhì)粒載體為pcDNA4/His Max(購自美國Invitrogen公司)。
在本發(fā)明的第二個方面，提供了一種生產(chǎn)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Eimeria tenella)免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的方法，簡而言之，包括下列步驟1)PCR擴增捻轉(zhuǎn)血矛線蟲保護性抗原基因H11的部分編碼區(qū)設(shè)計覆蓋H11基因完整開放閱讀框的三個引物對，通過PCR擴增手段，克隆得到H11基因的3段部分編碼區(qū)，即，H11-1、H11-2和H11-3；DNA疫苗重組真核質(zhì)粒及相應(yīng)基因工程菌的構(gòu)建2)利用分子生物學(xué)常規(guī)的重組方法，制備出含含H11-1、H11-2或H11-3的重組真核質(zhì)粒，然后用其轉(zhuǎn)化宿主菌(例如，大腸桿菌JM109株)，篩選后獲得重組基因工程菌；3)基因工程菌的發(fā)酵及DNA疫苗重組真核質(zhì)粒的大規(guī)模分離純化，獲得3種含H11-1、H11-2或H11-3的3種重組真核質(zhì)粒，即為含H11-1、H11-2或H11-3的DNA疫苗；以及任選地還包括4)將步驟3)獲得的含H11-1、H11-2或H11-3的3種重組真核質(zhì)粒按一定比例混合得到一種疫苗，即pCDA-H11-1+2+3，例如混合比例為1∶1∶1。
在本發(fā)明的第三個方面是本發(fā)明所述的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Eimeria tenella)免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的用途。用純化后的包含插入了H11-1、H11-2或H11-3的重組真核質(zhì)粒的DNA疫苗，或者用包含所述3種重組真核質(zhì)粒混合物的DNA疫苗直接免疫動物后，通過每克糞便指數(shù)、卵囊減少率、盲腸病變記分和抗線蟲指數(shù)等多項試驗指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，3種包含單一所述重組真核質(zhì)粒的DNA疫苗以及包含所述三種重組真核質(zhì)?；旌衔锏腄NA疫苗都具有很好的免疫保護效果(其中后者保護效果更為顯著)。因此，本發(fā)明所述的DNA疫苗可用于制備預(yù)防或治療反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的藥物制劑。
本發(fā)明所述的DNA疫苗可以與藥物學(xué)上常用的載體和/或佐劑配制用于預(yù)防和治療反芻動物線蟲病的藥物組合物。


圖1為DNA疫苗pcDNA-H11-1(或pcDNA-H11-2或pcDNA-H11-3)的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為H11基因設(shè)計引物的策略圖。
圖3為重組質(zhì)粒pMD18T-H11-1(或pMD18T-H11-2或pMD18T-H11-3)構(gòu)建流程圖。
圖4為重組質(zhì)粒pET-H11-1(或pET-H11-2或pET-H11-3)的構(gòu)建流程圖。
圖5圖示的為重組質(zhì)粒pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3誘導(dǎo)表達后SDS-PAGE電泳結(jié)果。在圖7的A和B中M均為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，第1泳道均為pET28b(+)；A中的第2-9泳道依次分別為pET28-H11-1誘導(dǎo)后第0、1、2、3、4、5、6和7小時的取樣；B中的第2-9泳道依次分別為pET28-H11-2誘導(dǎo)后第0、1、2、3、4、5、6和7小時的取樣。在圖7的C中M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，第1和2泳道分別為pET28-H11-1的上清和包含體，第3和4泳道分別為pET28-H11-2的上清和包含體，第5和6泳道分別為pET28-H11-3的上清和包含體。
圖6為重組質(zhì)粒pPICZaB-H11-1、2或3的構(gòu)建流程圖。
圖7為DNA疫苗pcDNA-H11-1、2或3的構(gòu)建流程圖。
圖8為RT-PCR檢測DNA疫苗pcDNA-H11-1、2或3在肌肉中的轉(zhuǎn)錄。
M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1、3、5分別為PBS免疫組注射部位肌肉；2、4、6分別為pcDNA-H11-3、2、1免疫組注射部位肌肉。
圖9為Western-印跡檢測pcDNA-H11-1、2、3DNA疫苗在肌肉中的表達圖。
A1、A2分別以PBS、pcDNA-H11-1+2+3免疫山羊的肌肉為抗原，大鼠抗H11抗體為一抗。
B1、B2分別以pET28-H11-1和pET28-H11-2重組蛋白為抗原，pcDNA-H11-1+2+3免疫山羊的血清為一抗。
C1、C2分別以pET28-H11-1和pET28-H11-2重組蛋白為抗原，PBS免疫山羊的血清為一抗。
圖10為DNA疫苗免疫后山羊體內(nèi)抗H11抗體水平曲線圖。
圖11攻蟲后山羊排出捻轉(zhuǎn)血矛線蟲卵曲線圖。
圖12為DNA疫苗免疫組和PBS對照組山羊被毛、眼結(jié)膜等部位健康狀況比較圖。
實施例基礎(chǔ)材料真核表達載體pcDNA4/His Max，pPICZαB(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)；pMD18-T(大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司)；pET-28a，b，c(+)(美國Novagen公司產(chǎn)品)。
實施例1.H11基因的制備1.引物的設(shè)計和合成根據(jù)GenBank中公開的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H11基因的核苷酸序列，應(yīng)用Primer Premier5軟件設(shè)計3對引物，如下所示P1 5’-ATACCGCGGATGACGTCGCAGGGG AG-3，P1’5’-CGCTCTAGAAGAGCATATTGTGTCA-3’；P2 5’-ATACCGCGGCCAGAGGCAAAGAAG A-3’，P2’5’-TTCTCTAGACCGTTCACCACAAAGGG A-3’；P3 5’-ATACCGCGGACATGGTTGAGAAGAGA-3’，P3’5’-GGCTCTAGAAAGGTGGCTTTCTTGA-3’。
設(shè)計策略如圖2所示，3對引物覆蓋H11的開放閱讀框。這三對引物中均為在上游引物5’端引入酶切位點SacII，下游引物的5’端引入酶切位點XbaI(如下劃線部分所示)，用于構(gòu)建表達載體。
2.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲體總RNA的提取挑取40條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲放入經(jīng)DEPC處理過的勻漿器中，加Trizol試劑1ml，勻漿3分鐘。將勻漿液轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，室溫放置5分鐘，加200μl氯仿，渦懸振蕩15秒。4℃，12000r/min離心15分鐘，吸取上層水相轉(zhuǎn)至新的Eppendorf管中，加入500μl異丙醇后于25℃沉淀30分鐘。12000r/min離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗滌2次，晾干RNA沉淀，用50μl無RNA酶的水溶解沉淀。紫外分光光度計測定RNA的含量及純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.RT-PCR擴增以上述提取的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲總RNA為模板，用oligo(dT)15引物進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，采用20μl反應(yīng)體系總RNA約1.0μg，oligo(dT)150.50μg，70℃變性10分鐘后立即置冰水中冷卻2分鐘，然后加入5×RT反應(yīng)緩沖液4.0μl，MgCl2(25mmol/L)2.0μl，dNTP(10mmol/L)1.5μl，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl)1.0μl，RNasin(40U/μl)0.5μl，無RNase水補至20μl。將上述所有成分輕彈混勻，短暫離心后，42℃反應(yīng)60分鐘，然后95℃5分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物立即進行PCR或-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用50μl體系進行PCR擴增，各反應(yīng)成分如下cDNA模板2.0μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液5.0μl，MgCl2(25mmol/L)3.0μl，成對的上、下游引物(50pmol/μl)各2.0μl(即相應(yīng)地分別加入P1和P1’、P2和P2’或者P3和P3’各2.0μl)，dNTP(2.5mmol/L)4.0μl，Taq酶(5U/μl)0.5μl，補加滅菌ddH2O至50μl。將上述成分離心混合均勻后，于PCR儀上進行擴增，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，共30個循環(huán)；然后72℃延伸15分鐘。
使用引物對P1和P1’、P2和P2’或者P3和P3’擴增得到的基因分別命名為H11-1、H11-2和H11-3。經(jīng)測序表明，擴增得到的H11-1、H11-2和H11-3基因分別具有如SEQ ID NO1中第484-1409位、SEQ ID NO2中第484-1457位和SEQ ID NO3中第484-1607位所示的核苷酸序列。
實施例2.DNA疫苗的制備1.重組質(zhì)粒pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2和pMD18-T-H11-3的構(gòu)建(見圖3)取實施例1中獲得的PCR產(chǎn)物50μl，1％瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下切下目的條帶處瓊脂糖凝膠，用大連寶生物公司的膠回收試劑盒回收純化目的片段，方法參照說明書。取純化的PCR產(chǎn)物與經(jīng)SacII和XbaI酶切線性化的pMD18-T載體連接，反應(yīng)體系如下PCR回收產(chǎn)物4.0μlpMD18-T載體1.0μlLigation solution I5.0μl總體積 10.0μl將上述成分在薄壁eppendorf管中混合均勻后4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，用SacII和XbaI雙酶切及測序等鑒定，確定為pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2和pMD18-T-H11-3。
2.重組質(zhì)粒pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3的構(gòu)建(見圖4)分別用BamHI和HindIII雙酶切克隆質(zhì)粒pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2、pMD18-T-H11-3和原核表達載體pET28b(+)，分別回收純化H11-1、H11-2、H11-3和pET28b(+)酶切片段，T4連接酶連接，反應(yīng)體系如下H11-1H H11-2H H11-3雙酶切回收的目的片段 7μl l8μl 10μlpET28b(+)載體回收片段 10μl9μl7μl10×連接緩沖液 2μl 2μl2μlT4DNA連接酶 1μl 1μl1μl20μl20μl 20μl先將目的片段與載體片段加入后，混合均勻，45℃作用5分鐘，然后在冰上加入其他成分，短暫離心混勻，置16℃連接12h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，用BamHI和HindIII雙酶切鑒定，確定為pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3重組載體。
3.重組質(zhì)粒pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3的誘導(dǎo)表達將轉(zhuǎn)化有pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3質(zhì)粒的陽性克隆28℃振蕩培養(yǎng)過夜，菌液再以1∶50稀釋至含Kna+的LB培養(yǎng)液中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝0.4-0.6，然后將終濃度1mMol/L IPTG進行誘導(dǎo)表達，分別收集0hr、1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr的菌液，菌體蛋白進行SDS-PAGE鑒定(見圖5)。
4.重組質(zhì)粒pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2和pPICZαB-H11-3的構(gòu)建(見圖6)將pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2或pMD18-T-H11-3與表達載體pPICZαB分別用SacII和XbaI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別回收目的片段和載體片段，以合適的比例進行粘端連接(構(gòu)建策略如圖4-1)，反應(yīng)體系如下H11-1H H11-2H H11-3雙酶切回收的目的片段7μl 8μl10μl回收的pPICZαB載體片段 10μl9μl7μl10×連接緩沖液 2μl 2μl2μlT4DNA連接酶1μl 1μl1μl20μl20μl 20μl16℃連接12小時。將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化新鮮制備的E.coli JM109感受態(tài)細胞，取經(jīng)過冰浴、熱休克及抗性復(fù)蘇的菌液涂布于含ZeocinTM(25μg/ml)的低鹽LB固體培養(yǎng)基平板上，于37℃溫箱中倒置培養(yǎng)18～24h，提取質(zhì)粒，用SacII和XbaI雙酶切等鑒定，確定為pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2和pPICZαB-H11-3。
5.重組質(zhì)粒pcDNA-H11-1、pcDNA-H11-2和pcDNA-H11-3的構(gòu)建(見圖7)將pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2或pPICZαB-H11-3質(zhì)粒與pcDNA4/HisMax質(zhì)粒分別用XhoI和XbaI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別回收目的片段和載體片段，以合適的比例進行粘端連接，反應(yīng)體系如下H11-1H H11-2H H11-3雙酶切回收的目的片段 7μl 8μl 10μlpcDNA4/HisMax C片段 10μl 9μl 7μl10×連接緩沖液 2μl 2μl 2μlT4DNA連接酶 1μl 1μl 1μl20μl 20μl 20μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，用Xho I和XbaI雙酶切確定獲得即為pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2和pcDNA4/HisMax-H11-3DNA疫苗。
6.含三種重組真核質(zhì)?；旌衔锏腄NA疫苗的制備將上述操作得到的pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2和pcDNA4/HisMax-H11-3按1∶1∶1的比例混合，得到含這三種重組真核質(zhì)?；旌衔锏腄NA疫苗。
實施例3.DNA疫苗的動物保護性試驗1.試驗動物接種選擇體重相當(dāng)、無捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染、5’-7月齡健康山羊15只，隨機分成3組，每組5只。第1組肌肉注射PBS。第2組肌肉注射3種重組真核質(zhì)粒載體的混合物(pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3)。首次免疫后2周加強免疫一次。每次每只山羊注射1ml pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3(其中H11-1、2和3各100μg/ml)。在第2次免疫后14天，每只山羊感染10,000只捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第三期幼蟲。第3組山羊不免疫，也不攻擊三期幼蟲。
2.RT-PCR檢測核酸疫苗的表達情況第1次免疫后7天，局部麻醉山羊，取疫苗注射肌肉細胞提取RNA，最后用20μl經(jīng)DEPC處理過的水溶解RNA沉淀。為防止質(zhì)粒DNA污染，反轉(zhuǎn)錄前用無RNase的DNase處理肌肉RNA，進行RT-PCR。具體方法同實施例1所述。結(jié)果表明DNA疫苗在山羊肌肉細胞內(nèi)獲得了轉(zhuǎn)錄(見圖8)。
3.Western印跡檢測核酸疫苗的表達情況于第2次免疫后7天，采取血清和疫苗注射部肌肉(局部麻醉)，制樣、SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。PBS洗膜2次，0.2％麗春紅染色，鉛筆標(biāo)記蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量所在位置；PBS洗膜數(shù)次，至麗春紅全部褪去，3％BSA(PBS)4℃過夜或37℃1小時；PBS洗膜數(shù)次，加大鼠抗H11抗體(3％BSA稀釋)，37℃作用1小時；生理鹽水洗膜數(shù)次，加羊抗大鼠IgG-HRP(3％BSA稀釋)，37℃作用1小時；生理鹽水洗膜，加底物顯色，生理鹽水漂洗，PBS終止反應(yīng)，干燥NC膜，照相。
pET28-H11-1、pET28-H11-2或pET28-H11-3(實施例3第3步中構(gòu)建)原核表達重組蛋白制樣、SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜后，以核酸疫苗第二次免疫2周后血清為一抗、兔抗山羊IgG-HRP為標(biāo)記二抗進行Western印跡檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA疫苗在肌肉細胞內(nèi)獲得了很好的表達，并刺激山羊產(chǎn)生抗H11抗體(見圖9)。
4.ELISA檢測抗體水平于免疫前、首次免疫后14天、第二次免疫后10、16、24、29、38、47天采取血清。用矩陣法確定包被抗原和抗體(血清)稀釋度。
用包被液稀釋H11抗原至合適濃度，加入酶標(biāo)板，每孔50μl，37℃1小時后4℃過夜。棄包被液，PBS-Tween20洗滌3-5次，加100μl封閉液，4℃過夜或37℃1小時。棄封閉液，PBS-Tween20洗滌3-5次，加待檢血清(1∶1000稀釋)50μl，37℃保溫1小時。棄血清，PBS-Tween20洗滌3-5次，加酶標(biāo)二抗50μl，37℃保溫1小時。棄二抗，PBS-Tween20洗滌3-5次，加顯色液100μl，避光反應(yīng)5’-15分鐘，每孔加100μl2M硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測量OD490。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)第二次免疫后10天抗體滴度達到較高水平，然而在二次免疫后16-29天時發(fā)現(xiàn)抗體滴度急劇下降到較低水平，之后又開始回升，并維持在一個較高水平(見圖10)。t檢驗表明pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫組抗體水平極顯著高于PBS對照組(P＜0.01)。
5.蟲卵計數(shù)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第三期幼蟲感染后，分別于感染后第21、23、25、27、29、31和33天山羊直腸采集糞便，用于蟲卵計數(shù)。
采用麥克馬斯特氏法。稱2克糞便于乳缽中，加水10ml，攪勻，再加飽和鹽水50ml?；靹蚝螅〖S液，注入記數(shù)室，置顯微鏡臺上，靜置1-2分鐘。在鏡下計數(shù)，刻度中的蟲卵總數(shù)乘以200即為每克糞便中的蟲卵數(shù)。蟲卵減少率＝(1-實驗組平均每克糞便數(shù)/對照組平均每克糞便數(shù))×100％。
蟲卵計數(shù)結(jié)果如表1。攻蟲后21天，糞便中開始能檢測到少量的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵，隨著時間推移，對照組和核酸疫苗免疫組每克糞便蟲卵數(shù)(EPG)逐漸增加，而不免疫不感染組均未檢測到捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵。
表1 每克糞便蟲卵數(shù)(×200)

圖11是蟲卵排出規(guī)律曲線。pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫組山羊蟲卵排出數(shù)量明顯(t檢驗差異極顯著P＜0.01)少于PBS對照組，蟲卵減少率達58.75％。單獨用pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2或pcDNA4/HisMax-H11-3免疫組的山羊蟲卵減少率雖然低于pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫組，但是蟲卵排出數(shù)量也明顯(t檢驗差異極顯著P＜0.01)少于PBS對照組。
6.蟲卵孵化率于感染后第27、29、31天，直腸采集糞便，蟲卵計數(shù)后，稱重，捻磨后26℃培養(yǎng)4-6天，采用貝爾曼氏法[5]分離三期幼蟲，計數(shù)，計算蟲卵孵化率。蟲卵孵化率＝三期幼蟲數(shù)/蟲卵數(shù)×100％pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫組蟲卵平均孵化率為3.90％，PBS組平均孵化率為14.22％。核酸疫苗免疫后蟲卵孵化率降低72.57％，t檢驗差異極顯著(P＜0.01)。單獨用pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2或pcDNA4/HisMax-H11-3免疫組的山羊蟲卵排出數(shù)量雖然高于pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫組，但是也明顯(t檢驗差異極顯著P＜0.01)少于PBS對照組。
7.成蟲計數(shù)感染三期幼蟲后第35天，頸靜脈放血致死山羊，收集第四胃，分離捻轉(zhuǎn)血矛線蟲，分別計數(shù)雌雄蟲數(shù)目。成蟲減少率＝(1-實驗組平均成蟲數(shù)/對照組平均成蟲數(shù))×100％。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBS對照組平均每只山羊的雌蟲、雄蟲、成蟲荷蟲數(shù)分別為266、170.5、436.5，而核酸疫苗免疫組分別為82.8、55.8、138.6(表2)。t檢驗分析表明免疫組和對照組間差異極顯著(P＜0.01)
表2 山羊第四胃內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲計數(shù)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H11基因疫苗免疫山羊后，攻擊第三期幼蟲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，免疫組山羊排出蟲卵減少58.75％、蟲卵孵化率降低72.57％、成蟲減少68.25％。PBS對照組攻蟲后被毛粗亂、消瘦、精神萎靡不振(12圖B)，眼結(jié)膜蒼白，表現(xiàn)為貧血癥狀(12圖C右)；而免疫組相對健康，如圖12A和圖12C左。
序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>用于預(yù)防反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的DNA疫苗<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>926<212>DNA<213>捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)<220>
<221>免疫保護性隱蔽抗原基因H11的部分編碼區(qū)1(H11-1)<222>(1)..(926)<223>
<400>1atgacgtcgc aggggagaac gcggacattg ctgaatctaa ctccaatccg tcttattgtc 60gcattatttc tagtagctgc tgcagtcggc ctctctattg gtctcaccta ttactttact 120cgcaaagcgt tcgatacctc agaaaagcca gggaaggatg atactggtgg caaggacaaa 180gacaattctc cctctgcggc ggaactactc cttccaagta atataaaacc attgtcttac 240gacttgacga tcaaaacata tctacctggt tatgtggact tcccaccgga gcaaaacctc 300acattcgatg ggcgtgtgga aatatcaatg gttgtaattg agccaacaaa gagtatcgta 360ctcaattcaa agaagatctc tgtaataccc caagaatgtg aactggtatc gggcgataaa 420aaactcgaaa ttgaaagtgt aaaggagcac ccaagactgg aaaaggttga gtttcttatc 480aaaagccaac tggaaaaaga tcaacaaatc ttgctcaagg tcggctacat cggtctcatc 540agcaacagcc ttggtggaat ctaccagacc acttatacca ccccggatgg cacccctaag 600atcgctgcag tttcacaaaa tgagcccata gatgctcgtc gaatggtacc atgcatggat 660
gaaccgaaat acaaagcaaa ctggaccgtt actgtcattc atccaaaagg cgccaaagcc 720gtctcgaatg gaatcgaagt gaacggagat ggagagatca gtggtgattg gatcacatcg 780aagttcttga ctactccacg gatgtcatcc tacttgttgg cagttatggt ttcagaattt 840gaatacatcg aaggtgaaac aaagacgggt gttcggttcc gtatatggtc acgcccagag 900gcaaagaaga tgacacaata tgctct 926<210>2<211>974<212>DNA<213>捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)<220>
<221>免疫保護性隱蔽抗原基因H11的部分編碼區(qū)2(H11-2)<222>(1)..(974)<223>
<400>2ccgcggccag aggcaaagaa gatgacacaa tatgctctga aatccggcat caaatgcata 60gagttctacg aagatttctt tgatatcaaa tcccctctga agaaacaaga tgtgatcgcc 120cttcctgatt tctcagcagg agccatggag aactggggcc tcatcactta cagagaaaac 180tctttgttgt acgatgacag attctatgca ccgatgaata aacagcgaat tgctcgcatt 240gttgctcatg agcttgctca tcagtggttt ggcgacttgg ttacgatgaa gtggtgggac 300aacttgtggt tgaatgaagg tttcgcaaga ttcacagaat tcattggagc tggtcagata 360actcaagatg acgccagaat gcggaactac ttcctgattg atgtacttga acgcgctttg 420aaagctgatt cggtagcgtc gagccatcca ctttccttca gaattgacaa agctgcagaa 480gttgaagaag cctttgatga tatcacatac gccaaaggag cttctgttct tactatgctg 540agagccttga ttggagaaga aaaacataag cacgcagtat cgcagtacct caagaagttc 600tcgtatagca atgcagaagc gacagatcta tgggcagttt tcgatgaagt tgtcactgac 660
gtcgagggtc cagacggcaa atctatgaga accacggaat tcgcaagtca gtggacgact 720cagatgggct tcccagttat ttccgtagca gagtttaact cgactacttt gaaattaacg 780caaagtcgat ataaggcgaa taaagatgct gtggagaaag agaagtaccg tcatccgaaa 840tacggattta aatgggatat tccactgtgg tatcaggaag gcgataagaa ggagataaag 900cgaacatggt tgagaagaga tgaaccgctt tacttgcatg taaatgatcc tggcgctccc 960tttgtggtga acgg 974<210>3<211>1124<212>DNA<213>捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)<220>
<221>免疫保護性隱蔽抗原基因H11的部分編碼區(qū)3(H11-3)<222>(1)..(1124)
<223>
<400>3acatggttga gaagagatga accgctttac ttgcatgtta gtgatgctgg cgctcccttt 60gtggtgaacg cagaccgcta tggattttat cgacaaagtc atgacgctaa tggttggaaa 120aagataatca agcagctcaa ggataatcat gaggcttaca gtccccggac aagaaatgcc 180atcattagcg atgcgtttgc tgcggctgca actgacgcaa ttgagtatga gactgtattt 240gaacttctga attatgccga aaaagaaacg gaatatctac cattagaaat cgcaatgtcg 300gggatctctt cgattttgaa atacttcggt accgagccag aggcaaagcc agctcaagtg 360tacatgatga acatattgaa accgatgtat gagaaaagca gtatcgaatt cattgccaat 420aactacagaa atgacaagct gtttttccaa atcaacctcc aaaaagatgt cattgatatg 480ttctgcgccc tcggatcgca agactgcagg aagaaatata aaaaactttt cgatgacgaa 540gtcatgaaca aatgcaggga tggtcaagca gcaaccgaat gcgtaagaat cgccgctcct 600
ctccgatcaa gtgtttattg ttatggtgtg aaggaaggcg gtgattatgc tttcgacaag 660gtgatggagc tttatacggc cgaaacactc gccctagaaa aagacttcct acgcctagca 720ttgggatgtc ataaagatgt tactgctttg aaaggacttc tcttgcgggc tctggacagg 780aattcgtcgt tcgtacgtat gcaggatatc ccaagtgctt tcaatgatgt agcagcaaat 840cctatcggcg gagaattcat tttcaatttc cttattgaaa gatggccaga tatcattgaa 900agtataggaa cgaagtacac atacgttgag aaagtgatac cagcctgcac ttcaggaatc 960cgctcacaac agcagattga ccagctgaag aatctgcaga aaaatggcat gaacgctcgt 1020caattcggtg cattcgataa agcaatcgaa cgagcacaaa atagggtgga ttggattaaa 1080aaacatttcc aaaaattagc ggctttcttc aagaaagcca cctt 112權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和治療反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的DNA疫苗，其中包含插入了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區(qū)的真核質(zhì)粒載體。
2.權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其中所述的H11部分編碼區(qū)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其中所述的H11部分編碼區(qū)具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其中所述的H11部分編碼區(qū)具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
5.一種用于預(yù)防和治療反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的DNA疫苗，其中包括3種重組真核質(zhì)粒載體，其中所述3種重組真核質(zhì)粒載體其中分別插入了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲保護性隱蔽抗原基因H11的3個不同位置部分編碼區(qū)分別具有如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ IDNO3所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求5所述的DNA疫苗，其中所述3種重組真核質(zhì)粒載體的混合比例為1∶1∶1。
7.權(quán)利要求1-6所述的DNA疫苗，其中所述的真核質(zhì)粒載體為pcDNA4/His Max。
8.權(quán)利要求1-7中任一項所述的DNA疫苗在制備用于預(yù)防和治療反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的藥物中的用途。
9.權(quán)利要求8所述的用途，其中所述的反芻動物為山羊。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有預(yù)防和治療反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病作用的DNA疫苗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)保護性隱蔽抗原基因H11部分編碼區(qū)的重組真核質(zhì)粒載體的DNA疫苗。具體而言，本發(fā)明還提供了3種重組真核質(zhì)粒，這3種重組真核質(zhì)粒中分別插入了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.contortus)保護性隱蔽抗原基因H11的3段不同位置部分編碼區(qū)，即H11－1、H11－2或H11－3。本發(fā)明提供了包含所述3種重組真核質(zhì)粒其中之一的DNA疫苗。另外，本發(fā)明還提供了包含這3種重組真核質(zhì)粒載體混合物的DNA疫苗。本發(fā)明所述疫苗包含有多個T細胞免疫應(yīng)答元件，能夠有效地預(yù)防和治療反芻動物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病。
文檔編號A61P33/00GK1840202SQ20051012404
公開日2006年10月4日 申請日期2005年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月23日
發(fā)明者李祥瑞, 嚴若峰, 趙光偉, 徐立新 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)