專利名稱：治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的聯(lián)合菌苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有細菌的醫(yī)藥配置品，具體是一種治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的聯(lián)合菌苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
變態(tài)反應(yīng)性疾病多見于皮膚科、呼吸內(nèi)科、和耳鼻喉科。臨床表現(xiàn)為異位性皮炎、濕疹、過敏性鼻炎和哮喘等多種疾病，約占各科門診量的20-50％之多。現(xiàn)代免疫醫(yī)學(xué)認為變態(tài)反應(yīng)性疾病發(fā)病的主要機制是遺傳因素為背景的、外來抗原誘發(fā)的、Th2細胞介導(dǎo)的I-VI性變態(tài)反應(yīng)。臨床上治療方法很多，基本上以抗組織胺藥物治療為主，至于針對外來抗原的脫敏治療，由于過敏原尋找困難和特異性抗原制備的限制，使臨床使用乏見。
國外文獻報道鼻疽菌素的免疫可以誘導(dǎo)混合性的Th1/Th2型的細胞因子的釋放，提示細菌毒素的免疫可以起到調(diào)節(jié)Th1/Th2型細胞免疫平衡的目的?；蛘哒f，無關(guān)的抗原可以誘導(dǎo)目的抗原之外的免疫應(yīng)答類型。從這個意義上講，多價的或聯(lián)合的菌苗免疫可以使機體的免疫應(yīng)答趨向平衡。國外Ruah等曾用7種呼吸道常見致病菌的混合成份LW50020防止上呼吸道感染。Ander指出聯(lián)合的多價菌苗能有效調(diào)動機體自身的免疫調(diào)節(jié)機制，因有可能降低變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生。
目前對菌苗的研究僅限于感染性疾病的防治，如中國醫(yī)藥科技出版社1977年出版“現(xiàn)代藥物學(xué)”、836、839頁介紹的傷寒菌苗，吸附霍亂菌苗等單一菌苗，而傷寒、副傷寒甲乙菌苗則為混合菌苗等；目前使用中的“白、百、破”是一種吸附百日咳菌苗和百喉、破傷風(fēng)類毒素的混合制劑。但很少有對變態(tài)反應(yīng)性疾病使用菌苗進行防治的報道。
中國專利1297741公開了一種“葡萄球菌菌苗注射液及制備方法”，是由金黃色葡萄球菌混合液、表皮葡萄球菌混合液以1∶1比例組成，對治療痤瘡、毛囊炎效果顯著。
由美國蛋白表達公司在中國的專利申請1278735公開了“用于泌尿生殖系統(tǒng)感染的陰道栓劑菌苗”，器菌苗來源于培養(yǎng)的8-14種尿路病原菌菌株，如大腸桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、奇異變形桿菌、摩根氏變形桿菌，和糞鏈球菌等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了解決變態(tài)反應(yīng)性疾病的防治方法中，利用菌苗有效調(diào)動機體自身的免疫調(diào)節(jié)機制，降低變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生，因而提供一種治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的聯(lián)合菌苗及其制備方法。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
一種治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的聯(lián)合菌苗，其特征在于該菌苗是由肺炎雙球菌、甲型溶血型鏈球菌、乙型溶血型鏈球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、卡他萘瑟氏菌、流感嗜血桿菌，銅綠甲單胞菌、變形桿菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷白桿菌、白色念珠菌的滅活菌液按1∶1的比例制備而成。
所述的聯(lián)合菌液，總菌數(shù)量濃度為1億個/ml一種治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的聯(lián)合菌苗的制備方法以下標準菌株各一支分別用0.5ml滅菌生理鹽水溶解后，金黃色葡萄球菌、表葡萄球菌、銅綠甲單胞菌、變形桿菌、卡他萘瑟氏菌、肺炎克雷白桿菌接種于普通培養(yǎng)基中，甲型溶血型鏈球菌、乙型溶血型鏈球菌、接種于新鮮血培養(yǎng)基中，大腸埃希氏菌接種于SS培養(yǎng)基中，白色念珠菌接種于沙伯弱氏培養(yǎng)基中，流感桿菌接種于巧克力培養(yǎng)基中；肺炎雙球菌接種于新鮮血肉湯培養(yǎng)基中，常規(guī)分區(qū)劃線培養(yǎng)；依形態(tài)染色及生化反應(yīng)，標化確定菌種，獲得純培養(yǎng)；將各種分化的菌株接種傳代，每種接種10-20個相應(yīng)培養(yǎng)集中，大量增菌；刮取菌株，用酚鹽水稀釋溶解成菌液，收集各種菌液共12瓶，55-60℃，30-60分鐘滅活，分別用磷酸鹽緩沖生理鹽水洗后，離心沉降；去脂，超聲粉碎，質(zhì)量檢測；滅活后的菌液各取0.1ml再次接種于相應(yīng)的培基中，觀察滅活效果；將各種分化的菌株接種傳代，大量增菌，若無細菌生長，則用無菌的酚鹽水稀釋菌液，以麥氏比濁法定量，用時將十二種菌苗按1∶1的比例均勻混和，配成總菌數(shù)量1億個/ml的濃度。
所述的酚鹽水為0.5％重蒸酚和0.9％生理鹽水組成。
所述的去脂方法是菌苗分別用磷酸鹽緩沖生理鹽水洗3-5遍之后加入100％甲醇，攪拌1-2小時，離心沉降去脂。
這樣制備的治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的聯(lián)合菌苗，為變態(tài)反應(yīng)性疾病患者提供了一種新的治療方法。在臨床和病例確診的變態(tài)反應(yīng)性疾病患者358人，經(jīng)取得滿意的療效；而且，治療期間沒有發(fā)現(xiàn)任何毒副反應(yīng)，收到患者的歡迎。
具體實施例方式
自國家菌種保藏中心購買肺炎雙球菌，甲型溶血型鏈球菌，乙型溶血型鏈球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，卡他萘瑟氏菌，流感嗜血桿菌，銅綠甲單胞菌，變形桿菌，大腸埃希氏菌，肺炎克雷白桿菌，白色念珠菌的標準菌株各2支。
取其中各1支用0.5ml滅菌生理鹽水溶解，分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中，常規(guī)分區(qū)劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24-48小時。其中金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，銅綠甲單胞菌，變形桿菌，卡他萘瑟氏菌，肺炎克雷白桿菌接種于普通培基中；甲型溶血型鏈球菌，乙型溶血型鏈球菌，接種于新鮮血培基中；大腸埃希氏菌接種于SS培養(yǎng)基中；白色念珠菌接種于沙伯弱氏培養(yǎng)基中；流感桿菌接種于巧克力培養(yǎng)基中；肺炎雙球菌接種于新鮮血肉湯培基中。
鑒定菌株，依形態(tài)染色及生化反應(yīng)，標化確定菌種，以獲得純培養(yǎng)。
將各種分化的菌株接種傳代每種接種10-20個上述相應(yīng)培養(yǎng)基中。進行大量增菌。培基條件為37℃，24-48小時。
當(dāng)菌落生長最旺盛時刮取菌苔，即在每個培基中注入1ml酚鹽水，稀釋溶解成菌液，再將相同10個培基中的菌液集中在1個無菌瓶內(nèi)，采用100ml容量、具塞、可高壓消毒的無菌瓶，內(nèi)含無菌玻璃珠若干個以防止細菌蛋白凝聚。全部操作在凈化間內(nèi)進行，嚴格遵守消毒隔離規(guī)程。酚鹽水為0.5％重蒸酚和0.9％生理鹽水組成。
收集各種菌液共12瓶，置60℃水浴中60分鐘滅活，其間不斷搖動瓶內(nèi)玻璃珠，以防凝固。
十二種菌苗分別用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)洗3-5遍之后，離心沉降；加入100％甲醇，攪拌2小時，離心沉降去脂，超聲粉碎，質(zhì)量檢測。
將滅活后的菌液各用1ml注射器取0.1m接種于以上步驟所述相應(yīng)的培基中，觀察滅活效果，置37℃，24小時。
若無細菌生長，則稀釋各種菌液，用無菌的酚鹽水稀釋菌液，以麥氏比濁法定量。各種細菌分別稀釋兩種濃度10億/ml、1億/ml各一瓶，作為儲存液置4℃冰箱保藏。用時將十二種菌苗按1∶1的比例均勻混和，配成總菌數(shù)量1億個/ml的濃度。
動物毒性實驗用體重18-20g純種小白鼠C3H、615或C57BL，試驗及對照組各10只，雌雄各半。試驗組每只小白鼠腹腔注射菌液0.5ml(1億/ml)，對照組注射同量生理鹽水，觀察1周，到期稱總體重，不得較試驗前減輕或死亡。
動物實驗合格后，制備應(yīng)用液取1億/ml菌液12種，各取0.1ml混合用酚鹽水稀釋100ml，呈10萬/ml濃度混合菌液。取10萬/ml濃度1ml用用酚鹽水稀釋100ml，呈1000/ml濃度的混合菌液，即應(yīng)用菌液。準備1ml安瓿160℃高溫干燥滅菌。將應(yīng)用液在無菌條件下，分裝于1ml安瓿中，0.5ml/支，即成注射用品。
將分裝好的安瓿全部置37℃培養(yǎng)箱中24小時，取出逐支檢驗外觀清晰度、雜質(zhì)、裝量。
合格后印制標簽品名、批號、容量。
適應(yīng)癥主要應(yīng)用于過敏性疾病的治療，過敏性鼻炎，過敏性結(jié)膜炎，各種支氣管炎及哮喘，以及藥物引起的耳聾等癥。
劑量及用法首次使用，每周兩次，每次0.2ml，皮下注射(三角肌)，兩周后劑量增加為每次0.5ml，每周兩次，三個月為一療程，也可以延長使用。
副作用注射部位常有腫痛、硬結(jié)，持續(xù)約兩周，有時出現(xiàn)不定期性發(fā)熱。腔注射或有一過性反應(yīng)加重及發(fā)熱，可對癥處理。
注意事項1.發(fā)熱38℃以上，重癥心血管病人，肝、腎功能異常者禁用。
2.治療前后，宜作血、尿常規(guī)及免疫指標等檢查，出現(xiàn)常規(guī)及免疫指標持續(xù)下降者停用，注射后當(dāng)日勿過度疲勞。
3.用前須充分搖勻，有搖不散凝塊時勿用。
保存保存于2-8℃陰暗處。
本院變態(tài)反應(yīng)科應(yīng)用本發(fā)明治療變態(tài)反應(yīng)性疾病情況如下。
病種選擇濕疹、異位性皮炎、哮喘、和過敏性鼻炎。
臨床資料臨床和病例確診的變態(tài)反應(yīng)性疾病患者358人，其中濕疹患者128例，異位性皮炎患者68例，哮喘患者60例，過敏性鼻炎患者102例；各病種隨即分為兩組，即常規(guī)治療組和常規(guī)治療+菌苗注射組。
藥物來源本院變態(tài)反應(yīng)科按上述方法制備的本發(fā)明菌苗。
療程臨床觀察和判斷時間分別為4周、8周和12周。
濕疹、異位性皮炎的療效判斷標準瘙癢0-7分；苔蘚樣變0-3分；皮膚損害范圍0-4分；皮損范圍按燒傷面積估計方法，1分≥1％；2分≥2％；3分≥3％；4分≥4％。
評分后依據(jù)治療前后的分數(shù)下降70％以上為顯效；下降30-70％為有效；下降30％以下為無效。
變應(yīng)性鼻炎、和哮喘的療效判斷標準臨床痊愈無需任何藥物，無癥狀、無體征1年以上；顯效偶有發(fā)病但癥狀、體征很快緩解；有效經(jīng)治療癥狀和體癥有好轉(zhuǎn)，但長須藥物治療；無效治療前后癥狀無明顯改善。
治療結(jié)果聯(lián)合菌苗的臨床治愈率要明顯高于常規(guī)組，見表1-4；目前這種治療的長期效果正在觀察中。
毒副反應(yīng)治療期間沒有發(fā)現(xiàn)任何毒副反應(yīng)，包括發(fā)熱、局部結(jié)節(jié)形成和血、尿常規(guī)的改變。
表1 濕疹組治療8周后治療組與對照組療效比較組別 例數(shù) 治愈 顯效或有效 無效臨床治愈率常規(guī)+菌苗64 58 4 2 90.6％常規(guī)組 64 46 12 6 71.8％臨床治愈率比較，常規(guī)+菌苗vs常規(guī)組，P＜0.05
表2 異位性皮炎治療8周后治療組與對照組療效比較組別 例數(shù) 治愈 顯效或有效 無效臨床治愈率常規(guī)+菌苗342012 2 58.8％常規(guī)組 341216 6 35.3％臨床治愈率比較，常規(guī)+菌苗vs常規(guī)組，P＜0.05表3 過敏性鼻炎組治療8周后治療組與對照組療效比較組別 例數(shù) 顯效 有效 無效臨床治愈率常規(guī)+菌苗50 482 0 96.0％常規(guī)組 52 4012 0 76.9％臨床顯效率比較，常規(guī)+菌苗vs常規(guī)組，P＜0.05表4 哮喘組治療8周后治療組與對照組療效比較組別 例數(shù) 顯效 有效 無效臨床治愈率常規(guī)+菌苗36 342 0 94.4％常規(guī)組 24 148 2 58.3％臨床顯效率比較，常規(guī)+菌苗vs常規(guī)組，P＜0.0權(quán)利要求
1.一種治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的聯(lián)合菌苗，其特征在于該菌苗是由肺炎雙球菌，甲型溶血型鏈球菌，乙型溶血型鏈球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，卡他萘瑟氏菌，流感嗜血桿菌，銅綠甲單胞菌，變形桿菌，大腸埃希氏菌，肺炎克雷白桿菌，白色念珠菌的滅活菌液按1∶1的比例制備而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合菌苗，其特征在于總菌數(shù)量濃度為1億個/ml。
3.一種治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的聯(lián)合菌苗的制備方法，其特征在于以下標準菌株各一支分別用0.5ml滅菌生理鹽水溶解后，金黃色葡萄球菌、表葡萄球菌、銅綠甲單胞菌、變形桿菌、卡他萘瑟氏菌、肺炎克雷白桿菌接種于普通培養(yǎng)基中，甲型溶血型鏈球菌、乙型溶血型鏈球菌、接種于新鮮血培養(yǎng)基中，大腸埃希氏菌接種于SS培養(yǎng)基中，白色念珠菌接種于沙伯弱氏培養(yǎng)基中，流感桿菌接種于巧克力培養(yǎng)基中；肺炎雙球菌接種于新鮮血肉湯培養(yǎng)基中，常規(guī)分區(qū)劃線培養(yǎng)；依形態(tài)染色及生化反應(yīng)，標化確定菌種，獲得純培養(yǎng)；將各種分化的菌株接種傳代，每種接種10-20個相應(yīng)培養(yǎng)集中，大量增菌；刮取菌株，用酚鹽水稀釋溶解成菌液，收集各種菌液共12瓶，55-60℃，30-60分鐘滅活，分別用磷酸鹽緩沖生理鹽水洗后，離心沉降；去脂，超聲粉碎，質(zhì)量檢測；滅活后的菌液各取0.1ml再次接種于相應(yīng)的培基中，觀察滅活效果；將各種分化的菌株接種傳代，大量增菌，若無細菌生長，則用無菌的酚鹽水稀釋菌液，以麥氏比濁法定量，用時將十二種菌苗按1∶1的比例均勻混和，配成總菌數(shù)量1億個/ml的濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于酚鹽水為0.5％重蒸酚和0.9％生理鹽水組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于去脂方法是菌苗分別用磷酸鹽緩沖生理鹽水洗3-5遍之后加入100％甲醇，攪拌1-2小時，離心沉降去脂。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的聯(lián)合菌苗及其制備方法。屬于涉及含有細菌的醫(yī)藥配置品。該菌苗是由肺炎雙球菌，甲型溶血型鏈球菌，乙型溶血型鏈球菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，卡他萘瑟氏菌，流感嗜血桿菌，銅綠甲單胞菌，變形桿菌，大腸埃希氏菌，肺炎克雷白桿菌，白色念珠菌的滅活菌液按1∶1的比例組合而成。主要適用于過敏性疾病的治療，過敏性鼻炎，過敏性結(jié)膜炎，各種支氣管炎及哮喘，以及藥物引起的耳聾等癥。經(jīng)臨床和病例確診的變態(tài)反應(yīng)性疾病患者使用，經(jīng)取得滿意的療效；而且，治療期間沒有發(fā)現(xiàn)任何毒副反應(yīng)。
文檔編號A61K39/02GK1483475SQ0213093
公開日2004年3月24日 申請日期2002年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月19日
發(fā)明者張玉環(huán), 張理濤, 趙振宇, 楊新建, 孫曉惠, 趙宏麗 申請人:天津市長征醫(yī)院