專利名稱：能夠減小個體發(fā)展變態(tài)反應的傾向的乳酸菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠減小個體發(fā)展變態(tài)反應的傾向的新乳酸菌株。特別是，本發(fā)明涉及表達多肽的新乳酸菌株及其在減小個體發(fā)展變態(tài)反應的傾向中的用途，其中所述多肽含有耐受原肽。本發(fā)明還涉及含所述微生物或其活性部分的食物或藥物組合物。
變態(tài)反應是免疫系統(tǒng)對各種物質(zhì)(變應原)的不良反應。通常，個體對在環(huán)境中經(jīng)常遇到的物質(zhì)，如花粉或食物材料不能產(chǎn)生有價值的免疫反應，相信這種非-反應性主要是由于免疫系統(tǒng)自身的抑制機理。然而，在受損的情況下，免疫系統(tǒng)不能發(fā)揮其抑制活性(也被稱為耐受性)，產(chǎn)生對變應原的特異性免疫反應即變態(tài)反應。變態(tài)反應包括生物活性化合物，如炎性介質(zhì)組胺，白三烯和酶從特定細胞，主要是肥大細胞和嗜堿性粒細胞到周圍組織和血管結(jié)構(gòu)中的釋放。肥大細胞分布在個體的各處組織中，同時在血管系統(tǒng)內(nèi)嗜堿性循環(huán)。在涉及IgE抗體的一系列事件中，所述化合物/介質(zhì)是從在藥理學反應中死亡的靶肥大細胞中釋放的。
在過去，經(jīng)歷變態(tài)反應的個體數(shù)增加，其經(jīng)常被歸因于日益增長的，由廢氣導致的大氣污染。且，據(jù)信蛋白質(zhì)材料的持續(xù)消耗可促進所述發(fā)展，特別是可促進食物過敏事件的增長。此外，在發(fā)達國家遇到的微生物感染缺陷已經(jīng)被暗示為特應性疾病增加的另一個可能性原因。
食物過敏，甚至是某些種類食物的不耐受已經(jīng)變得十分普遍。人們發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)受影響的個體都對食物的某些成分不耐受，大約5％的群體甚至發(fā)展成對已攝取物質(zhì)的反應，這種反應十分嚴重，因而須引起醫(yī)生的注意。
近幾年的證據(jù)已經(jīng)確定了食物不耐受的主要原因在于機體吸收的物質(zhì)常常被排斥，并被敏感個體的胃腸道吸收。據(jù)信這種不良-吸收源于排列在消化道中的組織的缺損(Peters等，(1988)Can，J.of Gastroenterol.2，127；Olaison等，(1990)Scand.J.of Gastroenterol.25，321；Hollander等，(1986)Ann.Of Int.Med.105，883)。最近確定的，排列于胃腸道的上皮細胞處理和描述抗原的能力也可解釋導致炎癥和變態(tài)反應的錯誤免疫反應的引發(fā)(Campbell等，(1999)Immunol.Rev.172，315)。
食物過敏的表現(xiàn)基本上可涉及機體中的任何組織。由于胃腸道較大的吸收面積，其很可能是攻擊性物質(zhì)的主要吸收位點。食物過敏的很多癥狀均是在消化道本身中表現(xiàn)的，但也可影響其它組織，包括皮膚和呼吸道。
在現(xiàn)有技術(shù)中，提出過使用不同的方法治療變態(tài)反應，特別是食物過敏。
這種方法其中一個旨在改變變應原材料自身的來源，從而減小它的變應潛在性。這可通過分別限制或禁止食物或其組分而達到，而所述食物或其組分可能正是這種問題的原因。通常，所涉及的問題在于對各種食物材料中的特異性抗原物質(zhì)(變應原)不太了解，因此在大多數(shù)情況下，不清楚應當選擇性地除去哪個組分。
在US-5,480,660中報道過小麥過敏患者的變態(tài)反應發(fā)作可通過除去或減少面粉中，具有至多30,000 Da分子量的蛋白和50,000-70,000 Da分子量的蛋白而緩解。
JP 11 04 67 21中公開了一種減少含蛋白食物材料的變應原性的方法，其中所述食物材料與小麥粉混合，180℃烘焙該混合物超過3分鐘。
US-4,293,571中描述了低變應原性組合物的制備，其中使蛋白質(zhì)材料經(jīng)過水解處理，剩余未水解的蛋白通過熱處理而凝固，接著通過超濾步驟除去凝固的物質(zhì)和可能構(gòu)成變應原的巨肽。
US-5,039,532中公開了另一種制備低變應原食物材料的方法，其中使乳清產(chǎn)物經(jīng)過酶水解。
然而，所有這些處理食物材料甚或?qū)⑺鼜娜粘ｏ嬍持谐サ姆椒ㄗ罱K證明難以實踐，這是因為它們需要更改飲食，通常包括嚴格限量，而且這些方法很可能最終影響生活的質(zhì)量和/或抑制個體預期的生長。
治療食物過敏和食物不耐受的不同方法旨在恢復并維持腸的完整性，這樣食物變應原基本上就不會通過。在這方面，US5,192,750描述了利用N-乙?；咸前肥拐衬ば纬煞乐故澄镒儜瓊鬟f所必需的屏障，并維持正常的功能。
根據(jù)另一個治療變態(tài)反應的方法，建議個體相對于IgE分子進行接種，其可抑制肥大細胞和嗜堿細胞的引發(fā)。為此，WO97/31948建議接種特異性肽，所述特異性肽與IgE分子，即涉及介質(zhì)釋放的免疫球蛋白的三維構(gòu)象部分類似，其中所述介質(zhì)涉及變態(tài)反應和炎性反應的調(diào)節(jié)。人們認為個體自身的免疫系統(tǒng)將最終形成針對所述IgE分子的抗體，這樣就可清除所述的IgE免疫球蛋白。然而，所述方法掩蓋了所形成的抗體可能與其它免疫球蛋白種類交叉反應的缺點，這樣會不利地影響所述個體的天然防御機理。
在本申請人所擁有的，至今仍未公開的專利申請EP 99200130.5中公開了另一種方法。其中提出一種低變應原性的組合物，其含有一種非-變應原性的，大量水解的蛋白材料和/或一種游離氨基酸，及至少一種各變應原蛋白的耐受原肽。雖然這種組合物可比現(xiàn)有技術(shù)提供更多的優(yōu)點，但它仍難以獲得耐受原肽，其每批不得不重新生產(chǎn)。
因此，現(xiàn)有技術(shù)需要提供治療變態(tài)反應的改進方法。
因此，本發(fā)明的其中一個目的在于提供這樣一種方法。
上述目的已經(jīng)通過提供新的乳酸菌株而得到解決，所述乳酸菌株能夠減小個體發(fā)展變態(tài)反應的傾向。所述新乳酸菌可表達一種含有耐受原肽的多肽，這樣就可保留耐受原肽的特異性序列及可能的構(gòu)型，保持穩(wěn)定性，并因此可由個體的免疫系統(tǒng)處理并識別。
在附圖中，

圖1表示包含在β-乳球蛋白水解產(chǎn)物各部分中的肽的一級序列；直條代表二硫鍵；圖2表示在各實驗中，使用耐受原肽/肽部分得到的結(jié)果。
乳酸菌，特別是乳桿菌和雙岐桿菌已經(jīng)顯示可通過產(chǎn)生涉及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的信使(細胞因子)而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，且不會離開它們的腔棲息地。乳酸菌不能引發(fā)促炎細胞因子，如IL-8，TNF-α，MCP-1和GM-CSF的產(chǎn)生，但可促進炎癥抑制細胞因子，如TGF-β的產(chǎn)生(Blum等，(1999)Antonie van Leeuwenhoek 76，199)，其明顯暗示了有關(guān)腸免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和上皮屏障完整性的維持(Planchon等，(1999)J.Cell Physiol.181，55)。同樣，乳桿菌勻漿的口服給藥顯示出對促細胞分裂劑-誘導的單核細胞增殖的抑制作用(Pessi等，(1999)Appl.Environ.Microbiol.65，4725)。
乳酸菌(LAB)可用于蛋白和肽的異源(超量-)產(chǎn)生，所述蛋白和肽具有允許基于染色體整合的外源基因或附加型質(zhì)粒因子的表達的系統(tǒng)(見，例如Kuipers等，(1997)Tibtech 15，140)。此外，乳酸菌具有定居粘膜表面的潛力，并顯示出一種內(nèi)源性的佐劑活性，這種內(nèi)源性的佐劑活性與肽聚糖降解所產(chǎn)生的胞壁酰肽有關(guān)。
此外，已經(jīng)顯示出某些乳桿菌菌株可促進抗原-特異性的免疫應答，特別是在IgA類(Majamaa等，(1995)J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.20，333)中。與抗原復合的人IgA不能激活補體，這對于粘膜表面完整性的維持比較重要。其可防止局部炎性反應，包括由于組織受損，粘膜滲透性提高導致的白細胞的流入和免疫效應子的釋放。此外，通過這種免疫排除機理，IgA可限制旁觀抗原的進一步吸收，并因此消除IgE和IgG同種型抗體介導的過敏反應。
此外，乳桿菌已經(jīng)顯示可通過分離的T細胞加強IFN-γ的產(chǎn)生(Halpern等，(1991)Int.J.Immunother.7，205)。最近，IFN-γ已經(jīng)顯示可抑制腸粘膜肥大細胞的TNF-α釋放(Bissonnette等，(1995)Int.Arch.Allergy Immunol.107，156)。IFN-γ分泌的增加可防止TNF-α的有害作用(Hernandez-Pando等，(1994)Immunology 82，591)，并因此消除與食物過敏有關(guān)的滲透性障礙。例如，變應性皮炎中，相對于抗原的攝取，腸屏障受損是對普通飲食和環(huán)境變應原的免疫應答增強的重要決定因素。
在通向本發(fā)明的廣泛研究過程中，本發(fā)明人已經(jīng)為此發(fā)明了將乳酸菌的有利特性與耐受原肽的潛在性結(jié)合，產(chǎn)生減小甚或使個體的變態(tài)反應傾向達到最小的方法。
本發(fā)明所用的乳酸菌株優(yōu)選屬于乳桿菌屬或雙岐桿菌屬或乳球菌屬，更優(yōu)選嗜酸乳桿菌，約氏乳桿菌，加氏乳桿菌，干酪乳桿菌，類干酪乳桿菌，路氏乳桿菌，它們?nèi)縼碓从谌嘶騽游镌础?br> 耐受原肽，其是一種來源于可引起個體變態(tài)反應的已知蛋白的肽，通常具有約200-6000 Da的大小，而且它是一種至少能夠誘導對蛋白耐受性的肽，而其正來源于該蛋白。此外，除了由特異性耐受原肽所表示的耐受性外，還可誘導對具有相同抗原決定子的任何物質(zhì)的耐受性。根據(jù)本發(fā)明，這種肽是通過重組方法插入到在乳酸菌內(nèi)合成的多肽中的，多肽對于細菌可以是內(nèi)源性的或外源性的。所述耐受原肽是以這種方式插入的，即它存在于所得重組多肽的周圍，這樣就可被免疫系統(tǒng)識別。
根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，可在乳酸菌中表達所述多肽。例如，市售載體pNZ124(Platteuw等，(1994)Appl.Env.Microbiol.60，587)，pGK12(Walke等，(1996)FEMS Microbiol.138，233)或pG+host9(Maguin等，(1996)J.Bacteriol 178，931)可用于附加型表達。然而，考慮到染色體整合較高的穩(wěn)定性，這種做法優(yōu)選用于編碼各種多肽的重組基因。為了整合到染色體中，可應用同源重組，例如使用來源于乳酸菌的，含有耐受原肽并替換內(nèi)源性基因的重組基因。然而，將重組基因引入到宿主染色體中的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。
所述多肽可以是通常被表達為在細胞內(nèi)停留的蛋白，但也可以是一種由乳酸菌分泌的多肽，或被插入到其細胞壁中的多肽，其具有含耐受原肽的部分，所述耐受原肽位于細胞外區(qū)域。本發(fā)明所用多肽的例子是pepN，pepX，乳酸脫氫酶或β-半乳糖苷酶，或bacteriosins類的成員或S-層蛋白或細胞壁固著蛋白酶。
多肽的性質(zhì)并不重要，只要其中可插入耐受原肽，這樣它就可進入免疫系統(tǒng)。然而，一旦已經(jīng)鑒定了適宜的耐受原肽，那么本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員就可在這個位置排列耐受原肽。為此，技術(shù)人員將考慮其中插入耐受原肽的多肽三維模型，并以這種信息為基礎設計一種相應的重組蛋白。
在優(yōu)選實施方案中，重組多肽是在細菌細胞壁中分泌或排列的，這樣耐受原肽可持續(xù)存在于環(huán)境中。
所述耐受原肽來源于引起變態(tài)反應的食物材料。然而，它的氨基酸序列是否與在天然蛋白中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列相同并不重要，但具有基本相同的氨基酸序列的任何肽序列，和可能作為起始肽的三維構(gòu)象，或從其衍生的，顯示基本相同的結(jié)果，即，導致變態(tài)反應減少的多肽均適用于已知的目的。
作為耐受原肽的優(yōu)選來源，可提到牛奶，大豆，花生，甲殼類動物，魚，肉，芝麻或乳清，如β-乳球蛋白，牛血清白蛋白或酪蛋白。
為了鑒定耐受原肽，首先將目標變應原材料酶水解至約10-50％的程度，并通過熱處理將蛋白混合物中的殘留酶活性滅活。澄清所述蛋白水解液，如果需要，再進一步純化。然后通過使溶液經(jīng)過沉淀處理或使它通過色譜柱而分離由此獲得的肽。
隨后，通過在動物模型中進行試驗而測定含不同肽部分的耐受原性。為此，給動物，如小鼠喂飼各種肽部分，接著利用所述變應原使其免疫，測量其反應，如外觀的改變，或具體測量動物的IgE水平。結(jié)果，耐受原肽部分會減小動物的變態(tài)反應傾向，這樣即可測定各種肽(部分)。
一旦耐受原肽及其氨基酸序列已經(jīng)被證實，在乳酸菌中表達的多肽DNA-序列即通過基因工程而被插入到編碼細菌蛋白載體的基因中。操縱微生物中DNA序列和表達蛋白的方法和技術(shù)在Sambrook等，ALaboratory Manual Cold Spring Harbor(1992)中描述。
本發(fā)明還涉及一種含有至少一種這種重組乳酸菌的食物和藥物組合物。
所述菌株可以105-1012cfu(菌落形成單位)/g的量包含在組合物中。同樣，乳酸菌培養(yǎng)物的上清液或其活性部分也可包含在所述組合物中。
所述食物組合物可以是牛奶，酸乳酪，凝乳，干酪，發(fā)酵牛奶，基于牛奶的發(fā)酵產(chǎn)品，冰淇淋，基于發(fā)酵谷物的產(chǎn)品，奶粉，嬰兒代乳品或動物食品，如寵物食品。
所述藥物組合物還可以是片劑，液體細菌混懸液或含細菌的一部分的制劑，如僅通過裂解細菌細胞并收集細胞壁成分獲得的細胞壁部分，干燥的口服添加物，濕潤的口服添加物，干燥的管式飼料或濕潤的管式飼料。
藥物制劑的給藥途徑是口服，但也可鼻飼。
本發(fā)明還涉及含本發(fā)明細菌或其一部分的疫苗。所述細菌可以是活的形式，或減弱的形式，即如果需要，減弱它們的生長潛力。可主要使用作為細胞一部分的，掩蓋目標抗原的細胞壁。所述細胞壁可通過溶解細胞并分離其不同的成分而很容易地獲得。
下列實施例用于進一步舉例說明本發(fā)明，而不是對它的限制。
實施例1耐受原肽的分離a)肽的分離將220gβ-乳球蛋白(Sigma)溶解在5％(w/w)濃度的雙蒸餾水中。以1/100(w/w)的酶/底物(E/S)比，將TPCK處理過的胰蛋白酶加入到所得溶液中，并在40℃，pH7.6時，在不斷攪拌下培養(yǎng)該溶液。1小時后，加入等量的酶，得到2/100的最終(E/S)比。繼續(xù)培養(yǎng)4小時，并通過熱處理(85℃，5分鐘)使酶滅活，從而終止反應。隨后冷凍干燥整個胰蛋白酶水解物，并通過陽離子樹脂的制備型色譜分離所得的肽產(chǎn)物。
得到15個不同的肽部分，每個肽部分約有2-23個氨基酸(約240-2720 Da)。將各部分納米過濾，膜滲濾，透析，再次冷凍干燥，并在室溫干燥貯存直至使用。所述部分還可利用反相高效液相色譜(HPLC)描述它們的肽含量。收集全部15個部分(F1-F15)，并列出所含的主要的肽(T)。
將肽分離并測序。其序列在圖1中表示。在不同的實驗中，各種肽均被證實是耐受原性的，其分別在Recquet R，Bovetto L，Maynard F，F(xiàn)ritschéR中詳細描述，通過牛β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解獲得的肽可誘導小鼠特異性的口服耐受性，J.Allergy Clin Immunol(2000)105514-21，其引入此處作為參考。
b)耐受原肽的合成在上述參考文獻中鑒定的三種β-乳球蛋白(BLG)的耐受原肽T6，T17和T6/T17和對照肽T13是利用BLG序列的側(cè)翼殘基，和外側(cè)的Cys殘基化學合成的，如下所列T6 C F KI D A L N E N KV S R8491T17 C N KV L V L D T D Y KK Y S92 100T6/T17 C F KI D A L N E N K V L V L D T D Y KK Y S84100T13L I V T Q T M KS R C1 8
c)動物試驗為了評估各種肽的耐受原性，使用Balb/c小鼠，這些小鼠是從IFFA-Crédo(L’Abresle France)獲得的。所述動物全部是用沒有牛奶的飲食飼養(yǎng)的。實驗開始時，所述動物3周大。它們通過管飼法接受天然的β-乳球蛋白(5mg/g體重)，各種量的消化β-乳球蛋白和各種量的，在上述a)中獲得的不同肽。5天后，利用作為非相關(guān)抗原的卵清蛋白(V級，Sigma)和β-乳球蛋白，使接受這種飲食的所有小鼠免疫，以便評估免疫應答的特異性。延遲型過敏性的評估(DTH)是在系統(tǒng)攻擊后21天，通過比較免疫前后左后足墊的厚度進行的。免疫24小時后，測量動物的足墊厚度(以Δ厚度(mm)表示)。隨后，采集所有小鼠的血液，接著取得脾臟，按照治療組將它們合并。對各組進行脾細胞特異性增殖測定。單獨收集腸內(nèi)含物。在-80℃時，單獨冷凍血清和腸樣品，直到進行各自的測定。測定血清和腸樣品中的抗-β-乳球蛋白IgE和抗-卵清蛋白IgE的水平。
d)IgE抗體測定稀釋血清和腸流體，一式兩份，利用ELISA測定抗-β-乳球蛋白和抗-卵清蛋白的IgE抗體。將20只未免疫小鼠的合并樣品用作陰性對照。滴定度是通過計算樣品的稀釋度測定的，其產(chǎn)生兩倍于陰性對照組的吸收度。所述滴定度是以稀釋度倒數(shù)的log10表示的。
e)細胞培養(yǎng)物在PBS中勻化脾細胞溶液并純化。在β-乳球蛋白或植物凝集素A存在的情況下協(xié)同培養(yǎng)。在培養(yǎng)的最后6小時，加入含氚的胸腺嘧啶核苷([3H]-Thy(Amersham，Zürich)，收集平板并通過閃爍計數(shù)分析。刺激指數(shù)是根據(jù)空白-扣除試驗和對照水平的比計算的，所述對照水平是以通過三重培養(yǎng)摻入的[3H]-Thy的平均cpm表示的。
f)通過口服給予合成肽誘導的耐受性在非腸道小鼠模型中，分析所述合成肽的耐受原能力。所得結(jié)果如下
SI刺激指數(shù) MLN腸系膜淋巴結(jié)從上述可知，合成肽T-17既可減少IgE的產(chǎn)生又可減少T細胞的增殖，而肽T-6僅抑制T細胞的應答。相反，肽T-13，即對照肽，不能誘導對BLG的口服耐受性。
實施例2重組多肽的構(gòu)建用細胞表面固著蛋白酶融合在實施例1中鑒定的，顯示出耐受原性的肽T6和T17，使其在細菌表面顯示。作為陰性對照肽T13，可使用β-乳球蛋白的N-末端構(gòu)成部分。
所述細胞表面固著蛋白酶(上述)屬于保加利亞乳桿菌，其序列在Gilbert等，(1996)J.Bacteriol，178，3059-3065中公開。此蛋白是由2000個氨基酸蛋白表示的，包括負責酶的細胞輸出的33個氨基酸前導肽(前區(qū))，和一系列154個氨基酸的肽(前-區(qū))，其在裂解后可激活酶的蛋白分解活性，及活性位點的700-800個氨基酸。接下來的區(qū)(大約1000個氨基酸)可在所產(chǎn)生肽的細胞的裂解和轉(zhuǎn)運特異性中起作用，并可跨越細胞壁。所述蛋白酶是通過其羧基末端與最后200個氨基酸細胞壁固著的，所述最后200個氨基酸負責與細胞壁多聚糖結(jié)構(gòu)的特異性共價結(jié)合。
所述蛋白酶基因是通過使用下列兩種引物，利用其啟動子首先擴增的5’-TTTTGTGGATCCTTAACTTCATAGCACG-3’(基因啟動子的上游，攜帶BamHI位點)
5’-ATATTATCTAGAATTGAATAGATTGCC-3’(所述基因的rho-依賴性終止子的下游，攜帶XbaI位點)所述擴增產(chǎn)物是用BamHI和XbaI裂解的，并被克隆到乳酸菌載體pNZ124中，其已經(jīng)用相同的限制酶消化，并最終通過電穿孔而被引入到?jīng)]有質(zhì)粒(β-半乳糖苷酶和蛋白酶陰性的)的乳酸乳球菌中。
用目標肽/多肽的序列替換克隆蛋白酶的活性位點區(qū)。為了達到目的，所述克隆蛋白酶是用NheI和PvuI裂解的，其中NheI位于前導肽裂解位點序列下游的50bp處，PvuI位于另一下游的800bp處。將編碼目標肽的DNA序列插入到兩個限制位點，如兩個寡核苷酸之間，其被設計為一旦雜交，則在它們的末端產(chǎn)生兩個限制位點。寡核苷酸的設計考慮到在與蛋白酶基因連接時，重組蛋白的讀框保持開放。
較大多肽的插入是使用含兩個限制位點的引物，通過DNA擴增進行的。用限制酶裂解擴增產(chǎn)物。在兩種情況下，所述DNA片段與蛋白酶基因連接，并通過電穿孔而被引入到乳酸乳球菌和約氏乳桿菌中。
含肽T6和T17的重組質(zhì)粒構(gòu)建體已經(jīng)按照布達佩斯條約，于2000年9月22日保藏在巴斯德研究所中，保藏號分別為CNCM I-2563和CNCM I-2564。
實施例3乳酸乳球菌和約氏乳桿菌的轉(zhuǎn)化為了進行轉(zhuǎn)化，使乳酸乳球菌菌株(MG 1363，沒有質(zhì)粒)和約氏乳桿菌La1(從Institute Pasteru獲得，登記號為CNCM I-1225)在37℃的GasPak厭氧系統(tǒng)中的MRS肉湯培養(yǎng)基中過夜生長。將此培養(yǎng)物的等分試樣用于接種其它含0.5M蔗糖的肉湯培養(yǎng)基(MRS)。以2％再次接種到200ml MRS+0.5M蔗糖中后，使所述培養(yǎng)物生長至OD595等于0.6。通過4℃時，以5000rpm離心10分鐘來收集細胞，用1/2體積含1M蔗糖和2.5mM CaCl2的溶液洗一次，用1/4體積含1M蔗糖和2.5mM CaCl2的溶液洗一次，將離心后獲得的顆粒在3.5ml的1M蔗糖，2.5mMCaCl2+0.459ml 87％甘油的溶液(最終濃度為10％)中重懸浮。所述細胞可直接用于轉(zhuǎn)化或在-80℃冷凍。
為了進行電穿孔，將40μl細胞與10-100ng(＜5μl體積)的DNA混合，并轉(zhuǎn)移到冰冷的0.2cm電穿孔杯中。在冰凍的0.2cm電穿孔杯中應用200Ω，25μF，2.5kV的脈沖。將1ml的MRS+20mM MgCl2，2mMCaCl2加入到杯中，并在適宜的溫度(對于乳酸乳球菌為30℃，對于約氏乳桿菌為37℃，當使用ts質(zhì)粒(pG+host9)時，培養(yǎng)溫度為30℃)培養(yǎng)所述混懸液2-3小時。在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化之后，分別將10μl和100μl等分試樣平板接種在含適宜抗生素的MRS瓊脂平板上，并在利用連接混合物轉(zhuǎn)化之后，分別將100μl和500μl平板接種在含適宜抗生素的MRS瓊脂平板上。所述平板在與上述相同的溫度下，厭氧培養(yǎng)24-48小時。
作為一種選擇性的介質(zhì)，也可使用具有紅霉素的MRS(2.5μg/ml)或具有卡那霉素的MRS(5μg/ml)。
實施例4相對于耐受原性BLG肽產(chǎn)生的大鼠抗血清和單克隆抗體將所述BLG肽T6，T17，T6/T17和T13(在實施例1中描述)與馬來酰亞胺-激活的KLH偶聯(lián)，并與Titermax佐劑一起，使用沒有乳蛋白的飲食喂飼的大鼠免疫。在第一次免疫之后，以2周的時間間隔采集血液樣品，如此一直進行115天，通過ELISA顯示所采集的血液樣品含有對BLG肽特異性的抗體。
抗-T6和抗-T13抗血清還與BLG的天然(ELISA)或變性(SDS-PAGE+蛋白質(zhì)印跡)形式反應?？?T6和抗-T13可特異性識別在重組乳酸乳球菌表面表達的BLG肽。結(jié)果在表I中顯示。
表I抗β-乳球蛋白肽抗血清的反應性
ELISA/OD490nm(15’/37℃)+++ ＞0.3++0.2-0.3+ 0.1-0.1+/- 0.05-0.1- ＜0.1NT沒有檢測到nat.BLG 3x溶解在PBS中的結(jié)晶BLG(Sigma)den.BLG 3x在SDS樣品緩沖液中稀釋并煮沸的結(jié)晶BLG(Sigma)LI/T 具有插入BLG肽的保加利亞乳桿菌蛋白酶的重組乳酸乳球菌為了產(chǎn)生雜交瘤分泌抗-BLG肽單克隆抗體，獲得免疫大鼠的脾臟。按照標準技術(shù)用骨髓瘤細胞融合所述脾細胞，且第一輪篩選已經(jīng)可鑒定產(chǎn)生抗-T6或抗-T17抗體的細胞群。這些細胞的克隆是使用細胞分選器進行的，從而確保每個孔中存在1個單一的細胞。
實施例5利用抗體檢測耐受原肽為了進行測定，在某種意義上，不論所述乳酸菌是否表達耐受原肽，從而接近或被抗體識別，含重組基因的細菌都是在50ml培養(yǎng)基中生長的，并通過離心收集細胞。隨后用50ml TBS洗該細胞兩次，并最終在6ml TBS中懸浮該細胞。將75μl混懸液轉(zhuǎn)移到孔中(半孔平底ELISA平板)，并在37℃時，使平板在沒有蓋蓋子的情況下保持24小時，從而使孔干燥。用TBS/PBS洗該平板3次，直到洗出未結(jié)合的細菌，隨后在37℃時，用TBS-酪蛋白(1.5g/l)對細胞進行封閉處理。向孔中加入含針對特異性肽的抗體的大鼠抗血清。使用含0.1％吐溫20的TBS-酪蛋白稀釋液室溫過夜培養(yǎng)該孔。接著，用TBS洗該孔3次，并加入發(fā)育抗體(HRP-結(jié)合的山羊抗-大鼠IgG)，隨后在37℃時，在含0.2％吐溫20的TBS-酪蛋白稀釋液中培養(yǎng)。用TBS洗該孔3次，并用OPD/H2O2展開，在490nm處閱讀。
我們觀察到乳酸乳球菌和約氏乳桿菌表現(xiàn)出一種陽性反應，表明耐受原肽可被抗體識別。
實施例6兔子抗血清的制劑涉及保加利亞乳桿菌prtB蛋白酶的氨基酸殘基472-659。
編碼氨基酸殘基472-659(氨基酸數(shù)1是起始甲硫氨酸)的prtB靶序列(bp 1414-1977)是使用pMD114作為模板，和序列的上游引物(prtB5’-1414)5‘-GCGGATCCGGCTTGGGCGGTGCAGATG-3’(含5’-BamHI位點)，及序列的下游引物(prtB5’-1977)5’-CGCAAGCTTGTGCGAAGTGTTCATGGC-3’(含5’-HindIII位點)通過PCR擴增的。
所述特異性PCR產(chǎn)物是使用Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer)，利用3次循環(huán)得到的，所述3次循環(huán)包括95℃時進行變性步驟30秒，56℃時進行引物退火步驟30秒，72℃時進行延伸步驟45秒，接著是進行退火步驟至60℃，循環(huán)27次。
在脫鹽并除去引物和dNTPs(高純度的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，Roche)后，用BamHI和HindIII消化該樣品，然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，從凝膠上回收目標DNA帶(E.Z.N.A.凝膠提取試劑盒，Peqlab)。
所述純化的擴增產(chǎn)物是在pQE-9大腸桿菌表達載體(Qiagen)的BamHI和HindIII位點之間連接的，其位于編碼6-組氨酸標記物的序列下游。
大腸桿菌菌株M15[pREP4]是用這種載體轉(zhuǎn)化的，并在1mM IPTG-介導的培養(yǎng)物的誘導后，獲得異源蛋白的表達。
將1升培養(yǎng)物的細胞濃縮，并在變性條件(8M尿素)下溶解。通過離心獲得澄清的溶解產(chǎn)物，并將其裝到Ni2+-NTA瓊脂糖珠(Qiagen)上，其在pH8.0時平衡，從而使6-組氨酸-標記的蛋白結(jié)合。pH6.3的清洗步驟后，在pH4.5時洗脫重組蛋白。
用100mM Tris-Cl(pH7.5)中和所述物質(zhì)，通過二辛可寧酸蛋白測定法(Pierce)量化，并使用相同的緩沖液將其濃度調(diào)至1mg/ml。
用完全的Freund’s佐劑乳化所述抗原，并通過多次皮內(nèi)注射將其給予兩只兔子。注射是在第0，14，28和56天進行的。最終的出血發(fā)生在第80天。
所述抗血清的反應性，其出人意外的強，這是通過在重組Lc上進行ELISA，其中所述重組Lc在它們的細胞表面表達保加利亞乳桿菌prtB蛋白酶，并通過在表達蛋白酶分泌形式的重組Lc培養(yǎng)物上清液上進行免疫印跡而加以證實的。
關(guān)于微生物保藏的說明(細則13之二)
權(quán)利要求
1.一種乳酸菌類菌株，其表達含有耐受原肽的多肽，該耐受原肽與所述多肽是異源的，這樣所述肽對于由胃/十二指腸酶所致的降解穩(wěn)定，并保留了它的耐受原性，且所述肽是在多肽的周圍顯示的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其選自乳桿菌屬或雙岐桿菌屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的菌株，其中所述多肽選自表面蛋白，細胞內(nèi)蛋白或由細菌分泌的蛋白。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項所述的菌株，其中所述耐受原肽得自食物材料。
5.一種含有前述權(quán)利要求任何一項所述的菌株或其上清液的食物組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的食物組合物，其選自牛奶，酸乳酪，凝乳、干酪，發(fā)酵牛奶，基于牛奶的發(fā)酵產(chǎn)品，冰淇淋，基于發(fā)酵谷物的產(chǎn)品，奶粉，嬰兒代乳品或?qū)櫸锸称贰?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求5或6任何一項所述的食物材料，其中所述菌株是以107-1011cgu/劑量的用量包含在其中的。
8.一種含有權(quán)利要求1-4任何一項所述的菌株或其上清液的藥物組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中所述菌株是以1010-1012cfu/劑量的用量形式包含在其中的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項所述的菌株或其上清液用于制備治療變態(tài)反應的可攝取載體的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9任何一項所述的食物或藥物組合物用于制備治療變態(tài)反應的可攝取載體的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述組合物經(jīng)口腔或鼻途徑給予。
13.一種含有權(quán)利要求1-4任何一項所述的菌株，或其一部分的疫苗。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的疫苗，其中使用裂解細菌的細胞膜部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠減小個體發(fā)展變態(tài)反應的傾向的新乳酸菌株。特別是，本發(fā)明涉及乳酸菌株的產(chǎn)生及其在減小個體發(fā)展變態(tài)反應的傾向中的用途，其中所述乳酸菌株表達含有耐受原肽的蛋白。本發(fā)明還涉及含所述微生物或其活性部分的食物或藥物組合物。
文檔編號A61K39/07GK1479788SQ01816243
公開日2004年3月3日 申請日期2001年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月25日
發(fā)明者J·E·格爾蒙德, B·科爾特斯, B·莫勒特, R·弗里特舍, J E 格爾蒙德, 仗, 廝, 鍰厴 申請人:雀巢制品公司