本發(fā)明涉及DNA疫苗領(lǐng)域，具體而言，涉及一種分離的DNA片段、針對羊種3型布魯氏菌感染的DNA疫苗、疫苗制劑、DNA疫苗的制備方法和疫苗制劑的制備方法。

背景技術(shù)：

布魯氏菌病(Brucellosis)，又稱布魯氏桿菌病，簡稱布病。布病是由布魯氏菌屬細(xì)菌侵入機(jī)體后引起傳染-變態(tài)反應(yīng)性人畜共患的傳染病。人類、家畜及動(dòng)物普遍易感，人感染主要表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、盜汗、全身不適等癥狀，而動(dòng)物感染的臨床癥狀主要是流產(chǎn)、不孕、生殖器官受侵害。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)已將布病列為B類動(dòng)物疫病，我國也將其列為二類動(dòng)物疫病。近年來，布病的人畜疫情在我國和世界其他國家和地區(qū)出現(xiàn)回升勢頭。中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)的數(shù)據(jù)表明，2004年以后，我國布病發(fā)病率不斷上升，至2009年我國人間布病已報(bào)告發(fā)病35816人。我國每年因布病而產(chǎn)生的治療費(fèi)用、誤工損失以及對畜牧業(yè)造成直接、間接經(jīng)濟(jì)損失已經(jīng)成為一筆天文數(shù)字。因此，如何防治布病已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。

布病的病原是布魯氏菌(Brucella)，屬于革蘭氏陰性菌，無質(zhì)粒、芽孢和莢膜，兼性寄生于單核巨噬細(xì)胞內(nèi)。該菌產(chǎn)生有毒性的內(nèi)毒素，內(nèi)毒素有致熱性、致死作用和皮膚過敏原性。病菌主要經(jīng)呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等進(jìn)入機(jī)體，隨淋巴液達(dá)淋巴結(jié)，被吞噬細(xì)胞吞噬。如吞噬細(xì)胞未能將細(xì)菌殺滅，則細(xì)菌在胞內(nèi)生長繁殖，形成局部原發(fā)病灶，隨之大量細(xì)菌進(jìn)入淋巴液和血液循環(huán)形成菌血癥，并隨血流帶至全身，在肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓等處的單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)繁殖，形成多發(fā)性病灶。

根據(jù)宿主差異、生化反應(yīng)特點(diǎn)及菌體表面的不同結(jié)構(gòu),可將布魯氏菌分成6個(gè)不同的種,包括羊種布魯氏菌(B.melitensis)、牛種布魯氏菌(B.abortus)、豬種布魯氏菌(B.suis)、綿羊種布魯氏菌(B.ovis)、沙林鼠種布魯氏菌(B.neotomae)和犬種布魯氏菌(B.canis)；其中，羊種布魯氏菌又包括1型、2型和3型。近年來，我國流行的布魯氏菌主要是羊種3型布魯氏菌，該布魯氏菌對人、畜均有很強(qiáng)的毒力和侵襲力，致病力也很強(qiáng)，人畜感染后癥狀較嚴(yán)重，容易引起布病的爆發(fā)和流行。因此，采取有效措施防治羊種3型布魯氏菌引起的布病對畜牧業(yè)和公共健康事業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

目前，全世界范圍內(nèi)消滅該病的主要方法是撲殺與免疫結(jié)合，而在布病發(fā)生相對嚴(yán)重的中國，由于撲殺的成本高，疫苗預(yù)防成為本病主要控制手段?，F(xiàn)有的布魯氏菌病疫苗主要集中在減毒活疫苗和滅活疫苗，其中，在廣泛應(yīng)用的疫苗主要有減毒活疫苗S19、Rev.1疫苗、羊種布魯氏菌M5減毒活疫苗。但上述疫苗都屬于傳統(tǒng)的減毒活疫苗，仍保持一定毒力，容易出現(xiàn)病毒毒力回復(fù)，即“返祖現(xiàn)象”，存在安全性的問題。另外，活疫苗須在低溫條件下保存及運(yùn)輸，對保存和運(yùn)輸?shù)囊筝^高。

為了克服常規(guī)疫苗存在殘余毒力等缺陷，科技人員也對布魯氏菌病DNA疫苗進(jìn)行研究。DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗，是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。DNA疫苗具有接種載體(如質(zhì)粒)結(jié)構(gòu)簡單，生產(chǎn)成本低，適于大批量生產(chǎn)、便于運(yùn)輸和保存、比傳統(tǒng)疫苗更安全等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)成功制備出L7/L12、P39等DNA疫苗，但上述DNA疫苗存在諸多缺陷，例如，pCDNA3-L7/L12刺激的免疫反應(yīng)只能保持較短的時(shí)間(4周)，P39真核疫苗只有較低的保護(hù)效力，在攻毒8周后免疫應(yīng)答的效果才明顯(log0.73)，但與傳統(tǒng)的S19弱毒疫苗相比，還存在一定差距?？偠灾?，現(xiàn)有技術(shù)缺乏一種安全、穩(wěn)定、抗體效價(jià)高、免疫效力時(shí)間長的布魯氏菌病DNA疫苗，特別是缺少一種針對羊種3型布魯氏菌感染的DNA疫苗。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種分離的DNA片段，該DNA片段為分離自羊種3型布魯氏菌的Omp31基因。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種針對羊種3型布魯氏菌感染的DNA疫苗，所述的DNA疫苗針對羊種3型布魯氏菌的感染，具有安全無毒、免疫效力強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長、便于運(yùn)輸和保存等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種疫苗制劑。

本發(fā)明的第四目的在于提供一種針對羊種3型布魯氏菌感染的DNA疫苗的制備方法，該制備方法簡單易行，便于大規(guī)模生產(chǎn)。

本發(fā)明的第五目的在于提供一種疫苗制劑的制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種分離的DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本發(fā)明所述DNA片段為分離自羊種3型布魯氏菌的Omp31基因，所述Omp31基因編碼具有免疫作用的Omp31蛋白。因此，本發(fā)明所述DNA片段可以用于制備針對羊種3型布魯氏菌的疫苗。

一種針對羊種3型布魯氏菌感染的DNA疫苗，所述DNA疫苗為包含上述DNA片段的真核表達(dá)載體。

本發(fā)明所述DNA疫苗的抗原基因克隆自羊種3型布魯氏菌的Omp 31基因。因此，本發(fā)明所述DNA疫苗對在我國廣泛流行的羊種3型布魯氏菌具有針對性，有利于防治由羊種3型布魯氏菌引起的布病。另一方面，本發(fā)明所述DNA疫苗與傳統(tǒng)減毒M5疫苗相比，具有更高的淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)和更強(qiáng)的細(xì)胞殺死力。而就抗體表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間而言，本發(fā)明所述DNA疫苗與減毒M5疫苗的抗體表達(dá)水平和抗體持續(xù)時(shí)間基本相當(dāng)。因此，本發(fā)明所述DNA疫苗具有比傳統(tǒng)弱毒疫苗更好的免疫效果，具有與傳統(tǒng)弱毒疫苗基本相當(dāng)?shù)目贵w效價(jià)和持續(xù)時(shí)間，克服了現(xiàn)有技術(shù)中布魯氏菌DNA疫苗的免疫力弱、效價(jià)低、抗體持續(xù)時(shí)間短的缺陷。

如上所述DNA疫苗，優(yōu)選地，真核表達(dá)載體選自pVAX1、pCI、pcDNA3.1和pJW4303。

一種疫苗制劑，所述制劑包括上述DNA疫苗和佐劑。

如上所述的疫苗制劑，優(yōu)選地，所述佐劑選自細(xì)胞因子基因佐劑和/或載體功能免疫佐劑中的一種或幾種。

如上所述的疫苗制劑，優(yōu)選地，所述細(xì)胞因子基因佐劑選自IL-2、IL-12、IFN-γ、GM-CSF中的一種或幾種，所述載體功能免疫佐劑選自脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物(Immune stimulating complexes,ISCOMs)和減毒的侵襲性胞內(nèi)細(xì)菌中的一種或幾種。

如上所述的疫苗制劑，優(yōu)選地，所述DNA疫苗和所述佐劑的質(zhì)量比為1：1-5。

本發(fā)明所述疫苗制劑將DNA疫苗與佐劑配合使用，發(fā)現(xiàn)佐劑能夠顯著增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性從而提高DNA疫苗的免疫效果。尤其是將DNA疫苗的真核表達(dá)載體與細(xì)胞因子基因佐劑，優(yōu)選IL12、IL2基因佐劑，配合使用，能夠極大地提高本發(fā)明所述免疫制劑的效果。本發(fā)明對DNA疫苗和佐劑的用量比進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)真核表達(dá)載體與佐劑的質(zhì)量比為1：1-5時(shí)，本發(fā)明所述DNA疫苗的免疫效果尤其好。真核表達(dá)載體與佐劑的質(zhì)量比還可以為1:2-4或1:3等。

一種制備上述DNA疫苗的方法，所述方法包括：構(gòu)建包含權(quán)利要求1所述DNA片段的真核表達(dá)載體。

本發(fā)明所述制備方法主要涉及真核表達(dá)載體的構(gòu)建，不需要直接接觸致病菌，操作簡單安全，易于大規(guī)模生產(chǎn)。

如上所述的方法，優(yōu)選地，所述方法具體包括以下步驟：(1)通過PCR方法擴(kuò)增得到上述DNA片段；(2)用EcoRⅠ和BamHⅡ分別酶切PCR擴(kuò)增所得DNA片段和pVAX1載體；(3)連接酶切后的DNA片段和pVAX1載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；(4)挑取陽性克隆，通過雙酶切和測序方式對陽性克隆進(jìn)行確認(rèn)；(5)提取陽性克隆的質(zhì)粒。

如上所述疫苗制劑的方法，將所述DNA疫苗與所述佐劑混合。

本發(fā)明所述疫苗制劑的制備方法將DNA疫苗與佐劑混合，能夠顯著地提高疫苗制劑的免疫效力。

一種預(yù)防羊種3型布魯氏菌感染的方法，包括：將如上所述的DNA疫苗或所述疫苗制劑導(dǎo)入羊體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

優(yōu)選的，所述羊包括盤羊(Argali)、赤羊(Urial)、綿羊、家羊、摩弗倫羊(Mouflon)、大角羊(Bighorn sheep)、白大角羊(Dall sheep)、雪山盤羊(Snow sheep)或赤盤羊。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)、本發(fā)明所述DNA片段為克隆自羊種3型布魯氏菌的Omp31基因，該基因可以用于制備特異性針對羊種3型布魯氏菌的疫苗。

2)本發(fā)明所述DNA疫苗針對的是羊種3型布魯氏菌，能夠有效地防治在我國廣泛流行地由羊種3型布魯氏菌引起布病，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有針對羊種3型布魯氏菌的疫苗，特別是DNA疫苗。與傳統(tǒng)減毒疫苗相比，本發(fā)明所述DNA疫苗具有基本相當(dāng)，甚至略強(qiáng)的免疫效果，但不存在毒力回復(fù)的危險(xiǎn)，其安全性更高，且易于運(yùn)輸和保存。而與現(xiàn)有針對布魯氏菌的DNA疫苗相比，本發(fā)明所述DNA疫苗具有更強(qiáng)的免疫效果和更長的抗體持續(xù)時(shí)間。

3)本發(fā)明所述DNA疫苗制劑將DNA疫苗與佐劑配合使用，并對佐劑的種類、DNA疫苗與佐劑的用量配比進(jìn)行優(yōu)化，所獲得的疫苗制劑具有更好的免疫效果。

4)本發(fā)明所述DNA疫苗的制備方法和疫苗制劑的制備方法主要涉及載體構(gòu)建、質(zhì)粒提取等分子生物學(xué)操作，不需要與有毒致病菌接觸，更為安全，并且本發(fā)明所述方法操作簡單，便于大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為受檢菌的革蘭氏染色結(jié)果；

圖2為受檢菌的柯茲洛夫斯基染色(柯氏染色)結(jié)果；

圖3為受檢菌的AMOS-PCR鑒定結(jié)果，其中M代表Marker，1代表豬種疫苗株S2，2代表羊種疫苗株M5，3代表受檢菌，4代表大腸桿菌埃希菌；

圖4為實(shí)施例2中Omp31基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，其中M代表Marker，1～3代表PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

圖5為實(shí)施例2中雙酶切驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的電泳圖，其中M代表Marker，1代表陽性克隆；

圖6為實(shí)施例2中SDS-PAGE的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，其中M代表Marker，1代表對照，2、3代表陽性克隆；

圖7為實(shí)施例2中WB檢測結(jié)果，其中M代表Marker，1代表陽性克??；

圖8為實(shí)施例3中雙酶切鑒定真核重組質(zhì)粒的電泳圖，其中M代表Marker,1代表被酶切的真核重組質(zhì)粒；

圖9為COS-7細(xì)胞中Omp31的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果；

圖10為Omp31二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，其中最長豎線表示α-螺旋，次長豎線表示延伸鏈；次次長豎線表示β-轉(zhuǎn)角，最短豎線表示無規(guī)卷曲；

圖11為Omp31三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果；

圖12為Omp31分子表面可能性分析結(jié)果；

圖13為Omp31分子親水性分析結(jié)果；

圖14為Omp31分子柔性分析結(jié)果；

圖15為Omp31分子抗原指數(shù)分析結(jié)果；

圖16為免疫小鼠的淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)的分析結(jié)果，其中*VS.saline group,p<0.05；#Vs.M5group,p<0.05；

圖17為免疫小鼠體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖18為免疫小鼠血清抗體水平，其中M代表M5疫苗，S代表Omp31DNA疫苗，P代表磷酸鹽緩沖液。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

羊種3型布魯氏菌的鑒定

從青海省海晏縣流產(chǎn)羔羊中分離出羊種3型布魯氏菌，并對其進(jìn)行鑒定。

1、菌株培養(yǎng)和染色鏡檢

將流產(chǎn)羔羊置于生物安全柜內(nèi)進(jìn)行組織取樣，研磨所取組織樣品，取研磨懸浮液接種于TSA培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱生長24h后取出，將單個(gè)菌落接種于TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)。觀察菌落形態(tài)并按如下方法進(jìn)行革蘭氏染色和柯茲洛夫斯基染色(柯氏染色)。

革蘭氏染色法：用接種環(huán)勾取少量菌液均勻涂抹于干燥的載玻片中央，火焰固定，滴加草酸銨結(jié)晶紫初染1min，將染液用蒸餾水沖去，加碘液覆蓋涂面染約1min，用水沖洗、吸水紙吸去水分，加95％酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，20s后水洗，吸去水分，蕃紅染色液(稀)染30s后，蒸餾水沖洗，干燥，鏡檢。

柯茲洛夫斯基染色(柯氏染色)：用接種環(huán)勾取少量菌液均勻涂抹于干燥的載玻片中央，火焰固定，滴加沙黃溶液，酒精燈加熱2min左右，直至出現(xiàn)氣泡為止，水洗后滴加孔雀綠進(jìn)行復(fù)染，蒸餾水沖洗，干燥，鏡檢。

受檢菌經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)2d～4d后，在肝浸液固體培養(yǎng)基上可見無色、半透明菌落，邊緣整齊，折光較明顯，呈露滴狀。革蘭染色后菌體較小，圓形或球桿狀，呈紅色，無芽孢，無鞭毛，無莢膜；科茲洛夫斯基鑒別染色可見有紅色細(xì)菌分布。革蘭氏染色和科茲洛夫斯基染色的染色結(jié)果如圖1～圖2所示。

2、生化鑒定、單相特異性血清A和M凝集試驗(yàn)及噬菌體裂解試驗(yàn)

通過生化鑒定、單相特異性血清A和M凝集試驗(yàn)及噬菌體裂解試驗(yàn)對受檢菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。鑒定結(jié)果如表1所示。

表1生化鑒定、單相特異性血清A和M凝集試驗(yàn)即噬菌體裂解試驗(yàn)

3、AMOS-PCR鑒定結(jié)果

應(yīng)用AMOS-PCR方法對受檢菌進(jìn)行進(jìn)種型鑒定，AMOS-PCR的檢測結(jié)果如圖3所示。根據(jù)圖3可知，受檢菌經(jīng)PCR擴(kuò)增得到與羊種免疫株M5相同大小的特異性片段。

根據(jù)菌落觀察、染色、生化鑒定、單相特異性血清A和M凝集試驗(yàn)及噬菌體裂解試驗(yàn)、以及AMOS-PCR試驗(yàn)的鑒定結(jié)果可以確定從海省海晏縣流產(chǎn)羔羊中分離出的菌株為羊種3型布魯氏菌。

實(shí)施例2

Omp31基因的克隆、在大腸桿菌中表達(dá)、純化和鑒定

1、Omp31基因的克隆

按照如下方法克隆Omp31基因：1)從實(shí)施例1分離獲得的羊種3型布魯氏菌中提取基因組DNA；2)參考Genebank基因編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)羊種3型布魯氏菌外膜蛋白Omp31基因的引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長度為685bp，合成引物，上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；3)利用步驟1)提取的基因組DNA和步驟2)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段；4)瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物；5)切膠，回收目的DNA條帶；6)將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含IPTG和X-gal的LB氨芐青霉素固體培養(yǎng)基上過夜，次日挑白色菌落，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；7)從擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液中提取質(zhì)粒，用BamHⅠ以及XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，挑出陽性克隆，送上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，陽性克隆命名為pMD19-T-Omp31。其中，PCR擴(kuò)增結(jié)果和酶切結(jié)果如圖4～5所示。經(jīng)測序確認(rèn)，PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到的基因?yàn)镺mp31，其基因序列如SEQ ID No：3所示，該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2、Omp31基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和鑒定

雙酶切Omp31基因，之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，再連接目的片段與同樣經(jīng)過雙酶切的原核表達(dá)載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中，隨后將其涂布于含有抗生素的固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，通過PCR和雙酶切以及測序的方式對Omp31原核表達(dá)載體進(jìn)行鑒定。將經(jīng)鑒定含有Omp31原核表達(dá)載體的陽性單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)Omp31蛋白的表達(dá)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)液，離心收集菌體，提取并純化蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，觀察Omp31基因在大腸桿菌中的表達(dá)情況。染色結(jié)果如圖6所示。使用電轉(zhuǎn)儀將SDS-PAGE膠面蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，進(jìn)行Western-blot檢測。檢測結(jié)果如圖7所示。根據(jù)圖6～7可知，本發(fā)明在大腸桿菌中成功表達(dá)出Omp31蛋白。

實(shí)施例3

Omp31基因的克隆、在真核細(xì)胞表達(dá)和鑒定

1、真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建以及酶切鑒定

用EcoRⅠ和BamHⅡ分別酶切Omp31基因和pVAX1載體，連接酶切后的Omp31基因與pVAX1基因，構(gòu)建Omp31-pVAX1真核表達(dá)載體。將該真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用EcoRⅠ和BamHⅡ進(jìn)行雙酶切鑒定，篩選陽性重組質(zhì)粒，并測序。具體酶切檢測結(jié)果如圖8所示。根據(jù)圖8可知，本發(fā)明成功構(gòu)建出Omp31-pVAX1真核表達(dá)載體。

2、轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞以及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

根據(jù)Invitrogen公司脂質(zhì)體說明書進(jìn)行，分別將Omp31-pVAX1、pVAX1載體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，然后置于37℃、5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24h后，收集COS-7細(xì)胞，通過免疫細(xì)胞化學(xué)的方法鑒定Omp31基因在真核細(xì)胞COS-7中的表達(dá)情況。具體檢測結(jié)果如圖9所示。根據(jù)圖9可知，Omp31基因可以在真核哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中高表達(dá)。

實(shí)施例4

Omp31蛋白分子抗原表位預(yù)測結(jié)果

1、蛋白分子的理化性質(zhì)

利用生物學(xué)軟件DNAstar和ExPASy服務(wù)器的ProtParam分析羊種3型布魯氏菌外膜蛋白Omp31分子的理化性質(zhì)，結(jié)果如表2所示。

表2外膜蛋白分子的理化性質(zhì)結(jié)果

2、蛋白分子的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)

通過NPS@IBCP服務(wù)器的SOPMA和DNAstar軟件預(yù)測Omp31分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測結(jié)果如圖10所示。根據(jù)圖10可見，Omp31分子ɑ–螺旋占14.54％，β–轉(zhuǎn)角占13.22％，無規(guī)卷曲占36.12％，延伸鏈占36.12％。

通過同源建模服務(wù)器SWISS-MODEL建立Omp31蛋白分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)。Omp31三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖11所示。

3、蛋白分子表面的可能性

利用DNAstar的Emini法分析Omp31蛋白分子表面的可能性，預(yù)測結(jié)果如圖12所示。結(jié)果顯示：Omp31分子的氨基酸殘基的46aa～53aa，107aa～112aa，126aa～129aa，160aa～165aa，181aa～197aa區(qū)段，它們分布在分子表面的可能性較大，因此成為分子的抗原表位的可能性也較大。

4、蛋白分子的親水性

利用DNAstar的Hydropathy-Kyte-Doolittle法分析Omp31蛋白分子的親水性，分析結(jié)果如圖13所示。根據(jù)圖13可見：上述蛋白分子的親水性區(qū)分布均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于疏水區(qū)，從而有利于蛋白的表達(dá)。Omp31蛋白分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)中34aa～57aa，71aa～79aa，86aa～93aa，104aa～129aa，149aa～167aa，176aa～228aa區(qū)段為高親水區(qū)；這些區(qū)域暴露于分子表面的幾率較大，成為分子的抗原表位的可能性也最大。

5、蛋白分子多肽鏈骨架區(qū)的柔韌性

利用DNAstar的Karplus-Schulz法預(yù)測Omp31蛋白質(zhì)分子多肽鏈骨架區(qū)的柔韌性，分析結(jié)果如圖14所示。圖14所示結(jié)果表明：Omp31分子的8aa～26aa，36aa～63aa，79aa～112aa，127aa～166aa，183aa～211aa區(qū)段，它們在空間發(fā)生扭曲、折疊的幾率高，能夠形成豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)。所以蛋白分子的這些肽段形成分子抗原表位的可能性較大。

6、蛋白分子抗原指數(shù)分析

利用DNAStar的Antigenic Index-Jameson-Wolf法進(jìn)行Omp31蛋白分子抗原指數(shù)分析，分析結(jié)果如圖15所示。圖15所示結(jié)果顯示：它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列中抗原指數(shù)顯著的區(qū)段為Omp31的34aa～57aa，71aa～79aa，86aa～93aa，104aa～129aa，149aa～167aa，176aa～228aa區(qū)段。上述區(qū)段形成分子的抗原表位的可能性十分大，也是研究相應(yīng)蛋白分子的抗原決定簇的主要對象。

7、蛋白分子B細(xì)胞抗原表位分析

利用CBS Prediction Servers中的BepiPred預(yù)測Omp31蛋白分子的B細(xì)胞抗原表位，整理后將臨界值大于0.5的輸出，可見Omp31蛋白含有9個(gè)潛在的的抗原表位，預(yù)測最高的區(qū)域位于7aa～23aa區(qū)段。分析結(jié)果如表3所示。

表3 Omp31蛋白分子B細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果

本試驗(yàn)擴(kuò)增外膜蛋白Omp31分子基因序列，測序后，用DNAMAN軟件對其與一些存在交叉反應(yīng)的革蘭氏陰性細(xì)菌的同源性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)羊種布魯氏桿菌3型的外膜蛋白Omp31與小腸耶爾森氏菌腸等可能與布魯氏桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)的細(xì)菌序無同源性，從而避免與其它革蘭氏陰性細(xì)菌的交叉反應(yīng)。

大部分抗體只與蛋白質(zhì)表面的部分結(jié)合，且大部分抗原決定簇是親水性的，另許多已知的抗原決定簇是在自由活動(dòng)區(qū)域，因此通對布魯氏桿菌外膜蛋白Omp31分子表面可能性、親水性、柔韌性、抗原指數(shù)和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行綜合分析：親水性最強(qiáng)的部位被認(rèn)為是和單抗結(jié)合的部位，有利于和抗體結(jié)合。根據(jù)圖示Omp31分子預(yù)測其抗原表位可能位于6個(gè)最親水的部位。這些區(qū)域暴露于分子表面的幾率較大，成為分子的抗原表位的可能性也最大，抗原以此與相應(yīng)淋巴細(xì)胞的抗原受體結(jié)合而激活淋巴細(xì)胞引起免疫應(yīng)答。

抗體通常特異性地識(shí)別抗原蛋白質(zhì)表面的特定區(qū)域，這些區(qū)域被稱為B細(xì)胞表位。從空間結(jié)構(gòu)上看，B細(xì)胞表位的不連續(xù)性的空間構(gòu)象性表位，是由那些在空間結(jié)構(gòu)上接近，但順序上不連續(xù)的氨基酸組成，具有高度的空間依賴性，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的表位分布有較大的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)Omp31蛋白表位富含環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而缺失螺旋和折疊結(jié)構(gòu)。因?yàn)榄h(huán)狀結(jié)構(gòu)要比其他形式的二級(jí)結(jié)構(gòu)靈活，利于抗體的結(jié)合。

實(shí)施例5

布魯氏菌Omp31DNA疫苗的免疫學(xué)特性研究

分別采用實(shí)施例3獲得的DNA疫苗，即Omp31-pVAX1真核表達(dá)載體(Omp31組)、傳統(tǒng)M5減毒疫苗(M5組)和生理鹽水(生理鹽水組)免疫小鼠并通過淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTS)、CTL細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)和ELISA方法研究Omp31組、M5組和生理鹽水組的免疫學(xué)特性。

1、淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTS)

采用本領(lǐng)域常規(guī)的淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTS)檢測Omp31組、M5組和生理鹽水組免疫小鼠的淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)，檢測結(jié)果如圖16所示。從圖16中可以看出，Omp31組經(jīng)刺激后，平均刺激指數(shù)為1.61，明顯高于M5組(1.46，P＜0.05)和生理鹽水組(0.92，P＜0.05)。

2、CTL細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)

采用Promega公司的CytoToxNonRadioactive Cytotoxicity Assay進(jìn)行CTL細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)(具體方法參考其說明書)，檢測結(jié)果用殺傷活性表示，計(jì)算公式如下：

CTL細(xì)胞殺死實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果如圖17所示。從圖17可以看出，Omp31組在不同的效靶比均可誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性殺傷作用，且CTL效應(yīng)隨著效靶比值的升高而增強(qiáng)；Omp31組在相同效靶比下，其CTL效應(yīng)值高于M5組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本發(fā)明DNA疫苗抗原不但能夠誘導(dǎo)特異性淋巴細(xì)胞增殖作用同時(shí)還能夠增強(qiáng)誘導(dǎo)的非特異性淋巴細(xì)胞增殖作用，能夠明顯地特異性地刺激淋巴細(xì)胞增殖，并且本發(fā)明所述DNA疫苗具有比傳統(tǒng)M5減毒疫苗更強(qiáng)的CTL細(xì)胞殺傷作用。

3、ELISA法檢測免疫鼠血清抗體效價(jià)

采用間接ELISA方法檢測免疫小鼠的多克隆抗體效價(jià)，將免疫后第2、3、4、5、6、7、8周的小鼠斷尾采血，分離血清用保溫液進(jìn)行倍比稀釋，間接檢測血清效價(jià)，檢測結(jié)果如圖18所示。圖18所示結(jié)果表明，在用DNA疫苗免疫小鼠后，血清效價(jià)從第一周開始開始上升，直到免疫后第4周達(dá)到最高峰，血清效價(jià)最高達(dá)到1:1560000，免疫效價(jià)持續(xù)到免疫后第7周，第八周開始逐漸下降。本發(fā)明所述DNA疫苗的抗體效價(jià)水平與抗體持續(xù)時(shí)間與M5減毒疫苗基本相當(dāng)。

實(shí)施例6

DNA疫苗與佐劑的配合試驗(yàn)

將實(shí)施例3所獲得的DNA疫苗與不同類型、不同用量的佐劑配合使用，免疫小鼠，進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，檢測其免疫效力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4-6所述。

表4淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

其中，PI代表淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)，1代表實(shí)施例3所制備的DNA疫苗，IL2、IL12、IFNγ、GM-CSF為細(xì)胞因子基因佐劑，ISCOMs代表免疫刺激復(fù)合物。

根據(jù)表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，DNA疫苗與佐劑配合使用可以有效增強(qiáng)其免疫效力。其中，DNA疫苗與細(xì)胞因子基因佐劑，特別是IL2和IL 12細(xì)胞因子基因佐劑配合使用，能夠特別有效地增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效力。

表5淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PI代表淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)，1代表實(shí)施例3所制備的DNA疫苗，IL2為細(xì)胞因子基因佐劑，表5中所列比值為質(zhì)量比。

表6淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PI代表淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)，1代表實(shí)施例3所制備的DNA疫苗，IL12為細(xì)胞因子基因佐劑，表6中所列比值為質(zhì)量比。

根據(jù)表5-6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，DNA疫苗與IL 2、IL12細(xì)胞因子基因佐劑之間的質(zhì)量比在1：1-5之間能夠較好地提高免疫效果。

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 青海大學(xué)

<120> 一種針對羊種3型布魯氏菌的DNA疫苗及其制備方法

<130> 11111

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatgacacca tatggccgac gtggttgttt ctgaac 36

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacacctcga gttagaactt gtagttcaga ccgac 35

<210> 3

<211> 666

<212> DNA

<213> Brucella melitensis

<400> 3

gccgacgtgg ttgtttctga accttccgcc cctactgctg ctcctgttga caccttctcg 60

tggaccggcg gctatatcgg tatcaacgcc ggttacgcag gcggcaagtt caagcatcca 120

ttttctagct ttgacaagga agacaacgaa caggtttccg gttcgctcga cgtaacagct 180

ggcggcttcg tcggtggtgt tcaggccggt tacaactggc agctcgacaa cggcgtcgtg 240

ctcggcgcgg aaaccgactt ccagggatcg agcgttacgg gttcgattta cgccggtgcc 300

agcggtctcg aaggcaaagc tgaaaccaag gtcgagtggt tcggcacagt tcgtgcccgt 360

cttggctaca cggctaccga acgcctcatg gtttatggta ccggcggtct ggcctatggt 420

aaggtcaagt ctgcgttcaa cctgggtgat gatgcaagtg ccctgcacac gtggtccgac 480

aagacgaaag ctggctggac cctcggcgct ggtgctgaat atgccatcaa caacaactgg 540

acgctcaagt cggaatacct ctacaccgac ctcggcaagc gcaacctcgt cgacgttgac 600

aatagcttcc ttgagagcaa ggtcaatttc cacactgttc gcgtcggtct gaactacaag 660

ttctaa 666

<210> 4

<211> 221

<212> PRT

<213> Brucella melitensis

<400> 4

Ala Asp Val Val Val Ser Glu Pro Ser Ala Pro Thr Ala Ala Pro Val

1 5 10 15

Asp Thr Phe Ser Trp Thr Gly Gly Tyr Ile Gly Ile Asn Ala Gly Tyr

20 25 30

Ala Gly Gly Lys Phe Lys His Pro Phe Ser Ser Phe Asp Lys Glu Asp

35 40 45

Asn Glu Gln Val Ser Gly Ser Leu Asp Val Thr Ala Gly Gly Phe Val

50 55 60

Gly Gly Val Gln Ala Gly Tyr Asn Trp Gln Leu Asp Asn Gly Val Val

65 70 75 80

Leu Gly Ala Glu Thr Asp Phe Gln Gly Ser Ser Val Thr Gly Ser Ile

85 90 95

Ser Ala Gly Ala Ser Gly Leu Glu Gly Lys Ala Glu Thr Lys Val Glu

100 105 110

Trp Phe Gly Thr Val Arg Ala Arg Leu Gly Tyr Thr Ala Thr Glu Arg

115 120 125

Leu Met Val Tyr Gly Thr Gly Gly Leu Ala Tyr Gly Lys Val Lys Ser

130 135 140

Ala Phe Asn Leu Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu His Thr Trp Ser Asp

145 150 155 160

Lys Thr Lys Ala Gly Trp Thr Leu Gly Ala Gly Ala Glu Tyr Ala Ile

165 170 175

Asn Asn Asn Trp Thr Leu Lys Ser Glu Tyr Leu Tyr Thr Asp Leu Gly

180 185 190

Lys Arg Asn Leu Val Asp Val Asp Asn Ser Phe Leu Glu Ser Lys Val

195 200 205

Asn Phe His Thr Val Arg Val Gly Leu Asn Tyr Lys Phe

210 215 220