專利名稱：新的抗腫瘤藥物,其篩選方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)。更具體地說，涉及以ErbB酶，尤其是ErbB2/ErbB3異源二聚體作為作用靶抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，篩選抗腫瘤藥物的方法，以及由此得到的抗腫瘤藥物。
腫瘤癥是一種致人類死亡的主要疾病。它起因于生理失控的細(xì)胞增殖影響了人體的正常生理?xiàng)l件，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的病理反應(yīng)，經(jīng)常導(dǎo)致死亡。雖然在腫瘤癥研究與處理方面花費(fèi)了極大的努力，目前腫瘤癥仍然是人類死亡的主要原因。有多種處理腫瘤癥的方法，包括手術(shù)、放療、與化療。手術(shù)與放療不能完全地驅(qū)除病人體中的腫瘤細(xì)胞，化療單獨(dú)或與其他方法結(jié)合被普遍用于控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。病人體中的抗腫瘤化合物通常的目標(biāo)是防止腫瘤細(xì)胞增殖或殺死分裂細(xì)胞。當(dāng)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性時(shí)，它們通常也嚴(yán)重地影響那些對(duì)人生命必需的正常分裂細(xì)胞。因此，在對(duì)腫瘤癥研究中的一個(gè)主要方向就是尋找一個(gè)能專一阻斷或殺死腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞增殖的方法。當(dāng)前非常需要這樣一種處理腫瘤癥病人的方法。
ErbBS是一類受體蛋白酪氨酸激酶，ErbB介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)在胚胎發(fā)育或成體的心臟功能中起著重要作用。在細(xì)胞水平上，ErbB受體介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、遷移及細(xì)胞結(jié)構(gòu)重排的信號(hào)(Gassmann和Lemke，1997；Tzahar和Yarden，1988)，有四種結(jié)構(gòu)類似的ErbB成員ErbB-1、ErbB2、ErbB3和ErbB-4。EGF是能識(shí)別并結(jié)合ErbB1的配體之一。ErbB3和ErbB4也能被幾個(gè)陪體識(shí)別，其中包括Neuregulin-1(NRG-1)。至今，還沒有發(fā)現(xiàn)ErbB2的配體。然而，ErbB2能與ErbB3或ErbB-4形成異源二聚體，這種異源二聚體的形成對(duì)NRG-1的細(xì)胞信號(hào)作用是決定性的。
用基因定位實(shí)驗(yàn)作的體內(nèi)研究等的發(fā)現(xiàn)證明，ErbB2、ErbB3和ErbB-4都在NRG-1激活的信號(hào)鏈中(Meyer和Birchmeier，1996；Gassmann等，1996；Lee等，1996；Erickson等，1997)。
除了在發(fā)育中的角色外，人的ErbB2經(jīng)常在不同類型的人腺瘤中被擴(kuò)增并超表達(dá)。ErbB2一直被認(rèn)為作為異源二聚體的一部分起作用。并且這個(gè)過程起始于NRG-1與ErbB3或ErbB4的結(jié)合。這個(gè)配體被認(rèn)為有兩個(gè)完全獨(dú)立的受體結(jié)合點(diǎn)一個(gè)對(duì)ErbB3或ErbB-4有高親和力，另一個(gè)對(duì)所有ErbB成員都有較小但非選擇性的親和力。這樣，當(dāng)NRG-1存在時(shí)，細(xì)胞表面的ErbB3或ErbB4就與ErbB2形成異源二聚體。ErbB3比較特殊因?yàn)?)ErbB3較易與ErbB2形成異源二聚體；2)當(dāng)ErbB2和ErbB3同時(shí)轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)，能獲得較高的轉(zhuǎn)化率；3)ErbB3在腫瘤細(xì)胞中，常伴隨著ErbB2的表達(dá)而表達(dá)；4)在ErbB2轉(zhuǎn)基因鼠中，ErbB3也超表達(dá)。
本發(fā)明的發(fā)明人系統(tǒng)研究了ErbB成員及它們之間的作用，揭示了異源二聚體的形成機(jī)制，以及它們?cè)谀[瘤細(xì)胞繁殖中的作用，及其潛在的用途。
本發(fā)明的目的在于提供一種更強(qiáng)、更專一地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種篩選抗腫瘤藥物的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種抗腫瘤藥物，它能夠更強(qiáng)、更專一地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
本申請(qǐng)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)ErbB2在細(xì)胞中的表達(dá)不能促進(jìn)細(xì)胞的繁殖，反而會(huì)抑制腫瘤基因ras介導(dǎo)的細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，ErbB2/ErbB3能形成不依賴于配體NRG-1的異源二聚體，這種二聚體能刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。特別是，發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)了ErbB3在腫瘤形成中的作用?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人設(shè)想了以下技術(shù)方案以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
本發(fā)明提供一種篩選抗腫瘤藥物的方法。即用共表達(dá)ErbB2和ErbB3的細(xì)胞與候選化合物相互作用。所述的細(xì)胞可以是，例如用ErbB2和ErbB3表達(dá)載體永久性共轉(zhuǎn)染的并已向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的NIH3T3細(xì)胞，人腫瘤細(xì)胞是BT-474或SK-BR-3人乳腺癌細(xì)胞。而未被轉(zhuǎn)染的和ErbB2單獨(dú)轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞，或MCF-7細(xì)胞則被用來做陰性對(duì)照。篩選對(duì)象為各種可能的有機(jī)或無機(jī)分子。通常應(yīng)為水溶或脂溶性分子。溶劑可為生理鹽水、PBS、水等。脂溶性分子可先溶于100％酒精或DMSO，而后再溶于細(xì)胞培養(yǎng)液中。通常當(dāng)酒精或DMSO加到細(xì)胞培養(yǎng)液中處理細(xì)胞時(shí)，其稀釋度為1∶1000以上。并以ErbB2/3異源二聚體的存在情況和/或細(xì)胞生長(zhǎng)和分化情況作為篩選抗癌藥物的指標(biāo)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)任何藥物能抑制ErbB2、ErbB3共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)，而不能抑制非轉(zhuǎn)染的或ErbB2單轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞，這些藥物將會(huì)被當(dāng)作和ErbB2/3異源二聚體相互作用的侯選者。還可以進(jìn)一步將這些藥物與ErbB2/3異源二聚體的直接作用，并用本申請(qǐng)前述的免疫共沉淀或共價(jià)偶聯(lián)的方法進(jìn)行檢測(cè)，從而加以驗(yàn)證。在一個(gè)典型的例子中，所篩選的對(duì)象為抗ErbB3的抗體。在另一種例子中，所篩選對(duì)象為各種可能的對(duì)ErbB3有親和力的分子。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明篩選方法得到的抗腫瘤藥物。在一典型例中，所述的抗腫瘤藥物是ErbB3拮抗劑，尤其是ErbB3抗體。另一典型例中，所述抗腫瘤藥物還包含ErbB2抗體。出人意料的是，當(dāng)兩種抗體聯(lián)用時(shí)，不僅沒有發(fā)生拮抗效應(yīng)，反而獲得了理想的疊加或協(xié)同效應(yīng)。較典型例的是，所述ErbB3抗體是市售的H3.105.5，所述ErbB2抗體是市售N12(購(gòu)自NEO MARKER公司)。
本發(fā)明提供一種抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，它包括抑制ErbB2/ErbB3異源二聚體的形成。實(shí)現(xiàn)所述抑制的方式之一是用有效量的ErbB2/ErbB3異源二聚體拮抗劑處理細(xì)胞。所述拮抗劑選自與ErbB2或ErbB3有親和力的分子，它們能夠阻斷、干擾或改變ErbB2/ErbB3異源二聚體的形成或結(jié)構(gòu)，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。所述拮抗劑例如抗體，抗體片段。其中較典型的是，所述拮抗劑是抗ErbB3胞外蛋白區(qū)域的抗體或抗ErbB2胞外蛋白區(qū)域的抗體。本發(fā)明的特殊之處在于，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)ErbB3抗體通過抑制ErbB2/ErbB3異源二聚體的形成而具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。所述有效量取決于靶細(xì)胞，所用拮抗劑等多種因素，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員通過常規(guī)試驗(yàn)即可確定該量。
本發(fā)明所述的腫瘤細(xì)胞可以是人的乳腺癌細(xì)胞。
過去一直認(rèn)為ErbB2單獨(dú)高表達(dá)就能致癌。但本發(fā)明證實(shí)，ErbB2單獨(dú)沒有刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，而ErbB2與ErbB3以非配體依賴方式形成異源二聚體，這種異源二聚體與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)。由此，發(fā)明人得出一種新的抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。特別是，本發(fā)明首次ErbB3是除ErbB2之外新的腫瘤抑制靶分子。由此，得出了一系列新的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，和新的抗癌藥物篩選方法。
用于研究的抗ErbB3抗體(H3.105.5)過去已查出對(duì)表達(dá)ErbB3的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)沒有影響(NeoMarks Catalogue，1999)。不同于過去的研究，我們測(cè)試了5個(gè)人乳腺腫瘤細(xì)胞株MCF-7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-453和BT474。后兩個(gè)細(xì)胞株的細(xì)胞與ErbB3抗體單獨(dú)作用時(shí)，生長(zhǎng)速度被抑制。有趣的是，SK-BR-3細(xì)胞與ErbB3抗體單獨(dú)作用并不顯著，而顯示出對(duì)ErbB2和ErbB3抗體結(jié)合物比對(duì)ErbB2抗體大2.5倍的反應(yīng)性。當(dāng)二種抗體同時(shí)使用時(shí)，抗ErbB2抗體能夠減少至少五倍，但仍能獲得抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，其作用值和單獨(dú)使用抗ErbB2抗體的最大作用值相當(dāng)，并且因ErbB2表達(dá)在心肌細(xì)胞中，抗ErbB2抗體應(yīng)用在病人中造成28％病人發(fā)生心衰。而ErbB3在心肌中并無表達(dá)，因此抗ErbB3抗體的使用或和抗ErbB2抗體的結(jié)合使用，使得抗ErbB2抗體的使用量減少，都能減少腫瘤病人中產(chǎn)生心衰的副作用。


圖1無配體NRG-1時(shí)，ErbB2、ERB3單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染NIH 3T3后免疫沉淀的Western印跡。圖中，轉(zhuǎn)染2表示ErbB2表達(dá)質(zhì)粒pRC/CMV-ErbB2編碼全長(zhǎng)人ErbB2 cDNA單獨(dú)轉(zhuǎn)染，3表示ErbB3表達(dá)質(zhì)粒pCMVneo-HER3單獨(dú)轉(zhuǎn)染，2/3表示pRC/CMV-ErbB2與pCMVneo-HER3共轉(zhuǎn)染，2+3表示上述單獨(dú)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞裂解液的混合物；NRG-1“-”表示NRG-1不存在，“+”表示存在；免疫沉淀2表示用ErbB2抗體(NCL-CB11)沉淀，3表示用ErbB3抗體(NCL-PC11)沉淀；上行是用抗磷酸酪氨酸抗體(抗PTry)(重組RC20HRPO，購(gòu)自Transduction Laboratories)進(jìn)行的Western印跡；中行是用ErbB2抗體(NCL-CB11)進(jìn)行的Western印跡；下行是用ErbB3抗體(NCL-PC11)進(jìn)行的Western印跡。
圖2用共價(jià)偶聯(lián)法檢測(cè)同源二聚體或異源二聚體的Western印跡。圖中，共價(jià)偶聯(lián)“+”表示進(jìn)行了共價(jià)偶聯(lián)，“-”表示沒有進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。
圖3檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)ErbB2與ErbB3以非配體依賴性方式形成異源二聚體的Western印跡。
圖4a)檢測(cè)ErbB2/ErbB3共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞中非配體依賴性的ErbB2/ErbB3異源二聚體與信號(hào)分子Shc結(jié)合的Western印跡；b)ErbB2/ErbB3共表達(dá)的NIH3T3腫瘤細(xì)胞中非配體依賴性的ErbB2/ErbB3異源二聚體與信號(hào)分子She結(jié)合的Western印跡?？?SHC表示用抗-Shc(C20)進(jìn)行的的Western印跡。
圖5a)小鼠普通多抗IgG和ErbB3抗體H3.105.5抑制非貼壁培養(yǎng)BT-474人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的顯微鏡檢比較。b)小鼠普通多抗IgG和ErbB3抗體H3.105.5抑制貼壁培養(yǎng)BT-474人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的量效曲線比較。其中，橫坐標(biāo)表示抗體濃度，縱坐標(biāo)為抑制百分比。
圖6沒有配體NRG-1條件下，抗ErbB2抗體和抗ErbB3抗體單用和聯(lián)用對(duì)人乳腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。橫坐標(biāo)為所用的抗體IgG表示小鼠普通多抗IgG(5μg/ml)，ErbB2表示抗ErbB2抗體N12單用，ErbB3表示ErbB3抗體H3.105.5單用(5μg/ml)，ErbB2/3表示N12與H3.105.5聯(lián)用(兩種抗體的濃度都是2.5μg/ml)?？v坐標(biāo)為495nm處的吸光度。直方柱上方的是相對(duì)小鼠普通多抗IgG的抑制百分比，并顯示誤差線。
圖7抗ErbB2抗體和抗ErbB3抗體聯(lián)用對(duì)人乳腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。橫坐標(biāo)表示所用抗體，抗ErbB2抗體是N12(50ng/ml)；抗ErbB3抗體是H3.105.5(2.5μg/ml)?？v坐標(biāo)為細(xì)胞生長(zhǎng)指標(biāo)(495nm處的吸光度)。
實(shí)施例材料NIH 3T3細(xì)胞及乳房腫瘤細(xì)胞株SK-BR-3，MDA-MB-453和BT-474購(gòu)自AmericanType Culture Collection。LipofectAMINETM轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Life Technologies，Inc.。ErbB2表達(dá)質(zhì)粒pRC/CMV-ErbB2編碼全長(zhǎng)人ErbB2 cDNA，ErbB3表達(dá)質(zhì)粒pCMVneo-HER3編碼全長(zhǎng)人ErbB3 cDNA，來自Drs Rodney Fiddes與Roger Daly(The Garvan Institute ofMedical Research，Darlinghurst，NSW 2010，Australia)。NRG1和用于抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的ErbB2抗體N12和ErbB3抗體H3.105.5購(gòu)自NEO MARKER公司。聯(lián)結(jié)試劑BS3從PIERCE Chemical Company獲得。用于免疫沉淀和Western印跡試驗(yàn)的抗ErbB2的抗體(NCL-CB11)購(gòu)自Novocastra Laboratories Ltd.?？?ErbB3(NCL-PC11)購(gòu)自Santa CruzBiotechnology。抗-Shc抗體(C-20)購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology，抗-磷酸化酪氨酸(重組RC20HRPO)購(gòu)自Transduction Laboratories。用于細(xì)胞裂解和免疫沉淀的完全的蛋白酶抑制劑購(gòu)自Boehringer Mannheim。辣根過氧化酶-鏊合的第二抗體與加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑(ECL)劑購(gòu)自NEN Life Science Products。ErbB2與ErbB3以非配體依賴性方式形成異源二聚體為了研究在沒有配體NRG-1的條件下，ErbB2與ErbB3的相互作用，發(fā)明人用ErbB2低表達(dá)且不表達(dá)ErbB3的NIH3細(xì)胞(購(gòu)自American Type Culture Collection)進(jìn)行ErbB2和/或ErbB3的短暫表達(dá)。
NIH 3T3細(xì)胞37℃，5％CO2條件下維持在Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(添加10％小牛血清(FBS)及選擇抗生素(100μg/ml青霉素和鏈霉素))中。參照說明用LipofectAMINETM試劑(購(gòu)自Life Technologies，Inc.)將ErbB2表達(dá)質(zhì)粒pRC/CMV-ErbB2與ErbB3表達(dá)質(zhì)粒pCMVneo-HER3分別或共轉(zhuǎn)染NIH 3T3。為了避免血清中可能存在的NRG-1活性，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后被培養(yǎng)在在無血清DMEM培養(yǎng)基中24小時(shí)，而后取一份共轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣品在添加0.1％FBS的DMEM中保持饑餓18小時(shí)，然后用10-9M NRG-1(購(gòu)自NEO MARKER公司)處理10分鐘。
收獲全部轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(1-2×106)用冷PBS洗滌并溶解在1ml冰裂解緩沖液里(50mMTris[pH7.4]，5mM EGTA，150mM NaCl，1％Triton X-100，2mM原釩酸鈉，50mM氟化鈉，2mM苯基甲基磺酰氟，混合蛋白酶抑制片)。細(xì)胞溶解物用抗ErbB2抗體(NCL-CB11)或ErbB3抗體(NCL-PC11)在4℃孵化60分鐘。免疫復(fù)合物用蛋白A或蛋白GSepharose收集并用裂解緩沖液洗滌四次。
然后進(jìn)行免疫沉淀的Western印跡試驗(yàn)。免疫沉淀的蛋白用煮沸的加樣緩沖液溶解并做SDS-PAGE(6％)電泳。蛋白用電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含5％脫脂牛奶的PBS加0.02％Tween 20在4℃過夜阻斷后，膜在室溫下用特異性第一抗體(NCL-CB11、NCL-PC11或重組RC20HRPO)探測(cè)60分鐘。蛋白通過用一種加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑(NEN LifeScience Products)與辣根過氧化酶連接的第二抗體顯現(xiàn)。
結(jié)果如圖1所示。圖1中行第3列，抗ErbB3抗體制備的沉淀中有ErbB2抗原活性。這并非抗體交叉反應(yīng)，因?yàn)橹行械?列顯示抗ErbB3抗體不能沉淀ErbB2，或者，如底行列1所示，不能結(jié)合ErbB2。同理，抗ErbB2抗體也不能結(jié)合ErbB3(中行列2和列5)。
為了證明ErbB2和ErbB3的復(fù)合物是異源二聚體，對(duì)單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在無血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)。對(duì)照細(xì)胞先用含50nMNRG-1(Neo Markers)的無血清DMEM培養(yǎng)基處理10分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞三次，然后在室溫下用交連劑BS3在2mM/PBS，(PIERCE)中處理30分鐘，然后加10mM，pH7.5的Tris，0.9％NaCl及0.1賴氨酸溶液室溫下終止反應(yīng)15分鐘。然后如上所述進(jìn)行收獲、裂解、免疫沉淀。免疫沉淀經(jīng)4％SDS-PAGE電泳后進(jìn)行Western印跡試驗(yàn)。
圖2上行列1顯示，rbB-2超表達(dá)形成了同源二聚體。如預(yù)期，180KDa帶代表單體，360KDa帶代表二聚體。同源二聚體的形成并不依賴配體。圖2列5顯示，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中也測(cè)到了360Kda的二聚體帶。因?yàn)樵摰鞍资怯每笶rbB3抗體沉淀得到，卻在Western印跡中與ErbB2結(jié)合，所以是異源二聚體。列1和2顯示，抗ErbB3抗體不能結(jié)合ErbB2同源二聚體。列3和4顯示，不論有否NRG-1存在，ErbB3都僅形成有限的同源二聚體。這些也證明了不依賴于配體的ErbB2/ErbB3異源二聚體的存在。如列7和列8所示，不經(jīng)過共價(jià)交連劑處理，在此試驗(yàn)中，因SDS的作用，異源二聚體是測(cè)不到的。在非配體依賴性的ErbB2/ErbB3異源二聚體中，ErbB3的酪氨酸殘基被磷酸化圖1中，比較列3與列4可見，配體NRG-1的存在增強(qiáng)ErbB2/ErbB3異源二聚體的形成。上行，列3和列4所示，在ErbB2/ErbB3共表達(dá)的細(xì)胞中，兩種蛋白的酪氨酸的殘基都已被磷酸化。由于ErbB3的酪氨酸激酶活性缺失，因此，ErbB3應(yīng)該被ErbB2磷酸化。腫瘤細(xì)胞內(nèi)ErbB2與ErbB3以非配體依賴性方式形成異源二聚體為了測(cè)試在ErbB2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中是否也存在上述不依賴配體的二聚體形成，用人乳腺腫瘤細(xì)胞株SK-BR-3、MDA-MB-453和BT474取代NIH3T3細(xì)胞，先在無血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，然后分別如前所述進(jìn)行免疫沉淀和Western印跡試驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示，與圖1中的列3與列4相似，腫瘤細(xì)胞中有非配體依賴的ErbB2/ErbB3異源二聚體形成，配體NRG-1的存在則顯著增強(qiáng)異源二聚體的形成。非配體依賴性的ErbB2/ErbB3異源二聚體與信號(hào)分子Shc結(jié)合已知配體依賴性的ErbB2/ErbB3異源二聚體已知與細(xì)胞信號(hào)分子Shc結(jié)合，發(fā)明人檢測(cè)了非配體依賴的ErbB2/ErbB3異源二聚體是否也與Shc結(jié)合。如前所述轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，在無血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)后，如前所述收獲、裂解和免疫沉淀，并用抗ErbB3抗體和抗Shc抗體進(jìn)行Western印跡試驗(yàn)。
結(jié)果見圖4，圖4a列1下行顯示，52kDa的Shc亞種不結(jié)合Erb3同源二聚體，此圖中，46kDa的Shc亞種因被一種非特異蛋白遮蓋而不能測(cè)得；圖4a列2和列3顯示，不論NRG1是否存在，Shc都與ErbB2/ErbB3異源二聚體結(jié)合。圖4b顯示，在ErbB2/ErbB3共表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，Shc也與ErbB3相互作用，而且這種作用不依賴于配體。通過抑制ErbB2/ErbB3異源二聚體來抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)以ErbB3為靶分子抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)用抗ErbB3抗體處理ErbB2/ErbB3高表達(dá)的BT474人乳腺癌細(xì)胞。所用抗體為H3.105.5(購(gòu)自NEO MARKER公司)，該抗體從未被報(bào)道有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。對(duì)照使用的是小鼠普通多抗IgG)(購(gòu)自Sigma)。分別在軟瓊脂中進(jìn)行了非貼壁生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)。
在非貼壁生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中，具體過程按5×104/ml的密度將BT474人乳腺癌細(xì)胞接種到含4％軟瓊脂DMEM培養(yǎng)基中。37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24hr。在試驗(yàn)和對(duì)照樣品中分別加入5μg/ml的H3.105.5和小鼠普通多抗。再培養(yǎng)30天。然后進(jìn)行顯微鏡檢。用細(xì)胞增殖試劑盒(Cell Titre Aqueous Promega)。結(jié)果如圖5a所示抗體處理后30天，以小鼠普通多抗IgG處理的細(xì)胞已長(zhǎng)成非常明顯的細(xì)胞團(tuán)；而以H3.105.5處理的細(xì)胞，其生長(zhǎng)被顯著抑制。
在貼壁生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中，以3000-5000細(xì)胞/孔的密度將BT474人乳腺癌細(xì)胞接種到含10％PBS的DMEM培養(yǎng)基的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)16hr，使之貼壁。在試驗(yàn)和對(duì)照樣品中分別加入1-5μg/ml的H3.105.5和小鼠普通多抗IgG，繼續(xù)培養(yǎng)5-14天。然后按說明書，用Promega公司的Cell Titre Aqueous計(jì)點(diǎn)對(duì)應(yīng)各濃度的細(xì)胞數(shù)，并繪制曲線。結(jié)果如圖5b所示H3.105.5對(duì)貼壁生長(zhǎng)的BT474人乳腺癌細(xì)胞也有明顯的抑制作用，而且呈現(xiàn)正相關(guān)的劑量依賴性。
由此可見，以ErbB 3為靶分子能夠通過抑制ErbB2/ErbB3異源二聚體的形成而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。聯(lián)合使用ErbB2和ErbB3抗體對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果發(fā)明人還試驗(yàn)了聯(lián)合使用ErbB2和ErbB3抗體對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。所用的腫瘤細(xì)胞為BT474、SK-BR-3和MDA-MB-453。如前所述以2000細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種在含10％PBS的DMEM培養(yǎng)基的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)約16小時(shí)至貼壁，加入抗體小鼠普通多抗IgG5μg/ml，ErbB3抗體H3.105.55μg/ml，ErbB2抗體N12(購(gòu)自NEO MARKER公司)5μg/ml，兩抗體各2.5μg/ml，相同條件下培養(yǎng)培養(yǎng)14天。期間，每48小時(shí)換以含抗體的新鮮培養(yǎng)基。用非特異性的細(xì)胞增殖試劑盒(Promega)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果如圖6所示，兩種抗體的聯(lián)用對(duì)所試的3種細(xì)胞都有明顯的抑制作用。其中，抗體聯(lián)用對(duì)BT474和MDA-MB-453具有抑制生長(zhǎng)的疊加效應(yīng)；對(duì)SK-BR-3則具有抑制生長(zhǎng)的協(xié)同作用。
基于以上結(jié)果，發(fā)明人設(shè)想如果ErbB2抗體與ErbB3抗體聯(lián)用具有協(xié)同效應(yīng)。則當(dāng)ErbB2抗體的濃度低至細(xì)胞對(duì)次濃度不敏感時(shí)，雙抗體的疊加或協(xié)同效應(yīng)仍可能顯現(xiàn)出明顯的總體抑制作用。為此，發(fā)明人用SK-BR-3人腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了如前所述的貼壁培養(yǎng)、抗體處理和檢測(cè)。所不同的是，聯(lián)用的是50ng/ml ErbB2抗體(N12)與2.5μg/ml的ErbB3抗體H3.105.5。結(jié)果如圖7所示細(xì)胞在單用試驗(yàn)濃度的兩種抗體時(shí)，抑制都不明顯，但在雙抗體聯(lián)用時(shí)則受到顯著抑制。這表明，因?yàn)镋rbB2/ErbB3異源二聚體的促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用，除了已知的ErbB2之外，ErbB3也可以用作已知腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的靶分子。在聯(lián)用針對(duì)兩者的抗體時(shí)可獲得促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的疊加或協(xié)同效應(yīng)。基于ErbB2/ErbB3異源二聚體的抗癌藥篩選方法基于以上試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)明人還提供了一種篩選抗癌藥物的新的方法，并確實(shí)獲得了一系列新的抗癌藥物。
對(duì)ErbB3抗體的篩選在此篩選系統(tǒng)中的所用材料為用ErbB2和ErbB3表達(dá)載體永久性共轉(zhuǎn)染的并已向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的NIH3T3細(xì)胞。而未被轉(zhuǎn)染的和ErbB2單獨(dú)轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞則被用來做陰性對(duì)照。所篩選的對(duì)象為抗ErbB3的抗體，各種不同的抗體可溶于PBS中，而后溶于培養(yǎng)基中用來處理培養(yǎng)中的細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為每孔4000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞被置于96孔板中先培養(yǎng)24小時(shí)，使之貼壁，而后加上所受篩選的藥物，或溶劑本身。如果某種ErbB3抗體能抑制ErbB2/3共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)而不能抑制ErbB2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，則這種抗體就有可能成為ERBB2/3異源二聚體的拮抗劑的候選者。
還可以進(jìn)一步將這些藥物與ErbB2/3異源二聚體的直接作用，可用本申請(qǐng)前述的免疫共沉淀或共價(jià)偶聯(lián)的方法來檢測(cè)。自然ErbB3抗體對(duì)ErbB3的親和性和專一性都可用常規(guī)的生化方法來鑒定。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ErbB3抗體H3.105.5可以作為抗癌藥物的活性成分。
對(duì)與ErbB3有親和力的分子的篩選要確定這些分子對(duì)ErbB3的親和性，我們可用生化的方法。比如用ErbB3蛋白做成的親和柱，任何ErbB3有親和力的分子都會(huì)結(jié)合到這種柱上而被檢測(cè)到。另一種方法是如果這種分子能被同位素標(biāo)記。這樣就能把這種標(biāo)記的分子直接和ErbB2轉(zhuǎn)染或ErbB2/3共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞結(jié)合。結(jié)合的強(qiáng)度用單位細(xì)胞的同位素放射量來測(cè)定。如果這種分子能結(jié)合ErbB2/3共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而不能結(jié)合ErbB2單轉(zhuǎn)染的細(xì)胞就說明這種分子具對(duì)ErbB3特異性的親和力。這些分子就能被用來做前述的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)。通常用上述系統(tǒng)篩選出的藥物還要用來做抑制人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。典型的和ErbB3有關(guān)的人腫瘤細(xì)胞是BT-474和SK-BR-3人乳腺癌細(xì)胞。作為陰性對(duì)照，MCF-7細(xì)胞也應(yīng)用來做抑制細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)。所做試驗(yàn)的方法和前述NIH3T3細(xì)胞試驗(yàn)完全一樣。
權(quán)利要求
1.一種篩選抗腫瘤藥物的方法，它包括用表達(dá)ErbB2和ErbB3的細(xì)胞與候選化合物相互作用；檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制；生長(zhǎng)抑制陽(yáng)性表明候選化合物是抗腫瘤藥物。
2.一種抗腫瘤藥物，它是用權(quán)利要求1所述方法篩選得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物，它包含有效量的抗ErbB2抗體和/或抗ErbB3抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其中的抗ErbB2抗體包括N12，所述抗ErbB3抗體包括H3.105.5。
5.一種抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，它是通過權(quán)利要求2所述藥物與ErbB2和/或ErbB3反應(yīng)來抑制ErbB2/ErbB3異源二聚體的形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其中所述的細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的細(xì)胞包括人類乳腺腫瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種篩選抗腫瘤藥物的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種抗腫瘤藥物,它能夠更強(qiáng)、更專一地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明的目的還在于提供一種更強(qiáng)、更專一地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1352391SQ0013777
公開日2002年6月5日 申請(qǐng)日期2000年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月27日
發(fā)明者周明東 申請(qǐng)人:周明東