專利名稱：使用多孔硅將物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方式以及微針陣列。
經(jīng)常會(huì)有許多時(shí)候需要將物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，例如出于基因操作的目的，常需要將核酸或核酸的構(gòu)建物如載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞。此外，化學(xué)制品也需要轉(zhuǎn)入細(xì)胞，如核苷酸或染料以及影響細(xì)胞生理的化學(xué)制品?，F(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)出相當(dāng)數(shù)量的化學(xué)及機(jī)械的方法將物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，這些技術(shù)包括1．直接注射將針插入細(xì)胞，物質(zhì)通過(guò)針被推入細(xì)胞；2．電穿孔法細(xì)胞膜通過(guò)高壓電擊使之變得對(duì)某些分子具有通透性；3．生物彈射鎢或金粒子被待轉(zhuǎn)移的物質(zhì)所覆蓋然后被打入細(xì)胞；4．磷酸鈣共沉淀法細(xì)胞可以吸收磷酸鈣沉淀，因此若將DNA/其他物質(zhì)與磷酸鈣共沉淀便可將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞；5．介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(通過(guò)脂質(zhì)體，病毒或細(xì)菌載體)；6．原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的一方面的目的是使用一種新材料來(lái)輔助將物質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面的目的是提供一種改進(jìn)的方法，以提供小體積的物質(zhì)。
直接微注射包括將含有DNA的微針直接插入單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核。一個(gè)玻璃微吸液器與一個(gè)微操作器相連，將10-8-10-7微升的物質(zhì)通常是DNA片段溶液注入細(xì)胞核。只要有足夠的操作熟練程度，“擊中率”是確定的，但這項(xiàng)技術(shù)很繁瑣，不能應(yīng)用于大量細(xì)胞。
基于第一個(gè)方面所說(shuō)，本發(fā)明包含將物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法。
優(yōu)選地可吸收或可被生物吞噬的多孔硅將被使用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，包含最少一個(gè)區(qū)域(region)的多孔硅的微針被使用，或者，這樣的微針陣列被使用。
基于第二方面所說(shuō)，本發(fā)明包括含多孔硅的微針或微針陣列。
基于第三方面，本發(fā)明包括將物質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞的工具，這個(gè)工具至少部分包括多孔硅以及將要轉(zhuǎn)入細(xì)胞的物質(zhì)。
優(yōu)選多孔硅是可吸收的。這種工具可以包括多孔硅生物彈射子彈。這種工具包含可與被轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的物質(zhì)共沉淀的物質(zhì)。這種工具可以包括一個(gè)可導(dǎo)電的有生物活性的多孔硅電極。
基于本發(fā)明的第四個(gè)方面，本發(fā)明包括使用多孔硅作為轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的工具。
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)多孔硅是生物相容的，并且多孔硅能侵入或被吸收入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，沒(méi)有明顯的有害效應(yīng)。多孔硅可用于定位和固定化某些生物活性物質(zhì)(或?qū)⑥D(zhuǎn)入細(xì)胞的物質(zhì))，這些物質(zhì)一旦進(jìn)入細(xì)胞就可以與細(xì)胞DNA結(jié)合，或者釋放入細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)。
從PCT專利申請(qǐng)WO 96/10630可知有一種微型機(jī)器化的硅刺(barbs)或尖頭(tips)的陣列來(lái)用于同時(shí)機(jī)械刺穿大量細(xì)胞的漿膜。這比用單針刺單個(gè)細(xì)胞有效的多，后者如需向上百個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入物質(zhì)將是一項(xiàng)非常工作量巨大的工作。事后看來(lái)，WO 96/10630的尖頭轉(zhuǎn)移物質(zhì)的效率很低。例如，在那份文件中設(shè)想的是利用緊密排列的尖頭之間的表面張力來(lái)裝載即將被轉(zhuǎn)入細(xì)胞的物質(zhì)，將它限制于尖頭(探針)與底物之間。
1993年公開(kāi)的US5 262 128中討論了一個(gè)建議，并聲稱可以教本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用Liga法生產(chǎn)硅針。據(jù)信這個(gè)文件在提交(及公開(kāi)時(shí))仍不可實(shí)施，因此對(duì)本發(fā)明的新穎性沒(méi)有影響。在申請(qǐng)被提交的1989年，以及它被公開(kāi)的1993年，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還不能制造如文獻(xiàn)中所討論的非常細(xì)的中空硅針。Liga法不適合生產(chǎn)中空的硅針，也不能在產(chǎn)品中產(chǎn)生坡度結(jié)構(gòu)。
US 5 457 041公開(kāi)了一種使用有不齊尖頭(ragged tips)的硅所制成的固體的針的陣列。
US 5 591 139公開(kāi)了在一個(gè)硅圓片平面上形成硅微針。
喬治亞技術(shù)學(xué)院的網(wǎng)站www.gtri.gatech.edu/resnews/NEEDLES.htnl上的文章，發(fā)表于1998年6月22日，討論了由硅生產(chǎn)固體針陣列的方法，并表達(dá)了使用一種未知且未鑒定的方法來(lái)生產(chǎn)中空針的愿望。
US 4 969 468討論了應(yīng)用于與神經(jīng)接觸的固體金屬針。
基于另一個(gè)方面，發(fā)明包含細(xì)胞穿透元件(cell-penetratingmember)，或稱用多孔硅制成的微穿刺器(mocropiercer)。
細(xì)胞穿透元件適于使用多孔硅攜帶即將轉(zhuǎn)入細(xì)胞的物質(zhì)。
基于另一個(gè)方面，本發(fā)明包含細(xì)胞穿透元件或微穿刺器，它們至少含一個(gè)區(qū)域的多孔硅。優(yōu)選待轉(zhuǎn)移的物質(zhì)含DNA或RNA,DNA或RNA片段，或DNA或RNA的構(gòu)建體。
細(xì)胞穿透元件或微穿刺器優(yōu)選適于使用多孔硅攜帶即將轉(zhuǎn)入細(xì)胞的物質(zhì)。
當(dāng)使用生物惰性物質(zhì)如鈦時(shí)，從它的運(yùn)動(dòng)性方面來(lái)看，多孔硅區(qū)域更適于固定化之。多孔硅區(qū)域一般位于細(xì)胞穿刺裝置或細(xì)胞穿刺器的頂端，它一般是尖頭或刺，無(wú)空腔，也可以是中間有通道的針。細(xì)胞穿刺裝置或細(xì)胞穿刺器有一個(gè)從儲(chǔ)液器到細(xì)胞穿刺裝置或穿刺器表面物質(zhì)傳遞區(qū)之間的孔道網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。
細(xì)胞穿刺裝置或細(xì)胞穿刺器可以有一個(gè)多孔硅的外表，或者一個(gè)截面，至少它的尖頭部分(若不是尖頭，就是其他物質(zhì)傳遞區(qū)域)是多孔硅的。一般而言，穿過(guò)細(xì)胞的細(xì)胞穿過(guò)元件細(xì)胞穿刺器的外表面都包含多孔硅。
細(xì)胞穿刺器或微穿刺器也許是帶多孔硅外殼的大的硅微尖頭。
將待轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的物質(zhì)置于細(xì)胞穿刺器或微穿刺器本身的頂端而不是尖頭之間的通道/空間的好處在于，物質(zhì)可以確定地轉(zhuǎn)入細(xì)胞，常是深入細(xì)胞。這會(huì)提高操作的成功率(在許多情況下，轉(zhuǎn)運(yùn)DNA進(jìn)入細(xì)胞及DNA片段的穩(wěn)定整合在統(tǒng)計(jì)上都不是非常成功，只有一定的成功百分率，這就是為什麼要對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行注射的原因)。
除了使用多孔硅在尖頭處來(lái)固定化物質(zhì)以確保尖頭上至少有少量待轉(zhuǎn)移的物質(zhì)外，其它方式也常使用。例如多晶硅在顆粒的邊緣也可以攜帶物質(zhì)。攜帶的方式可能包括多孔物質(zhì)。
已知可以用穿過(guò)型基因感受器將DNA片段固定于大孔硅上(Advances in GenosensorResearch.K.L.Beattie et al.C1in.Chem.41,700(1995))。
多孔硅的優(yōu)點(diǎn)是其生物活性能通過(guò)調(diào)節(jié)其孔徑大小及孔隙度而實(shí)現(xiàn)。因此生產(chǎn)帶有特定大小孔徑的的多孔硅尖頭以承載/固定化特定的分子或物質(zhì)的細(xì)胞穿刺器或微穿刺器是可能的。當(dāng)然，這些物質(zhì)不能被固定化得太厲害了，以致于當(dāng)尖頭在細(xì)胞內(nèi)時(shí)，這些物質(zhì)還不能離開(kāi)尖頭。
選擇多孔硅作為制造細(xì)胞穿刺器或微穿刺器的材料還有另一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是用硅組裝小規(guī)模裝置的微型機(jī)器生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)存在，例如在電子產(chǎn)業(yè)中。
現(xiàn)在已知如何使硅的結(jié)構(gòu)多孔化(例如US 5 348 618，其內(nèi)容已經(jīng)在參考資料中包括)。
細(xì)胞穿刺器或微穿刺器的陣列也可以被提供。這個(gè)陣列優(yōu)選是n×m二維微尖頭陣列。微穿刺器通常最好是網(wǎng)格排列，但也可能不必是這樣。
也已經(jīng)知道微尖頭陣列還有一種完全不同的應(yīng)用-真空微電子中應(yīng)用的場(chǎng)放射陰極。這里一個(gè)5平方毫米的硅芯片將包括500個(gè)金字塔型的微尖頭，基于選擇不同的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)其寬度為50毫米至1微米，高為10-100微米?；剡^(guò)來(lái)看，這些將對(duì)多孔化和其后的用于微穿刺器轉(zhuǎn)移物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞是很適合的。還知道已經(jīng)有多孔硅金字塔形的陰極-例如Field emisson from pyramidal cathodes coverd in poroussilicon P.R.Wilshaw et al.J.Vac.Sci.Techn.BI2,I(1994)；Fabrication of Si field emitters by forming poroussilicon.D.Kim et al.J.Vac.Sci.Tech.B14,1906(1996)；以及Porous silicon field emission cathode development.J.R.Jessing et al.J.Vac.Sci.Techn.B14,1899(1996)然而，這些是在完全不同的領(lǐng)域的應(yīng)用，沒(méi)有人顯示微尖頭可用于承載DNA,RNA或其他被轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的物質(zhì)。
基于第3個(gè)方面所說(shuō)，本發(fā)明包含生產(chǎn)微穿刺器的方法，該方法包括生產(chǎn)一個(gè)或多個(gè)微穿刺器投射(projections)以及在注射的頭部或接近頭部的地方駐留物質(zhì)的方法。
優(yōu)選該方法包括至少使投射(projections)的一部分多孔化。優(yōu)選使投射(projections)的尖頭或整個(gè)尖頭的范圍多孔化，或者在尖頭的外面包一個(gè)多孔外殼。優(yōu)選尖頭是用HF陽(yáng)極化技術(shù)進(jìn)行多孔化。
基于另一個(gè)方面所說(shuō)，本發(fā)明包含使物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的方法，包括將物質(zhì)連接到微穿刺器的尖頭部分以及使用微穿刺器刺透細(xì)胞的方法。
優(yōu)選該方法包含用多孔硅將物質(zhì)固定在尖頭或接近尖頭的部分。
基于更進(jìn)一步的方面所說(shuō)，本發(fā)明包含對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作，即包括將遺傳物質(zhì)與微穿刺器的尖頭部分連接起來(lái)，用該穿刺器刺透細(xì)胞使遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。這樣遺傳物質(zhì)就可以穩(wěn)定地整合入細(xì)胞。
基于發(fā)明的另一個(gè)方面，該發(fā)明包含一個(gè)微針陣列，即許多針從一個(gè)基座上伸出，每根針都有一個(gè)液流傳送裝置，該裝置適于將液流從基座傳向尖部，液流供應(yīng)裝置與傳送裝置相連，適于供應(yīng)液體以便將液體注入針的基部。
優(yōu)選微針的陣列是用硅作的。它也可以是用硅片用微型機(jī)器生產(chǎn)出來(lái)的。
液流傳送裝置可包括一個(gè)儲(chǔ)液池，位于針的下部。基座有一個(gè)下層部分和一個(gè)上層部分，一個(gè)管道或一個(gè)儲(chǔ)液池位于二者之間，針位于上層部分，液流傳遞裝置延伸至儲(chǔ)液池或管道。
液流傳遞裝置可以包含管腔，或者在每根針的中央貫穿其徑向部分的一個(gè)大孔?；蜻M(jìn)一步說(shuō)，液流傳遞裝置包含一個(gè)孔或毛細(xì)管網(wǎng)，例如許多中孔。
針的陣列可以放置在一個(gè)集成硅芯片上，同時(shí)上面有一個(gè)感受器，感受器可以使人們監(jiān)測(cè)原位轉(zhuǎn)染的進(jìn)程。例如可以使用光發(fā)射/探測(cè)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)與DNA偶連的發(fā)光標(biāo)記(如熒光劑)。在芯片上優(yōu)選有一套能量供應(yīng)及/或處理回路及/或控制回路。帶有光發(fā)射裝置及照片探測(cè)系統(tǒng)的陣列會(huì)使轉(zhuǎn)染過(guò)程在很高的空間分辨率的情況下被監(jiān)控。
基于另一個(gè)方面所說(shuō)，本發(fā)明包含生產(chǎn)微針或微針陣列的方法，該方法包括取一大塊硅圓片，生產(chǎn)針或微針陣列，并生產(chǎn)從每一根針基部到尖部的液流傳遞裝置。
優(yōu)選地，該方法提供從針的底部到尖部的孔道網(wǎng)絡(luò)，這些孔可以是大孔或中孔，在某些情況下可以是小孔(但優(yōu)選是大孔)。
每個(gè)針都優(yōu)選地使用光石印技術(shù)生產(chǎn)，如各向異性的蝕刻及感光石印技術(shù)。
硅基底可能是電阻為0.1-10歐姆.厘米的n-型的基底。
針或針的陣列可以是平面型的，例如使用非導(dǎo)電的隔膜。
平面化的陣列可以進(jìn)行處理以只暴露尖頭部分。例如使用氧漿處理和HF浸蘸法以只暴露尖頭部分。另外，平面化的陣列也許可以包埋在內(nèi)部。這些尖頭可以通過(guò)陽(yáng)極化產(chǎn)生從圓片基部表面到尖部的孔洞，有一個(gè)尖頭陣列的圓片可以和另一個(gè)支持物固定在一起，這個(gè)支持物可以在帶尖頭的硅圓餅和它之間建立通道或儲(chǔ)液池的聯(lián)系。
基于更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)移物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體，這個(gè)載體至少部分包括可吸收的材料。
優(yōu)選這個(gè)載體包含可吸收的硅，例如多孔硅或多晶硅。這個(gè)載體可以全部由可吸收材料制成，也可以只是部分由可吸收材料制成。這個(gè)工具也可以包括生物活性硅?！翱晌铡北硎静牧鲜乔秩?吸收/腐蝕或在生理溶液中時(shí)以別的方式在原位消失?！吧锘钚浴北硎静牧夏苁沽姿徕}沉淀在其表面上在生理?xiàng)l件之下(在體液中)時(shí)發(fā)生降解。
當(dāng)載體在細(xì)胞中時(shí)，它被吸附/被侵蝕/被腐蝕，或者被再吸收，或者局部地被再吸收，并且，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的刺激/異源物的反應(yīng)更少。可吸收的硅/其他的材料也許是可應(yīng)用于生物彈射技術(shù)里。
例如向細(xì)胞轉(zhuǎn)移物質(zhì)的載體可以是生物彈射的子彈。
向細(xì)胞轉(zhuǎn)移物質(zhì)的載體可以包括用多孔硅制的生物彈射的子彈。
這個(gè)子彈上附著有將轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的物質(zhì)。子彈包埋物質(zhì)(DNA)。它可能被該物質(zhì)所飽和。這個(gè)硅子彈可能含有亞微硅顆粒。它可以用染料蝕刻技術(shù)進(jìn)行多孔化。這些顆粒優(yōu)選是中孔的。
可吸收的生物彈射的子彈將不在細(xì)胞中留下粒子，這一點(diǎn)不象金或者鎢的子彈一樣。這些子彈不必從頭到尾都是多孔的，它可以有一個(gè)多孔外殼?？晌盏臉審棽灰欢ㄊ嵌嗫坠?，或者由硅制成。但是，多孔硅已經(jīng)被確認(rèn)為是尤其適當(dāng)?shù)牟牧稀?br> 基于另一個(gè)方面所說(shuō)，發(fā)明提供轉(zhuǎn)移物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的方法，包括將含上述物質(zhì)的載體射入細(xì)胞的步驟。
優(yōu)選地上述工具是上述已被定義的工具。優(yōu)選槍彈是通過(guò)高壓氣體射入細(xì)胞，例如用氦氣。
生物彈射的過(guò)程經(jīng)常被使用于標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)行不通的地方?？晌盏陌裎镔|(zhì)如多孔硅常比抗腐蝕的大型金屬材料有更好的生物相容性。
基于本發(fā)明提供的更進(jìn)一步的方面所說(shuō)，本發(fā)明提供制造轉(zhuǎn)移物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體的方法，該方法包括以下步驟即使載體變得至少部分多孔化以及將待轉(zhuǎn)移的物質(zhì)引入載體中。
優(yōu)選地該工具包含一個(gè)硅子彈--優(yōu)選是亞微硅顆粒--這樣可用染料蝕刻技術(shù)對(duì)其進(jìn)行多孔化，優(yōu)選是中孔。將被轉(zhuǎn)移的物質(zhì)或是附著在子彈上，或者包埋于其中。
這個(gè)載體可以是個(gè)亞微顆粒，將被轉(zhuǎn)移的物質(zhì)以這個(gè)載體為核進(jìn)行共沉淀。
用來(lái)轉(zhuǎn)移物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的工具可以包含生物活性硅。將被轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的物質(zhì)以易與沉淀物共沉淀的方式偶連在載體上。共沉淀物可以是鈣磷酸鹽沉淀物。
基于另一個(gè)方面所說(shuō)，本發(fā)明包含把將物質(zhì)轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的方法，包括將物質(zhì)與硅粒子偶連，將磷酸鈣沉淀于硅微粒上，形成鈣磷酸鹽/硅粒子結(jié)合的粒子，然后使細(xì)胞吸收鈣磷酸鹽/硅粒子的的組合物。
在電穿孔技術(shù)中細(xì)胞膜暴露在非常高電壓的短的電休克之后，會(huì)使細(xì)胞膜具有通透性。低孔隙度的生物活性硅是可導(dǎo)電的，適于將其發(fā)展為一種緊密偶連基質(zhì)，用于貼壁哺乳細(xì)胞在微電極陣列上的生長(zhǎng)。
有了生物活性硅，即多孔硅或多晶硅作為電穿孔裝置中的一個(gè)或兩個(gè)電極，可以想見(jiàn)，就可以進(jìn)行更好的DNA轉(zhuǎn)染了。
基于更進(jìn)一步的方面所說(shuō)，本發(fā)明包含電穿孔的方法，包括提供可導(dǎo)電的生物活性硅電極。
優(yōu)選包含在電極上生長(zhǎng)細(xì)胞的方法。這個(gè)方法包括提供帶生物活性的硅電極陣列，細(xì)胞可以在上面生長(zhǎng)。電極或這些電極可以用多孔硅包裹，或者他們的橫斷面，至少在其高向的一個(gè)區(qū)域?yàn)槎嗫坠琛?br> 基于更進(jìn)一步的方面所說(shuō)，本發(fā)明包括含生物活性電極的電穿孔裝置。優(yōu)選電極是生物活性硅的，優(yōu)選是多孔硅?？梢蕴峁╇姌O或微電極陣列。
另外，本發(fā)明也可以用于用生物活性硅優(yōu)選是多孔硅制造將物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞的裝置。
說(shuō)明這一點(diǎn)是很有幫助的，生物活性物質(zhì)是指這樣一類(lèi)物質(zhì)，當(dāng)在體內(nèi)時(shí)可以產(chǎn)生特定的生物反應(yīng)，在活組織與該物質(zhì)之間形成鍵。生物活性物質(zhì)也指表面活性生物物質(zhì)?？晌瘴镔|(zhì)是指在體內(nèi)可逐漸消失或隨時(shí)間降解的物質(zhì)，它可以也可以不被組織替代。生物侵蝕物質(zhì)是指可以被細(xì)胞吸收，也可能不被吸收的物質(zhì)。生物惰性物質(zhì)是指在體內(nèi)不產(chǎn)生很強(qiáng)烈的生物反應(yīng)的物質(zhì)。
本發(fā)明的實(shí)施可以通過(guò)幾個(gè)例子用圖表來(lái)說(shuō)明

圖1顯示被部分的多孔化了的硅微尖頭；圖2顯示硅微針陣列；圖3顯示圖2所示的硅微針陣列的從尖頭到根部?jī)?chǔ)液池的大孔網(wǎng)絡(luò)；圖4顯示用DNA包埋的多孔硅子彈；圖5顯示被磷酸鈣包圍的用DNA包埋的多孔硅核；圖6圖解本發(fā)明的電穿孔技術(shù)；圖7和8 SIMS圖顯示DNA對(duì)多孔硅的親和力以及它可以從多孔硅表面釋放。
圖1顯示了微穿刺器10在微尖頭12中，其底寬A為50微米，高B為100微米，尖頭寬C為0.5微米。微尖頭12包有多孔硅14外殼，深度D0.1微米。
在應(yīng)用當(dāng)中，多孔硅外殼14將轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的物質(zhì)(DNA/RNA)固定于尖頭上，增加了尖頭上固定化物質(zhì)的轉(zhuǎn)移入活細(xì)胞的效率。
多孔硅外殼的孔徑大小及孔隙度是可以控制的，以便調(diào)節(jié)微尖頭12的生物活性。通過(guò)控制多孔硅孔大小及多孔程度，我們能使特定的分子更容易或者更不容易地離開(kāi)它。我們可以將微尖頭在細(xì)胞中保留預(yù)定的時(shí)間，以便使分子從多孔硅上游離出來(lái)。
圖2為從硅支持物或基底元件(back member)＞4伸出的微針22的陣列20。微針22包括多孔硅微頭26和中空腔28，它將微尖頭26和由上部元件32所限定的儲(chǔ)液池30連接起來(lái)，而上部元件32由微針22和基底支持元件24所維持。基底元件24由硅塊制成。
圖3所示由硅微針34的陣列33，與圖2所示類(lèi)似。圖2與圖3所示陣列的主要區(qū)別在于圖3中的微針34無(wú)空腔28。取而代之的是圖3中由硅微針34組成的陣列33由中孔網(wǎng)絡(luò)36提供，從微針的微尖頭到儲(chǔ)液池30’，使液體在儲(chǔ)液池30’及微尖頭之間流通。
在應(yīng)用中，將轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的物質(zhì)從儲(chǔ)液池30,30’通過(guò)中空腔28或中孔(mesoporous)網(wǎng)絡(luò)36運(yùn)送到多孔微尖頭22,34。這些物質(zhì)被保留在多孔硅微尖頭上，便于轉(zhuǎn)入細(xì)胞。
待轉(zhuǎn)移物質(zhì)泵入儲(chǔ)液池30,30’，通過(guò)空腔28或多孔網(wǎng)絡(luò)泵出，本圖未示出(但箭頭39顯示了泵向儲(chǔ)液池注入液體。)最后結(jié)構(gòu)中的全部或部分硅表面均用下列方法進(jìn)行處理，以便于調(diào)整其與生物系統(tǒng)的相互作用。這一點(diǎn)可以通過(guò)在表面形成多孔硅層而實(shí)現(xiàn)。這層硅膜可以通過(guò)電化學(xué)的陽(yáng)極化過(guò)程或?qū)⒃摻Y(jié)構(gòu)浸泡于染料蝕刻溶液如氫氟酸和硝酸中完成。
圖4顯示了生物彈射子彈40。它包括通過(guò)染料蝕刻產(chǎn)生的中孔亞微硅顆粒。
在現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中，子彈40把將導(dǎo)入細(xì)胞的物質(zhì)包埋，然后通過(guò)高壓氦氣射入細(xì)胞。因?yàn)槎嗫坠枋强晌詹牧希鼉?yōu)選地是可完全或至少部分被它進(jìn)入的細(xì)胞吸收，與已知的生物彈子彈如金或鎢在細(xì)胞內(nèi)留下金屬顆粒，它將留下盡可能少的物質(zhì)。
圖5顯示了多孔硅核心50，它包埋了待轉(zhuǎn)移的物質(zhì)(例如DNA/RNA)以及在核心50周?chē)纬傻牧姿徕}沉淀物52。磷酸鈣52與DNA/RNA共沉淀，這樣就圍繞生物活性核心50形成遺傳物質(zhì)/磷酸鈣層。生物活性硅核心于其處導(dǎo)致磷酸鈣過(guò)飽和。也許可能將生物活性硅核心靠著細(xì)胞或細(xì)胞壁，DNA/磷酸鈣共沉淀物靠著核心及細(xì)胞壁。如果核心被吞噬它將被吸收。
核心50不必帶有DNA/RNA/其他活性物質(zhì)，它可以只作為DNA/磷酸鈣共沉淀的一個(gè)很好的成核位點(diǎn)。
已知使用玻璃珠作為DNA/磷酸鈣共沉淀物轉(zhuǎn)染的成核位點(diǎn)，見(jiàn)文章如下Watson and Latchman in "Methods(san Diego)1996 10(3),289-291(Eng)。
如果微孔的孔徑直徑為2nm或更小，中孔為2nm-50nm，大孔為50nm或更大，這是很好的。
如圖6所示，在電穿孔技術(shù)中使用多孔硅，最好是中孔硅(大孔和微孔也可以)，可以提高將物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞的效率是可能的，這一點(diǎn)也實(shí)現(xiàn)了。
使用多孔硅電極60,61(或其他多孔生物活性材料或生物活性多晶硅)有很好的電穿孔效果。因?yàn)殡姌O是生物活性的而非生物惰性的，細(xì)胞(常為動(dòng)物細(xì)胞)對(duì)它有親和力，易于附于其表面。
低孔率的生物活性硅(50％或更少，30％或更少，10％或更少)是可導(dǎo)電的，適宜作為貼壁哺乳細(xì)胞62的生長(zhǎng)基質(zhì)，它可以在微電極陣列60,61上生長(zhǎng)。這樣在生物活性多孔硅電極上培養(yǎng)哺乳細(xì)胞并通過(guò)電穿孔將DNA(或其他物質(zhì))導(dǎo)入細(xì)胞是可能的。細(xì)胞生長(zhǎng)的基質(zhì)是電極，甚至是電穿孔裝置的電極60,61。這在處理細(xì)胞方面有優(yōu)勢(shì)，并且比單單將細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基63中可以獲得更好的DNA轉(zhuǎn)染效率。
多孔硅在哺乳動(dòng)物中是可吸收/吞噬的這一點(diǎn)已被發(fā)明人證實(shí)，這是本發(fā)明某些方面的支柱。硅可以變成生物活性的支持著本發(fā)明的另一些方面。
下面圖7顯示SIMS圖(二級(jí)離子質(zhì)譜)該圖顯示了一張多孔硅不同深度的氮濃度示意圖。DNA富含氮，檢測(cè)多孔硅中高氮水平既是檢測(cè)硅中有多少DNA。圖表70表明“老化的”多孔硅片氮分析結(jié)果，其表面無(wú)添加DNA。氮的背景水平?jīng)Q定于多孔硅薄膜及其“年齡”，即在周?chē)目罩械谋Ａ舻臅r(shí)間。圖表72顯示表面滴加一滴水后對(duì)多孔硅片的分析。在這滴水中，每微升水含1納克DNA。硅片分析之前，這滴DNA溶液在50℃烘干。圖表74顯示了多孔硅片中的氮含量，該硅片滴加有1滴如上濃度為每微升1納克的DNA溶液，然后烘干，用去離子水在50℃漂洗。
從圖中可以看出，圖表72中比圖表70顯示了更多的氮含量。說(shuō)明該檢測(cè)測(cè)到了DNA，圖表74顯示洗滌步驟可以洗去一些，但非全部DNA，還有一部分DNA可能固定在多孔硅上，可以以后釋放(在洗滌過(guò)程中)。
圖8顯示純水洗后同一層的SIMS圖?！袄匣摹倍嗫坠柙?jīng)在空氣中滯留了一段時(shí)間，因?yàn)槲樟藖?lái)源于空氣中的氮的氧化物和氨，即共有的痕量污染氣體，獲得了氮背景。圖表80為“老化的”的不含DNA的多孔硅片，圖表82為含有一個(gè)水滴(無(wú)DNA)的老的多孔硅，圖表84又一次顯示了加了1納克/微升的DNA溶液的并于50℃烘干的多孔硅片的分析比較。
圖7,8所示的SIMS數(shù)據(jù)表明多孔硅可以可逆地結(jié)合DNA。
本發(fā)明或許可以被認(rèn)為是用多孔硅(或多晶硅)作為轉(zhuǎn)移物質(zhì)進(jìn)入活細(xì)胞的無(wú)機(jī)載體。
權(quán)利要求
1．一種轉(zhuǎn)移物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的方法，包括使用多孔硅轉(zhuǎn)移物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。
2．權(quán)利要求l的方法，包括使用可吸收或可生物侵蝕的多孔硅。
3．權(quán)利要求1或2的方法，包括使用至少含有一個(gè)區(qū)域多孔硅的微針。
4．權(quán)利要求3的方法，包括至少在針的尖部有多孔硅。
5．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，包括使用下述微針(ⅰ)有一個(gè)多孔硅外殼或(ⅱ)基本上全部使用多孔硅制造；或者至少針長(zhǎng)度的一部分由多孔硅制造。
6．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，包括使用微針陣列，這些微針包括至少部分多孔硅。
7．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，包括使用微針或微針陣列。這些微針都是中空的，包括多孔硅，物質(zhì)置于空腔中，或通過(guò)空腔傳遞。
8．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中使用了微針陣列，該陣列包括許多從支持物上伸展的針，這些針全部或部分包括多孔硅，每一個(gè)針都有液流傳遞裝置適于從基座向失部傳遞液體，液流供應(yīng)裝置和液流傳遞裝置相連，并提供液體注入針的基部。
9．權(quán)利要求3～8任意一項(xiàng)的方法，這些針都沒(méi)有中空腔，包含一個(gè)微穿刺器，上面有多孔硅，多孔硅上帶有待轉(zhuǎn)移的物質(zhì)。
10．權(quán)利要求1～9任意一項(xiàng)的方法，包括向針或許多針供應(yīng)液體的孔道網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，該系統(tǒng)從儲(chǔ)液池或管道到針表面的物質(zhì)供應(yīng)區(qū)。
11．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，該方法中，與在生物惰性物質(zhì)如大體積鈦上的移動(dòng)性相比，多孔硅固定化物質(zhì)。
12．權(quán)利要求1或2的方法，該方法包含使用多孔硅的生物彈射子道。
13．權(quán)利要求1或2的方法，包括使用其上連接有物質(zhì)的多孔硅，多孔硅以易于與另一種物質(zhì)形成共沉淀且沉淀易于被轉(zhuǎn)入細(xì)胞的形式存在。
14．權(quán)利要求13的方法，包含使用鈣磷酸鹽作為共同沉淀物。
15．權(quán)利要求1或2的方法，包括使用一個(gè)導(dǎo)電的生物活性電極，該電極至少包括一部分多孔硅并使用電穿孔法將物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞。
16．權(quán)利要求15的方法，其中細(xì)胞貼附于電極上。
17．上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中物質(zhì)包含DNA或RNA,DNA或RNA片段，或者DNA或RNA的構(gòu)建體。
18．包含多孔硅的微針。
19．權(quán)利要求18的微針，其上有管道。
20．權(quán)利要求19的微針，微針的通道從針的基部區(qū)域到針的尖部。
21．權(quán)利要求18～20任一項(xiàng)的微針，其中至少有一部分完全由多孔硅制成。
22．權(quán)利要求18～21任一項(xiàng)的微針，其中至少針的一部分包括多孔硅的外殼或者一層多孔硅的表面層。
23．權(quán)利要求18～22任一項(xiàng)的微針，其中提供了多孔或者毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)。
24．權(quán)利要求18～23任一項(xiàng)的針陣列，其中包含將被運(yùn)進(jìn)細(xì)胞的物質(zhì)。
25．權(quán)利要求24的針，物質(zhì)通過(guò)多孔硅承載或留在針上。
26．權(quán)利要求18～25任一項(xiàng)的針，它是可吸收的或可生物吸收的，或者部分是可吸收的或可生物吸收的。
27．固定于基座上的微針陣列，其上的微針?lè)蠙?quán)利要求18-26的要求的。
28．轉(zhuǎn)移物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的工具，這個(gè)工具至少是一部分包括多孔硅，以及即將轉(zhuǎn)入細(xì)胞的物質(zhì)。
29．權(quán)利要求28的工具，其中的多孔硅是可以吸收的。
30．權(quán)利要求28或29的工具，其中包含多孔硅生物彈射子彈。
31．權(quán)利要求28或29的工具，其中包含在應(yīng)用中可以和即將轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的物質(zhì)共沉淀的物質(zhì)。
32．權(quán)利要求28或29的工具，其中包含可導(dǎo)電的生物活性的多孔硅電極。
33．多孔硅作為轉(zhuǎn)移物質(zhì)進(jìn)入活細(xì)胞的介質(zhì)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及應(yīng)用多孔硅將物質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞中。為了侵入細(xì)胞中,多孔硅可以被成型為微刺(micropierces),微針(microneedles)和生物彈射子彈(biolistic bullets)。通過(guò)調(diào)節(jié)多孔硅的孔徑大小和孔隙度可以控制多孔硅的生物活性。多孔硅還是可以再吸收的,因此可從細(xì)胞中再吸收該多孔硅而不留下任何顆?；虮灰暈橥鈦?lái)物質(zhì)。本發(fā)明還涉及制備多孔硅微刺,微針,微電極,生物彈子彈的方法,以及在生物活性底物中沉淀磷酸鈣的方法,以及這些方法相比于已知的運(yùn)送物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的方法的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1310755SQ99809028
公開(kāi)日2001年8月29日 申請(qǐng)日期1999年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月22日
發(fā)明者L·T·坎哈姆 申請(qǐng)人:英國(guó)國(guó)防部