專(zhuān)利名稱(chēng)：在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中的表達(dá)、DNA構(gòu)建體和用于該過(guò)程的載體以及用該載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。
上述方法的共有特性在于酵母生產(chǎn)質(zhì)粒含有用于抗生素標(biāo)記的基因。這樣的標(biāo)記基因是由大腸桿菌中的起始克隆步驟產(chǎn)生的，其中將它用于篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或維持用作載體的質(zhì)粒。據(jù)認(rèn)為所述的抗生素標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)沒(méi)有任何不良影響，因此通常的做法是不采取任何步驟來(lái)缺失這樣的DNA。此外，通常通過(guò)從所述轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中分離質(zhì)粒并將分離的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌、隨后進(jìn)行抗生素選擇來(lái)進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建體的表征。因此，它適合于保持抗生素抗性標(biāo)記基因的實(shí)際目的。
盡管研究實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化生產(chǎn)工廠都受到極為嚴(yán)格的安全性管理制度的控制，但是仍然存在小的危害，即少量細(xì)胞將偶然被釋放到環(huán)境中。由于它們極為復(fù)雜的特性，這類(lèi)基因工程微生物僅能存活極短的期限并且對(duì)環(huán)境的危害程度極低。這當(dāng)然就是為什么已經(jīng)批準(zhǔn)這類(lèi)轉(zhuǎn)化的微生物可用于研究和大規(guī)模操作的原因。
盡管細(xì)胞快速死亡，但是含有抗生素抗性基因的質(zhì)粒仍然可能偶然被處理到環(huán)境中，且如果質(zhì)粒自然被吸收，那么在理論上存在細(xì)菌中引入了抗生素耐受性的危害。
抗生素對(duì)于治療人和動(dòng)物細(xì)菌感染來(lái)說(shuō)是極為重要的。如果可能，應(yīng)將使用使抗生素產(chǎn)生耐受性的基因?qū)е碌娜魏螡撛诃h(huán)境污染的危害降到最低限度。
因此，對(duì)開(kāi)發(fā)甚至比迄今為止所用方法更為安全的方法存在一種需求且本發(fā)明的目的就是提供這類(lèi)改進(jìn)的方法。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種重組酵母表達(dá)載體，它不能夠使細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生抗生素抗性并且包括編碼異源蛋白質(zhì)的基因和已經(jīng)通過(guò)體外修飾而成為非功能性的抗生素抗性標(biāo)記基因。
本發(fā)明的另一方面涉及一種用于生產(chǎn)所需多肽或蛋白質(zhì)的方法，所述的方法包括培養(yǎng)一種酵母菌株和從培養(yǎng)基中分離所需產(chǎn)物的步驟，其中所述的酵母菌株含有不能夠使細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生抗生素抗性并且包括編碼異源蛋白質(zhì)的基因和抗生素抗性標(biāo)記基因，該標(biāo)記基因已經(jīng)在轉(zhuǎn)化酵母宿主前通過(guò)體外修飾而成為非功能性的。
本發(fā)明的方法一般包括培養(yǎng)一種酵母菌株的步驟，所述的酵母菌株含有一種酵母表達(dá)質(zhì)粒，在該質(zhì)粒中，用于細(xì)菌中起始克隆步驟的功能性抗生素標(biāo)記基因已經(jīng)在插入用于表達(dá)和分泌所需多肽或蛋白質(zhì)的酵母宿主前通過(guò)體外缺失部分標(biāo)記基因或整個(gè)標(biāo)記基因而成為非功能性的。
抗生素標(biāo)記基因的缺失優(yōu)選通過(guò)在抗生素抗性標(biāo)記基因的每一側(cè)上插入合適的限制切割位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行，由此通過(guò)用合適的限制酶的體外處理而使所述的標(biāo)記基因缺失。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化的酵母菌株，它含有不能夠使細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生抗生素抗性的載體并含有編碼異源蛋白質(zhì)的基因和已經(jīng)在轉(zhuǎn)化酵母宿主前通過(guò)體外修飾而使抗生素抗性標(biāo)記基因成為非功能性的。
酵母菌株優(yōu)選是酵母屬的菌株，且特別是優(yōu)選釀酒酵母菌株。
本文所用的措詞“抗生素標(biāo)記基因”或“抗生素抗性標(biāo)記基因”指的是允許對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行表型選擇和質(zhì)粒擴(kuò)增的基因。
在大腸桿菌中最常用的抗生素抗性標(biāo)記基因是使氨芐西林(AMP)、氯霉素、新霉素、卡那霉素和四環(huán)素產(chǎn)生耐受性的標(biāo)記基因。
本文所用的措詞“非功能性標(biāo)記基因”指的是標(biāo)記基因已經(jīng)缺失或通過(guò)缺失部分基因而成為非功能性的。優(yōu)選所述的基因是完全缺失的。
本文所用的“體外修飾”指的是在細(xì)胞環(huán)境外的載體上進(jìn)行的修飾步驟。
本文所用的“不能夠使細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生抗生素抗性”指的是抗生素抗性基因由于所述的基因操作而在任何生物體中是非功能性的。
本文所用的“酵母宿主”指的是欲用表達(dá)質(zhì)?；蜉d體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的酵母生物體。
發(fā)明詳述通過(guò)使用可得到的限制位點(diǎn)或通過(guò)使用PCR引入合適的限制位點(diǎn)、位點(diǎn)特異性誘變或其它眾所周知的用于操作DNA序列的技術(shù)、隨后用合適的限制酶處理來(lái)進(jìn)行抗生素抗性標(biāo)記基因的體外缺失。
構(gòu)建了4種修飾的NN729菌株以評(píng)估質(zhì)粒中的各種缺失是否會(huì)影響長(zhǎng)期發(fā)酵過(guò)程中的胰島素前體發(fā)酵產(chǎn)率或菌株穩(wěn)定性(表Ⅰ)。比較了菌株與原始NN729菌株的發(fā)酵產(chǎn)率和發(fā)酵穩(wěn)定性(表Ⅱ)。此外，構(gòu)建了3種修飾的產(chǎn)生GLP-1變體Arg34GLP-1(7-37)的酵母菌株以評(píng)估含有AMP基因的質(zhì)粒pKV228中的各種缺失是否會(huì)影響Arg34GLP-1(7-37)的發(fā)酵產(chǎn)率(表Ⅲ)。
將AMP基因和可能的周邊序列已經(jīng)缺失的質(zhì)粒和菌株均命名為“ΔAMP”。
通過(guò)轉(zhuǎn)化pAK729或pKV228修飾的質(zhì)粒至釀酒酵母菌株MT663(E2-7B XE11-36a/α,ΔtpiΔtpi,pep4-3/pep4-3)或ME1719(MATa/αΔyap3::ura3/Δyap3::URA3pep4-3/pep4-3Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2 leu2/leu2 Δura3/Δura3)制備了修飾的酵母菌株，在所述的修飾的質(zhì)粒中，AMP標(biāo)記基因和來(lái)自原始質(zhì)粒的可能的其它DNA序列已經(jīng)缺失。
通過(guò)使用已經(jīng)存在于質(zhì)粒中的合適限制酶位點(diǎn)或通過(guò)以AMP基因可以被缺失的方式插入合適的限制酶位點(diǎn)制備了修飾的質(zhì)粒。在以AMP基因被缺失或使AMP基因成為非功能性的這樣的方式轉(zhuǎn)化至釀酒酵母(菌株MT663)前可以在體外操作修飾的質(zhì)粒且由此所得的酵母菌株缺乏AMP基因。因此，在處理酵母細(xì)胞的過(guò)程中由AMP基因產(chǎn)生的對(duì)環(huán)境的污染的潛在危險(xiǎn)得以消除。
將修飾的pAK729或pKV228質(zhì)粒用合適的限制酶消化、進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、分離、再連接且隨后分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)MY663和感受態(tài)ME1719 WO98/01535的釀酒酵母細(xì)胞。
由本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)或多肽可以是任意的可以有利地在酵母細(xì)胞中生產(chǎn)的異源蛋白質(zhì)或多肽。這類(lèi)蛋白質(zhì)的實(shí)例是抑酶肽、組織因子途徑抑制劑或其它蛋白酶抑制劑、胰島素、胰島素前體或胰島素類(lèi)似物、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ或Ⅱ、人或牛生長(zhǎng)激素、白細(xì)胞介素、組織纖溶酶原激活物、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a或b、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽2(GLP-2)、GRPP、因子Ⅶ、因子Ⅷ、因子X(jué)Ⅲ、血小板衍生的生長(zhǎng)因子和酶類(lèi)諸如脂酶類(lèi)。
所謂“胰島素前體”或“胰島素類(lèi)似物前體”可以理解為單鏈多肽，包括胰島素原，可以將它通過(guò)一種或多種隨后進(jìn)行的化學(xué)和/或酶促反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成具有如在天然人胰島素中發(fā)現(xiàn)的3個(gè)二硫橋的正確構(gòu)象的雙鏈胰島素或胰島素類(lèi)似物分子。所述的胰島素前體一般含有橋連胰島素A與B鏈的修飾的C-肽。此外，優(yōu)選的胰島素前體缺乏B(30)氨基酸殘基。最優(yōu)選的胰島素前體是在例如EP163529和PCT申請(qǐng)95/00550以及95/07931中所述的那些胰島素前體。胰島素的實(shí)例是人胰島素、優(yōu)選脫(B30)人胰島素和豬胰島素。優(yōu)選的胰島素類(lèi)似物是一個(gè)或多個(gè)天然氨基酸殘基、優(yōu)選一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被另一種可編碼的氨基酸殘基所取代的這樣的胰島素類(lèi)似物。因此，在親代胰島素的A21位上可以帶有一種選自于包括Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val在內(nèi)的組的氨基酸殘基，特別是選自于包括Gly、Ala、Ser、和Thr在內(nèi)的組的氨基酸殘基來(lái)代替Asn。同樣，在親代胰島素的B28位上可以帶有一種選自于包括Asp、Lys等在內(nèi)的組的氨基酸殘基來(lái)代替Pro；而在親代胰島素的B29位上可以帶有氨基酸Pro來(lái)代替Lys。
本文所用的措詞“可編碼的氨基酸殘基”表示可以通過(guò)遺傳密碼即核苷酸的三聯(lián)體(“密碼子”)編碼的氨基酸殘基。
通過(guò)已經(jīng)確立的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers在《四面體通訊》(Tetrahedron Letters)22,1981,pp.1859-1869中所述的亞磷酰胺法或由Matthes等在《歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(EMBO Journal)3,1984,pp.801-805中所述的方法可以制備DNA構(gòu)建體。根據(jù)亞磷酰胺法，例如在自動(dòng)DNA合成儀中合成寡核苷酸、將它們純化、形成雙鏈并連接以形成合成的DNA構(gòu)建體。目前優(yōu)選的制備DNA構(gòu)建體的方式是通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，例如如Sambrook等在《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual),Cold Spring Harbor,NY,1989中所述。
編碼所需蛋白質(zhì)的DNA還可以來(lái)源于基因組或cDNA，例如按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見(jiàn)Sambrook等在《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloning:A LaboratoryManual),Cold Spring Harbor,1989)通過(guò)制備基因組或cDNA文庫(kù)并經(jīng)使用合成寡核苷酸探針的雜交法篩選編碼本發(fā)明全部或部分多肽的DNA序列來(lái)獲得。
最后，編碼所需蛋白質(zhì)的DNA可以來(lái)源于通過(guò)按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使合成的、基因組的或cDNA來(lái)源的(如果合適)的片段退火制備的合成與基因組的混合型、合成與cDNA的混合型或基因組與cDNA的混合型，所述的片段符合完整DNA構(gòu)建體的不同部分。
重組表達(dá)載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外本體存在的載體，例如質(zhì)粒、染色體外因子、微型染色體或人工染色體，其復(fù)制與染色體的復(fù)制無(wú)關(guān)。該載體可以含有確保自復(fù)制的任意形式。另一方面，當(dāng)將該載體引入宿主細(xì)胞時(shí)，它可以是一種整合入基因組并與所整合入的染色體共同復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質(zhì)?；騼煞N或多種共同含有將被引入宿主細(xì)胞基因組的總DNA或轉(zhuǎn)座子的載體或質(zhì)粒。
重組表達(dá)載體可能會(huì)含有編碼可操作地與合適的啟動(dòng)子序列連接的所需蛋白質(zhì)或多肽的DNA序列。所述的啟動(dòng)子可以是在酵母中具有轉(zhuǎn)錄活性的任意DNA序列并可以來(lái)源于編碼與酵母同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。該啟動(dòng)子優(yōu)選來(lái)源于編碼與酵母同源的蛋白質(zhì)的基因。合適的啟動(dòng)子的實(shí)例是釀酒酵母Mal、TPI、ADH或PGK啟動(dòng)子。
編碼所需蛋白質(zhì)或多肽的DNA序列還可以可操作地與合適的終止子連接，例如TPI終止子(參見(jiàn)T.Alber和G.Kawasaki，《實(shí)用分子遺傳學(xué)雜志》(J.Mol.Appl.Genet.)1,1982,pp.419-434)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體還包含使載體能夠在酵母中復(fù)制的DNA序列。這類(lèi)序列的實(shí)例是酵母質(zhì)粒2μ復(fù)制基因REP1-3和復(fù)制起點(diǎn)。所述載體還可以包含選擇性標(biāo)記，例如由P.R.Russell在《基因》(Gene)40,1985,pp.125-130中所述的粟酒裂殖酵母TPI基因。
最后，表達(dá)載體優(yōu)選含有信號(hào)/前導(dǎo)序列以便確保所需蛋白質(zhì)或多肽分泌入培養(yǎng)基。信號(hào)序列是編碼多肽(“分泌肽”)的DNA序列，所編碼的多肽作為一種較大多肽的成分可指導(dǎo)較大多肽通過(guò)合成它的細(xì)胞的分泌途徑。通常將較大多肽裂解以便在通過(guò)分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中除去分泌肽。
分泌信號(hào)序列可以編碼確保有效指導(dǎo)所表達(dá)的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的任意信號(hào)肽。所述的信號(hào)肽可以是天然存在的信號(hào)肽或其功能部分或它可以是一種合成肽。用于酵母宿主細(xì)胞的信號(hào)肽類(lèi)獲自釀酒酵母a-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因、小鼠唾液淀粉酶的信號(hào)肽(參見(jiàn)O.Hagenbuchle等《自然》(Nature)289,1981,pp.643-646)、修飾的羧肽酶信號(hào)肽(參見(jiàn)L.A.Valls等《細(xì)胞》(Cell)48,1987,pp.887-897)、酵母BAR1信號(hào)肽(參見(jiàn)WO87/02670)或酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號(hào)肽(參見(jiàn)M.Egel-Mitani等《酵母》(Yeast)6,1990,pp.127-137)。
為了在酵母中進(jìn)行有效分泌，編碼前導(dǎo)肽的序列也可以被插入信號(hào)序列的下游和編碼該多肽的DNA序列的上游。前導(dǎo)序列的功能是使得所表達(dá)的多肽從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定向于高爾基體并進(jìn)一步定向于分泌小泡以便分泌入培養(yǎng)基(即多肽穿過(guò)細(xì)胞壁或至少通過(guò)細(xì)胞膜排入酵母細(xì)胞的壁膜間隙)。前導(dǎo)肽可以是酵母a-因子的前導(dǎo)區(qū)(其應(yīng)用在例如美國(guó)專(zhuān)利4,546,082、EP16 201、EP123 294、EP123 544和EP163 529中描述)。另一方面，前導(dǎo)肽可以是一種合成的前導(dǎo)肽，它是一種未在自然界被發(fā)現(xiàn)的前導(dǎo)肽?？梢匀鏦O89/02463或WO92/11378中所述和由Kjeldsen等在“蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化”(“Protein Expressionand Purification”)9,331-336(1997)中所述構(gòu)建前導(dǎo)肽類(lèi)。
可以將措詞“前導(dǎo)肽”理解為表示前肽序列形式的肽，所述的前肽序列的功能是使得所分泌的異源蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定向于高爾基體并進(jìn)一步定向于分泌小泡以便分泌入培養(yǎng)基，(即所表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽穿過(guò)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁(如果存在)或至少通過(guò)細(xì)胞膜排入具有細(xì)胞壁的細(xì)胞的壁膜間隙)。
用于分別連接編碼所需蛋白質(zhì)或多肽的DNA序列、啟動(dòng)子和終止子以及將它們插入含有酵母復(fù)制所必需的信息的合適的酵母載體的步驟對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的(參見(jiàn)例如Sambrook等，在所引用的文獻(xiàn)中所述)。應(yīng)該理解的是可以通過(guò)首先制備含有編碼本發(fā)明多肽的完整DNA序列的DNA構(gòu)建體且隨后將該片段插入合適的表達(dá)載體或通過(guò)順序插入含有用于各元件(諸如信號(hào)、前導(dǎo)區(qū)或異源蛋白質(zhì))的遺傳信息的DNA片段、隨后連接可以構(gòu)建所述的載體。
用于本發(fā)明方法的酵母生物體可以是任意合適的酵母生物體，在培養(yǎng)時(shí)它們產(chǎn)生令人滿(mǎn)意數(shù)量的所需蛋白質(zhì)或多肽。合適的酵母生物體的實(shí)例可以選自下列酵母菌種的菌株釀酒酵母、克魯弗酵母、粟酒裂殖酵母、葡萄汁酵母、乳酸克魯維酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、Pichia methanolica、克魯弗畢赤酵母、Yarrowialipolytica、假絲酵母屬的菌種、可可假絲酵母、地霉屬的菌種和Geotrichum fermentans；優(yōu)選的酵母菌種是釀酒酵母。
例如，通過(guò)原生質(zhì)體形成、隨后以本身已知的方式轉(zhuǎn)化可以實(shí)現(xiàn)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。用于培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任意適合于使酵母生物體生長(zhǎng)的常規(guī)的培養(yǎng)基?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)步驟從培養(yǎng)基中回收以正確加工形式和顯著的比例存在于培養(yǎng)基中的分泌的異源蛋白質(zhì)，所述的常規(guī)步驟包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離酵母細(xì)胞，借助于一種鹽，例如硫酸銨沉淀上清液或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)成分，隨后通過(guò)各種色譜程序，例如離子交換色譜法、親和色譜法等進(jìn)行純化。當(dāng)所述的蛋白質(zhì)分泌至壁膜間隙時(shí)，通過(guò)酶促方式或機(jī)械方式使細(xì)胞破裂。
可以將所需的蛋白質(zhì)或多肽表達(dá)和分泌為如WO97/22706中所述的N-末端延伸的融合蛋白。然后可以通過(guò)本領(lǐng)域中眾所周知的化學(xué)或酶促裂解在體外從回收的蛋白質(zhì)中除去N-末端延伸的部分。優(yōu)選使用酶進(jìn)行裂解。這類(lèi)酶的實(shí)例是胰蛋白酶或水解無(wú)色桿菌蛋白酶Ⅰ。
在下列實(shí)施例中更詳細(xì)地描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不以任何方式來(lái)限制所要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。
將pAK729質(zhì)粒用ApaLⅠ限制酶消化、進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、分離、重新連接且隨后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)釀酒酵母細(xì)胞(MT663，參見(jiàn)EPBO163529)以便得到轉(zhuǎn)化的酵母菌株NN729.1-ΔAMP。從酵母菌株NN729.1-ΔAMP中重新分離修飾的表達(dá)質(zhì)粒并在PCR發(fā)生后檢驗(yàn)DNA序列，隨后亞克隆以缺失為特征的DNA區(qū)。同樣，在從酵母菌株NN729.1-ΔAMP中重新分離的質(zhì)粒DNA上檢驗(yàn)編碼胰島素前體的DNA序列。
在30℃下，在YPD培養(yǎng)基中將酵母菌株NN729.1-ΔAMP培養(yǎng)72小時(shí)。通過(guò)RP-HPLC測(cè)定胰島素前體的發(fā)酵產(chǎn)率。
將質(zhì)粒pAK729.5用XhoⅠ限制酶消化、進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、分離、重新連接且隨后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)釀酒酵母細(xì)胞，從而得到酵母轉(zhuǎn)化體NN729.5-ΔAMP。從酵母菌株NN729.5-ΔAMP中重新分離修飾的表達(dá)質(zhì)粒并在PCR發(fā)生后檢驗(yàn)DNA序列，隨后亞克隆以缺失為特征的DNA區(qū)。同樣，在從酵母菌株NN729.5-ΔAMP中重新分離的質(zhì)粒DNA上檢驗(yàn)編碼胰島素前體的DNA序列。就破壞β-內(nèi)酰胺酶活性而言，結(jié)果是pAK729.5-ΔAMP中44個(gè)核苷酸的缺失與AMP基因的完全缺失同樣有效。
在30℃下，在YPD培養(yǎng)基中將酵母菌株NN729.5-ΔAMP培養(yǎng)72小時(shí)。通過(guò)RP-HPLC測(cè)定胰島素前體的發(fā)酵產(chǎn)率。
將pAK729.6質(zhì)粒用DNA限制酶AatⅡ消化、進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、分離、重新連接且隨后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)MT663釀酒酵母細(xì)胞。從酵母菌株NN729.6-ΔAMP中重新分離修飾的表達(dá)質(zhì)粒并在PCR發(fā)生后檢驗(yàn)DNA序列，隨后亞克隆以缺失為特征的DNA區(qū)。同樣，在從酵母菌株NN729.6-ΔAMP中重新分離的質(zhì)粒DNA上檢驗(yàn)編碼胰島素前體的DNA序列。缺乏AMP基因的質(zhì)粒NN729.6-ΔAMP如附圖
4中所示。
在30℃下，在YPD培養(yǎng)基中將酵母菌株NN729.6-ΔAMP培養(yǎng)72小時(shí)。通過(guò)RP-HPLC測(cè)定胰島素前體的發(fā)酵產(chǎn)率。實(shí)施例4通過(guò)PCR將pAK729.7質(zhì)粒中的新酶的限制位點(diǎn)AatⅡ(3801)引入原始pAK729質(zhì)粒。隨后檢驗(yàn)pAK729.7質(zhì)粒的選擇的DNA序列。在pAK729.7中，限制酶位點(diǎn)AatⅡ(3801)和AatⅡ(5978)之間的DNA片段可以被缺失，從而從該表達(dá)質(zhì)粒中除去了2177個(gè)核苷酸。將pAK729.7質(zhì)粒設(shè)計(jì)成AMP基因和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)均可以被缺失。pAK729.7的限制質(zhì)粒圖譜如附圖5中所示。
將pAK729.7質(zhì)粒用DNA限制酶AatⅡ消化、進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、分離、重新連接且隨后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)MT663釀酒酵母細(xì)胞。從酵母菌株NN729.7-ΔAMP中重新分離修飾的表達(dá)質(zhì)粒并在PCR發(fā)生后檢驗(yàn)DNA序列，隨后亞克隆以缺失為特征的DNA區(qū)。同樣，在從酵母菌株NN729.7-ΔAMP中重新分離的質(zhì)粒DNA上檢驗(yàn)編碼胰島素前體的DNA序列。在30℃下，在YPD培養(yǎng)基中將酵母菌株NN729.7-ΔAMP培養(yǎng)72小時(shí)。通過(guò)RP-HPLC測(cè)定胰島素前體的發(fā)酵產(chǎn)率。
表Ⅰ以帶有非功能性或缺失的AMP基因的pAK729質(zhì)粒為基礎(chǔ)的NN729菌株的概要
將新的NN729-ΔAMP菌株與原始的NN729菌株的胰島素前體的發(fā)酵產(chǎn)率進(jìn)行了比較(表Ⅱ)。
表Ⅱ用帶有非功能性或缺失的AMP基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的NN729-ΔAMP菌株的發(fā)酵產(chǎn)率
從上述結(jié)果中可以看出包括部分或完全缺失AMP標(biāo)記基因的表達(dá)質(zhì)粒的酵母菌株表達(dá)的胰島素前體比包括含有AMP基因的表達(dá)質(zhì)粒的原始酵母菌株表達(dá)的胰島素前體多10-20％。
用對(duì)NN729.1(實(shí)施例1)、NN729.5(實(shí)施例2)和NN729.6(實(shí)施例3)所述的AMP抗性基因破壞法構(gòu)建了三種Arg34GLP-1(7-37)表達(dá)質(zhì)粒且隨后將它們轉(zhuǎn)化至感受態(tài)ME1719(參見(jiàn)WO98/01535)釀酒酵母細(xì)胞，從而分別得到酵母轉(zhuǎn)化體YES2076、YES2079和YES2085。
已經(jīng)用于表達(dá)Arg34GLP-1(7-37)的宿主菌株是一種二倍體菌株并且具有缺乏兩種天冬氨酸蛋白酶的表型，所述的天冬氨酸蛋白酶即(1)裂解一元或二元氨基酸殘基C-末端的酵母天冬氨酰蛋白酶3(YAP3)(Egel-Mitani等《酵母》(YEAST)6:127-137,1990)和(2)導(dǎo)致其它蛋白酶諸如蛋白酶B、羧肽酶Y、氨肽酶I、RNA酶、堿性磷酸酶、酸性海藻糖酶和聚磷酸外切酶活化的液泡蛋白酶A。此外，丙糖磷酸異構(gòu)酶基因(TPI)已經(jīng)被破壞，其表型使得在生長(zhǎng)于含有葡萄糖的培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化體中利用葡萄糖成為可能。ME1719的遺傳背景是MATa/aDyap3::ura3/Dyap3::URA3 pep4-3/pep4-3 tpi::LEU2/Dtpi::LEU2 leu2/leu2 Dura3/Dura3。
從酵母菌株中重新分離修飾的表達(dá)質(zhì)粒pKV301、pKV307和pKV304并在PCR發(fā)生后檢驗(yàn)DNA序列，隨后亞克隆以缺失為特征的DNA區(qū)。同樣，在從所述的酵母菌株中重新分離的質(zhì)粒DNA上檢驗(yàn)編碼Arg34GLP-1(7-37)的DNA序列。表Ⅲ顯示了修飾的與未修飾的菌株的比較結(jié)果。
表Ⅲ以帶有用于表達(dá)Arg34GLP-1(7-37)的非功能性或缺失的AMP抗性基因的質(zhì)粒為基礎(chǔ)的YES菌株的概要
在30℃下，比較YPD中進(jìn)行72小時(shí)的5ml實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵的產(chǎn)率。使用HPLC估計(jì)產(chǎn)率。
權(quán)利要求
1．不能夠使細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生抗生素抗性的重組酵母表達(dá)載體，所述的載體包括編碼異源蛋白質(zhì)的基因和已經(jīng)通過(guò)體外修飾而成為非功能性的抗生素抗性標(biāo)記基因。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組酵母表達(dá)載體，其中所述的抗生素標(biāo)記基因是AMP基因。
3．用于生產(chǎn)所需多肽或蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在合適的條件下培養(yǎng)含有權(quán)利要求1-2所述載體的酵母菌株并從培養(yǎng)基中分離所需產(chǎn)物的步驟。
4．用于生產(chǎn)所需多肽或蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在合適的條件下培養(yǎng)含有酵母表達(dá)質(zhì)粒的酵母菌株的步驟，在所述的質(zhì)粒中，在插入酵母宿主前已經(jīng)通過(guò)體外缺失部分標(biāo)記基因或整個(gè)標(biāo)記基因而使用于細(xì)菌中起始克隆步驟的功能性抗生素標(biāo)記基因成為非功能性的。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，包括在抗生素抗性標(biāo)記基因周?chē)迦牒线m的限制位點(diǎn)并通過(guò)用合適的限制酶進(jìn)行的體外處理而使所述標(biāo)記基因缺失的步驟。
6．根據(jù)權(quán)利要求3-5所述的方法，其中所述的酵母菌株是酵母屬的菌株，優(yōu)選釀酒酵母菌株。
7．含有權(quán)利要求1-2所述載體的轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化酵母菌株，它是一種酵母屬的菌株，優(yōu)選釀酒酵母菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于在酵母中表達(dá)異源蛋白質(zhì)或多肽的方法,該方法通過(guò)培養(yǎng)一種不含功能性抗生素抗性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化酵母菌株來(lái)進(jìn)行。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1309712SQ9980870
公開(kāi)日2001年8月22日 申請(qǐng)日期1999年7月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月16日
發(fā)明者T·杰爾德森, K·瓦德 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司