專利名稱：用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基和使用該培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，和使用該培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有一種魚肉提取物或魚肉的酶促降解產(chǎn)物，但是不含有哺乳動(dòng)物衍生的組分如蛋白質(zhì)或它的分解產(chǎn)物；和使用該培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。
近年來，人們表現(xiàn)出了對(duì)哺乳動(dòng)物衍生的組分與瘋牛病、牛的海綿狀腦病(BSE)、傳染性海綿狀腦病(TSE)和Creutzfeld-Jakob疾病(CJD)之間關(guān)系的關(guān)注。從安全性方面來看需要開發(fā)用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基不含這些哺乳動(dòng)物衍生的組分。
在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)中，在培養(yǎng)的早期，不向培養(yǎng)基中加入上述哺乳動(dòng)物衍生的組分會(huì)引起細(xì)胞存活率的顯著下降和培養(yǎng)肉湯中活細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少。這些事件使長(zhǎng)期培養(yǎng)或大規(guī)模培養(yǎng)不可能進(jìn)行。本發(fā)明的目的在于提供用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基不含哺乳動(dòng)物衍生的組分并且不存在上述問題，和使用該培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。
即，本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有一種魚肉提取物或魚肉的酶促降解產(chǎn)物，和用該培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。
圖2是表示在分別含有白利1％和白利2％的魚肉酶促降解產(chǎn)物和10克/升的牛肉水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHO細(xì)胞的存活率(％)的圖。
圖3是表示在培養(yǎng)基中由在分別含有白利1％和2％的魚肉酶促降解產(chǎn)物和10克/升的牛肉水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHO細(xì)胞產(chǎn)生的抗體蛋白質(zhì)的濃度(毫克/升)的圖。
圖4表示在實(shí)施例5中使用一種搖瓶式細(xì)胞培養(yǎng)裝置進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果。在圖4中縱軸分別表示活細(xì)胞密度、細(xì)胞存活率和產(chǎn)生的抗體蛋白質(zhì)的量。每個(gè)橫軸代表使用培養(yǎng)基B開始培養(yǎng)后培養(yǎng)的天數(shù)。
本發(fā)明的培養(yǎng)基是一種用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有魚肉提取物或魚肉的酶促降解產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，動(dòng)物細(xì)胞能被令人滿意地進(jìn)行培養(yǎng)而不需向培養(yǎng)基(通常已用作動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基)中添加哺乳動(dòng)物衍生的組分。
用于本發(fā)明的魚肉的實(shí)例有紅肉魚的魚肉如狐鰹、護(hù)衛(wèi)鯖、金槍魚、鯖魚、太平洋竹刀魚、沙丁魚、馬鯖、和鮭魚的魚肉，及白肉魚如鱈魚、日本海刺鰭魚、右眼鮮魚、左眼鮮魚和海鯛科魚的魚肉。優(yōu)選的實(shí)例是狐鰹、護(hù)衛(wèi)鯖、鱈魚、鯖魚、鮭魚和沙丁魚。
用于本發(fā)明的魚肉提取物可通過將魚肉切成適當(dāng)?shù)男K或?qū)Ⅳ~肉切碎成糊狀，并用熱水，例如90至95℃的熱水，提取肉塊或肉糊的可溶性組分幾十分鐘至幾十小時(shí)來獲得。具體的實(shí)例是由用于生產(chǎn)干燥狐鰹的煮過的狐鰹制得的原液和在生產(chǎn)罐裝食品過程中的烹調(diào)殘液。
魚肉的酶促降解產(chǎn)物可通過，例如加入適量的水至蒸煮的魚肉本身，或切碎成糊狀的魚肉，或上述魚肉提取物中，接著，如果必需，經(jīng)加熱使蛋白質(zhì)變性，然后用蛋白酶處理該物料，和按照需要將處理過的物料進(jìn)行離心或過濾以除去油和不溶物來制得。將產(chǎn)生的魚肉提取物或魚肉的酶促降解產(chǎn)物按需要調(diào)節(jié)至pH7至7.4備用。
用于本發(fā)明的蛋白酶是，例如，蛋白水解酶和/或肽酶。在本發(fā)明中，術(shù)語蛋白水解酶是指一種可將蛋白質(zhì)作為底物水解的酶，而術(shù)語肽酶是指一種將肽作為底物的肽鍵水解酶。即，蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)底物的活性能被識(shí)別為蛋白水解酶活性，而蛋白酶對(duì)肽底物的活性能被識(shí)別為肽酶活性。當(dāng)催化裂解肽鍵鏈時(shí)，在其中間的部位，根據(jù)蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)底物的活性，使用術(shù)語蛋白水解酶。因此，在本文中內(nèi)肽酶被用作一種蛋白水解酶。
所用的酶的實(shí)例是植物來源的酶，如木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無花果蛋白酶，和來自微生物的酶，如霉菌、細(xì)菌和酵母。它們包括內(nèi)肽酶、外肽酶、氨基肽酶、羧基肽酶和二肽酶。這些酶可以單獨(dú)使用或結(jié)合使用。當(dāng)它們結(jié)合使用時(shí)，它們可以同時(shí)加入，或逐漸地加入。
在本發(fā)明中魚肉的酶促降解產(chǎn)物優(yōu)選的是用蛋白水解酶處理，接著用肽酶處理得到的魚肉的酶促降解產(chǎn)物。
用酶處理的條件依照所用酶的類型而不同。通常，酶處理在pH2至12，優(yōu)選pH4至8下進(jìn)行30分鐘至72小時(shí)，優(yōu)選3至24小時(shí)，溫度為30至90℃，優(yōu)選40至65℃。所用的酶是以大約0.01％至10％的比例，優(yōu)選0.5％至5％，更優(yōu)選1％至3％，按作為底物的蛋白質(zhì)量計(jì)算。
在形成的魚肉的酶促降解產(chǎn)物中的酶用加熱等方法失活，和按需要進(jìn)行離心或過濾，以除去油和不溶物，如此可制得酶促降解產(chǎn)物。
作為本發(fā)明的培養(yǎng)基的其它組分，通常在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基中所用的各種組分可以按需要來使用。它們包括氨基酸、維生素、脂質(zhì)因子，能源、滲透壓調(diào)節(jié)劑，鐵源和pH調(diào)節(jié)劑。除這些組分外，痕量金屬元素、表面活性劑、生長(zhǎng)輔助因子和核苷也可加入。
實(shí)例是氨基酸，如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胖氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸，優(yōu)選L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸；維生素，如i-肌醇，生物素、葉酸、硫辛酸、煙酰胺、煙酸、對(duì)氨基苯甲酸、泛酸鈣、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺、維生素B12和抗壞血酸，優(yōu)選生物素、葉酸、硫辛酸、煙酰胺、泛酸鈣、鹽酸吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺。維生素B12和抗壞血酸；脂質(zhì)因子，如氯化膽堿、膽堿酒石酸鹽、亞油酸、油酸和膽甾醇、優(yōu)選氯化膽堿；能源，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖，優(yōu)選葡萄糖；滲透壓調(diào)節(jié)劑如氯化鈉、氯化鉀和硝酸鉀，優(yōu)選氯化鈉；鐵源、如鐵EDTA、檸檬酸鐵、氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸鐵、硫酸亞鐵和硝酸鐵，優(yōu)選氯化鐵、鐵EDTA和檸檬酸鐵；和pH調(diào)節(jié)劑，如碳酸氫鈉、氯化鈣、一堿價(jià)磷酸鈉、HEPES和MOPS，優(yōu)選碳酸氫鈉。含有這些組分的任意成員的培養(yǎng)基可被引用作為實(shí)例。
除上述組分外，可以加入痕量金屬元素，如硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鎳、氯化錫、氯化鎂和亞硅酸鈉，優(yōu)選硫酸銅、硫酸鋅和硫酸鎂；表面活性劑、如吐溫80和Pluronic F68；生長(zhǎng)輔助因子，如重組胰島素、重組IGF、重組EGF、重組FGF、重組PDGF、重組TGF-α，乙醇胺鹽酸鹽、亞硒酸鈉、視黃酸和腐胺二鹽酸鹽，優(yōu)選亞硒酸鈉、乙醇胺鹽酸鹽、重組IGF和腐胺二鹽酸鹽；和核苷，如脫氧腺苷、脫氧胞苷、脫氧鳥苷、腺苷、胞苷、鳥苷和尿苷。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以包含抗生素，如鏈霉素、青霉素-G鉀和慶大霉素，和pH-指示劑，如酚紅。
為具體地制備本發(fā)明的培養(yǎng)基，魚肉提取物或魚肉的酶促降解產(chǎn)物可以替代哺乳動(dòng)物衍生的組分加入到一種可商購(gòu)的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，例如，BME培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、F10培養(yǎng)基或F12培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明中，將魚肉提取物，或魚肉酶促降解產(chǎn)物加入到培養(yǎng)基中使其在培養(yǎng)基中的濃度達(dá)到大約白利5％或更低，優(yōu)選白利0.5至3％，更優(yōu)選地白利1至2％。該濃度是用可溶性固體確定的濃度，作為一個(gè)指標(biāo)，用糖度折光計(jì)測(cè)定的。
培養(yǎng)基中其它組分的量是0.05至1,500毫克/升氨基酸、0.001至10毫克/升維生素，0至200毫克/升脂質(zhì)因子，1至20克/升能源，0.1至10,000毫克/升滲透壓調(diào)節(jié)劑，0.1至500毫克/升鐵源，1至10,000毫克/升pH緩沖劑，0.00001至200毫克/升痕量金屬元素，0至5,000毫克/升表面活性劑，0.05至10,000微克/升生長(zhǎng)輔助因子和0.001至50毫克/升核苷。需要時(shí)，它們的量可以根據(jù)所要培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞的類型和所需要的蛋白質(zhì)的類型來確定。
培養(yǎng)基的pH根據(jù)所要培養(yǎng)的細(xì)胞而不同，但在許多情況下通常為pH6.8至7.6，或pH7.2至7.4。
本發(fā)明的培養(yǎng)基不受任何限制，可優(yōu)選地用于各種動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。例如，可用于培養(yǎng)具有通過遺傳工程方法摻入的所需要的抗體或生理學(xué)活性物質(zhì)的基因的COS細(xì)胞或CHO細(xì)胞，或以雜交瘤，如鼠-人，鼠-鼠或鼠-兔為代表的產(chǎn)生抗體的融合細(xì)胞。該培養(yǎng)基特別優(yōu)選用于培養(yǎng)CHO細(xì)胞。不用說，當(dāng)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞以獲得一種由該動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的天然蛋白質(zhì)時(shí)可以使用本發(fā)明的用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基除用于培養(yǎng)上述細(xì)胞外也能用于培養(yǎng)BHK細(xì)胞和Hela細(xì)胞。
培養(yǎng)條件根據(jù)所用的細(xì)胞類型而不同，優(yōu)選的條件可以按需要來確定。例如，CHO細(xì)胞通常是在CO2在氣相中的濃度為0至40％，優(yōu)選2至10％的氣氛中，在30至39℃，優(yōu)選約37℃下培養(yǎng)1至14天。
培養(yǎng)可以用各種用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)裝置來進(jìn)行，例如，發(fā)酵罐式罐培養(yǎng)裝置，氣升式培養(yǎng)裝置、培養(yǎng)瓶式培養(yǎng)裝置、旋轉(zhuǎn)瓶型培養(yǎng)裝置、微載體式培養(yǎng)裝置，流化床式培養(yǎng)裝置、中空纖維式培養(yǎng)裝置，滾瓶式培養(yǎng)裝置和填充床式培養(yǎng)裝置。
通過在本發(fā)明的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可以在培養(yǎng)基中獲得一種由該動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。為了從動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)，純粹的培養(yǎng)可能就足夠了，或可能需要一種特殊的方法。需要時(shí)，根據(jù)將要培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞可以確定方法、條件等。對(duì)于經(jīng)遺傳工程操作用含有一種編碼鼠-人嵌合抗體的基因的載體轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞來說，例如，培養(yǎng)是在前述條件下進(jìn)行的，由此就能在培養(yǎng)基中獲得所需要的蛋白質(zhì)，需經(jīng)約1至14天，優(yōu)選地約7至10天。然后，將培養(yǎng)基用通常的方法(見，例如，抗體工程導(dǎo)論，Chijin Sho Kan出版公司，第102-104頁；親合色譜原理與方法、AmershamPharmacia Bitech,第56-60頁)進(jìn)行分離和純化，由此可得到所需要的蛋白質(zhì)。
前述生產(chǎn)方法能產(chǎn)生基因重組蛋白質(zhì)，如重組抗體諸如抗-人IL-6受體抗體(包括嵌合抗體、人源化抗體、人抗體)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細(xì)胞生成素、干擾素、白介素(例如，IL-1和IL-6)、t-PA、尿激酶、血清白蛋白和凝血因子Ⅷ。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明的用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基含有一種魚肉的提取物或魚肉的酶促降解產(chǎn)物，因此使得穩(wěn)定地培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞成為可能，不需要使用一種在質(zhì)量上產(chǎn)生很大變化的昂貴的蛋白質(zhì)，如胎牛血清。此外，通過在根據(jù)本發(fā)明的用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，即含有一種魚肉的提取物或魚肉的酶促降解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，由異常朊病毒或病毒造成污染的危險(xiǎn)(近幾年出現(xiàn)的問題)可被消除，并且可以生產(chǎn)和提供安全的生物技術(shù)產(chǎn)物。
實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)敘述本發(fā)明的實(shí)施例將在下面給出，但本發(fā)明絕不受這些實(shí)施例的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠進(jìn)行各種改變和改良，但這些也包括在本發(fā)明的范圍中。
實(shí)施例1魚肉(沙丁魚)提取物的制備將一種可商購(gòu)的沙丁魚用作魚肉。向500克切碎的魚肉中加入2,500克水，并將肉在95℃下提取90分鐘。
然后，將提取物離心和過濾以除去不溶物和油。將剩余物濃縮得到64克的魚肉(沙丁魚)提取物。
實(shí)施例2魚肉(狐鰹)的酶促降解產(chǎn)物的制備將一種可商購(gòu)的狐鰹用作魚肉。向1000克切碎的狐鰹中加入1,500克水。將混合物在50℃下于pH6與4克植物衍生的木瓜蛋白酶一起培養(yǎng)1小時(shí)進(jìn)行酶促降解。然后，在上述條件下與4克霉菌衍生的外肽酶一起進(jìn)一步進(jìn)行酶促降解20小時(shí)，此后將體系在95℃下加熱以使酶失去活性。接著，將體系離心和過濾以除去不溶物和油。將剩余物濃縮得到500克根據(jù)本發(fā)明的魚肉(狐鰹)的酶促降解產(chǎn)物。
實(shí)施例3培養(yǎng)基的制備從一種可商購(gòu)的DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO BRL產(chǎn)品和參考指南，第357-358頁)中除去胸苷和次黃嘌呤。向產(chǎn)生的培養(yǎng)基中加入下列組分(混合物將在下文中被描述為培養(yǎng)基A)，將混合物用作動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
(培養(yǎng)基A)從一種可商購(gòu)的DEME/F12培養(yǎng)基中除去胸苷和次黃嘌呤，并加入下列組分30毫克/升 抗壞血酸10毫克/升 脫氧腺苷(1H2O)10毫克/升 脫氧胞苷10毫克/升 脫氧鳥苷5毫克/升腺苷5毫克/升胞苷5毫克/升鳥苷5毫克/升尿苷4毫克/升乙醇胺(HCl)1000毫克/升 Pluronic F-6818.9毫克/升 氯化鐵(6H2O)向上述培養(yǎng)基A中加入在實(shí)施例2中制備的酶促降解產(chǎn)物使最終濃度為白利1％或白利2％，并通過過濾將混合物滅菌。
實(shí)施例4對(duì)產(chǎn)生的抗體的量的影響利用一種產(chǎn)生人源化PM-1抗體(抗人IL-6受體抗體)的CHO細(xì)胞株來進(jìn)行試驗(yàn)，該抗體是按照日本未審查的專利出版物第99902/1996號(hào)的參考實(shí)施例2中所敘述的方法使用在國(guó)際專利申請(qǐng)出版物第WO92/19759號(hào)的實(shí)施例10中敘述的人延伸因子Iα啟動(dòng)子制得的。
將上述CHO細(xì)胞(1.5×105細(xì)胞/毫升)加入到含有魚肉的酶促降解產(chǎn)物，在本文實(shí)施例2中已制得的最終濃度為白利1％或白利2％的培養(yǎng)基A中。將該體系在培養(yǎng)箱條件為37℃、5％CO2下，利用搖瓶式細(xì)胞培養(yǎng)裝置培養(yǎng)10天。
接著，測(cè)量活細(xì)胞密度、細(xì)胞存活率和從培養(yǎng)基中得到的抗體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量。利用反相高效液相色譜法測(cè)量產(chǎn)生的量。
作為對(duì)照，制備了一種含有10克/升的牛肉水解產(chǎn)物(PrimatoneTM:Quest，美國(guó))代替實(shí)施例2的酶促降解產(chǎn)物的培養(yǎng)基，并將CHO細(xì)胞以同樣方法進(jìn)行培養(yǎng)。
所得的結(jié)果示于

圖1。與對(duì)照相比較，在含有白利1％的狐鰹的酶促降解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)情況與對(duì)照的細(xì)胞生長(zhǎng)情況類似。在含有白利2％的狐鰹的酶促降解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHO細(xì)胞獲得了比對(duì)照更大量的抗體蛋白質(zhì)產(chǎn)量。
實(shí)施例5使用各種魚肉的酶促降解產(chǎn)物的培養(yǎng)基對(duì)抗體產(chǎn)生量的影響將狐鰹、沙丁魚、鮭魚、護(hù)衛(wèi)鯖、鱈魚和鯖魚的魚肉酶促降解產(chǎn)物加入到一種非哺乳動(dòng)物來源的培養(yǎng)基中，研究了抗體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量。
魚肉的酶促降解產(chǎn)物的制備用實(shí)施例2中敘述的方法制備了上述魚肉的酶促降解產(chǎn)物。即，將魚肉切碎，用木瓜蛋白酶，一種植物衍生的內(nèi)肽酶，進(jìn)行酶促降解。然后，物料進(jìn)一步用霉菌衍生的外肽酶進(jìn)行酶促降解，此后將體系加熱使酶失去活性。接著，將該體系離心和過濾以除去不溶物和油。將剩余物濃縮制得了魚肉的酶促降解產(chǎn)物。
培養(yǎng)基的制備和測(cè)試方法將用編碼在實(shí)施例4中敘述的人源化PM-1抗體(抗人IL-6受體抗體)的基因和dhfr選擇性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的dhfr(-)CHO細(xì)胞加入到含有狐鰹、沙丁魚、鮭魚、護(hù)衛(wèi)鯖、鱈魚或鯖魚的酶促降解產(chǎn)物的培養(yǎng)基B中，其最終濃度為10克/升(白利1％)或15克/升(白利1.5％)。將該體系在37℃、5％CO的培養(yǎng)箱條件下，用搖瓶式細(xì)胞培養(yǎng)裝置培養(yǎng)10天。然后，測(cè)定活細(xì)胞密度、細(xì)胞存活率和抗體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量。培養(yǎng)基B的組分如下(培養(yǎng)基B)從一種可商購(gòu)的DMEF/F12培養(yǎng)基中除去胸苷和次黃嘌呤，并加入下列組分12.5毫克升 抗壞血酸2.5毫克/升 脫氧腺苷(1H2O)2.5毫克/升 脫氧胞苷2.5毫克/升 脫氧鳥苷2.5毫克/升 腺苷2.5毫克/升 胞苷2.5毫克/升 鳥苷2.5毫克/升 尿苷0.2毫克/升 腐胺(2HCl)0.975毫克/升 乙醇胺(HCl)500毫克/升 Pluronic F-6810毫克/升檸檬酸鐵結(jié)果所得到的結(jié)果示于圖4。魚肉水解產(chǎn)物所產(chǎn)生的抗體蛋白質(zhì)的量是不同的。即，當(dāng)魚肉的酶促降解產(chǎn)物以白利1％(10克/升)的最終濃度加入時(shí)，產(chǎn)生量，按逐漸下降的次序，如下狐鰹＞護(hù)衛(wèi)鯖＞鱈魚＞鮭魚＞鯖魚＞沙丁魚。當(dāng)魚肉的酶促降解產(chǎn)物以白利1.5％(15克/升)的最終濃度加入時(shí)，產(chǎn)生量，按逐漸下降的次序，如下狐鰹＞護(hù)衛(wèi)鯖＞鱈魚＞鯖魚＞鮭魚＞沙丁魚。
前述試驗(yàn)表明，根據(jù)所用的魚肉類型，魚肉的酶促降解產(chǎn)物表現(xiàn)出對(duì)抗體蛋白質(zhì)產(chǎn)生量的不同影響，但是，對(duì)用編碼抗體蛋白質(zhì)的基因和dhfr選擇性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的dhfr(-)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)是有效的，和對(duì)抗體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生也是有效的。
權(quán)利要求
1．一種用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于含有魚肉的酶促降解產(chǎn)物或魚肉提取物。
2．如權(quán)利要求1所要求的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，它是通過培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有魚肉提取物。
3．如權(quán)利要求1所要求的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，它是通過培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有魚肉的酶促降解產(chǎn)物。
4．如權(quán)利要求3所要求的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、其中魚肉的酶促降解產(chǎn)物已經(jīng)通過用蛋白酶處理魚肉或魚肉提取物制得。
5．如權(quán)利要求4所要求的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其中蛋白酶是蛋白水解酶和/或肽酶。
6．如權(quán)利要求4所要求的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其中魚肉的酶促降解產(chǎn)物已經(jīng)通過用蛋白水解酶和接著用肽酶處理魚肉或魚肉提取物制得。
7．如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所要求的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，它是一種不合從哺乳動(dòng)物衍生的組分的培養(yǎng)基。
8．如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所要求的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，它含有氨基酸、維生素、脂質(zhì)因子、能源、滲透壓調(diào)節(jié)劑，鐵源和pH調(diào)節(jié)劑。
9．如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所要求的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其中的動(dòng)物細(xì)胞是已向其中轉(zhuǎn)導(dǎo)了一種編碼所需要的蛋白質(zhì)的基因的動(dòng)物細(xì)胞。
10．如權(quán)利要求9所要求的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其中所需要的蛋白質(zhì)是抗體或生理學(xué)活性物質(zhì)。
11．如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所要求的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其中動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
12．如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所要求的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其中魚肉是從選自包括狐鰹、護(hù)衛(wèi)鯖、鱈魚、鯖魚、鮭魚和沙丁魚中的組中的一個(gè)或多個(gè)成員衍生的。
13．一種通過培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)的方法，其中培養(yǎng)是通過使用用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基來實(shí)施的，該培養(yǎng)基的特征在于含有魚肉的酶促降解產(chǎn)物或魚肉提取物。
全文摘要
一種用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基,其特征在于含有魚肉的酶促降解產(chǎn)物或魚肉提取物,和一種通過使用該培養(yǎng)基生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1309698SQ99808576
公開日2001年8月22日 申請(qǐng)日期1999年6月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月1日
發(fā)明者澀谷和史, 熱海甲, 綱川惠之, 野垣兼朗 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社