專利名稱：一種酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶。本發(fā)明還涉及編碼該酶的核苷酸序列。
Boos和同事們?cè)?981和1982年(1，2)通過(guò)大腸桿菌E.coli中乙酰-輔酶A的乙酰基團(tuán)被轉(zhuǎn)移到麥芽糖上而證明了一種能夠使麥芽糖乙?；拿复嬖?。特別地，Boos等人(1)觀察到在E.coli中麥芽糖和寡聚麥芽糖苷(maltooligosides)積累后形成乙酰麥芽糖和乙酰寡聚麥芽糖苷(acetyl-oligomaltosides)。Boos等人(2)也觀察到當(dāng)把麥芽糖或麥芽三糖，乙酰-輔酶A和E.coli的細(xì)胞質(zhì)提取液混合后，形成了乙酰麥芽糖和乙酰寡聚麥芽糖苷。
Boos等人于1981年聲明對(duì)麥芽糖和麥芽糖糊精乙酰化作用的活性是未知的。但是，他們?cè)?982年(2)的進(jìn)一步的研究中，F(xiàn)eundlieb和Boos將這種未知的酶命名為“麥芽糖轉(zhuǎn)乙酰酶”，但是接著說(shuō)E.coli中的麥芽糖轉(zhuǎn)乙酰酶的功能尚不清楚。
后來(lái)Brand和Boos(3)分離出了缺少編碼麥芽糖轉(zhuǎn)乙酰酶基因的E.coli突變株。該突變株使他們能夠?qū)⒃摶蜃鲌D于E.coli連鎖圖上的10.4分鐘。另外，他們?cè)谝粋€(gè)高拷貝質(zhì)粒中克隆了含有該基因的一個(gè)3.4kb的DNA片段。然后從帶有上述質(zhì)粒的E.coli菌株無(wú)細(xì)胞提取液中將過(guò)量表達(dá)的麥芽糖轉(zhuǎn)乙酰酶純化至均質(zhì)。該酶被證明是一種有兩個(gè)相同的20kDa亞基的同源二聚體。該酶對(duì)底物葡萄糖，麥芽糖和乙酰-輔酶A的km(mM)和Vmax(μmol/min×mg酶)值分別是62和200，90和110，以及0.018和166。發(fā)現(xiàn)麥芽三糖和其它寡糖的乙酰化速率是所測(cè)定葡萄糖乙?；俾实?％。另外，Brand和Boos提供了下述相對(duì)乙酰化速率葡萄糖1，麥芽糖0.55，甘露糖0.2，果糖0.07，半乳糖0.04，麥芽三糖和其它寡聚麥芽糖0.02。寡糖是含有少于10個(gè)糖基的糖類。
盡管有這些發(fā)現(xiàn)，Brand和Boos沒(méi)有對(duì)編碼麥芽糖乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸及這種酶進(jìn)行測(cè)序。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性的酶，其中，該酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或其變體，同系物或片段。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性的重組酶，其中，該酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或其變體，同系物或片段。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性的重組酶，其中，該酶具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性的重組酶，其中，該重組酶同用本發(fā)明上述方面的純化的重組酶制備的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供了一種編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供了一種含有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列，或其變體，同系物或片段或者是同其互補(bǔ)的序列。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提供了一種具有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有或表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列或酶。
根據(jù)本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提供了一種載體，該載體含有或表達(dá)本發(fā)明的構(gòu)建體或核酸序列或酶。
根據(jù)本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提供了一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有或表達(dá)本發(fā)明的載體，構(gòu)建體，核苷酸序列或酶。
根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因生物，該轉(zhuǎn)基因生物含有或表達(dá)本發(fā)明的質(zhì)粒，載體，構(gòu)建體或核苷酸序列或酶。
根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，本發(fā)明提供了一種修飾糖(優(yōu)選為淀粉)，該修飾糖是用含有或表達(dá)或使用本發(fā)明的方法制備的。
本發(fā)明的酶可從任何一種細(xì)菌，真菌，藻類，酵母，或植物中獲得。優(yōu)選的，該酶從E.coli中獲得。
本發(fā)明的α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶有時(shí)被稱作Mac。編碼本發(fā)明α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶的基因有時(shí)被稱作mac基因。
優(yōu)選的，該酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或其變體，同系物或片段。
優(yōu)選的，該酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
優(yōu)選的，該酶由含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的核苷酸序列或者其變體，同系物或片段或者與其互補(bǔ)的序列所編碼，優(yōu)選的，該酶由如SEQ ID No.2所示的核苷酸編碼。
優(yōu)選的，該生物體是一種植物。
優(yōu)選的，該核苷酸序列是一種DNA序列。
所述酶或編碼它的核苷酸序列可以同一種或多種其它的酶或編碼它們的核苷酸序列相組合，用于體內(nèi)或體外，這些酶或編碼它們的核苷酸序列優(yōu)選是用重組DNA技術(shù)制備。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，在體內(nèi)酶促修飾反應(yīng)之后接著是一體外酶促修飾反應(yīng)。在這些修飾步驟中，不必使用相同的酶。
同所述酶相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“變體”，“同系物”或“片段”包括任何從所述序列中取代，變異，修飾，替代，缺失或添加一個(gè)(或多個(gè))氨基酸的序列，只要所得氨基酸序列具有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶的活性，優(yōu)選的至少具有同SEQ ID No.1所示的酶一樣的活性。尤其是，如果所得的酶具有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性，術(shù)語(yǔ)“同系物”則包括在結(jié)構(gòu)和/或功能上的同源性。就序列的同源性而言，優(yōu)選的是與SEQ ID No.1所示的序列具有至少75％的同源性，更優(yōu)選的是至少有85％的同源性，更優(yōu)選的是至少有90％的同源性。更優(yōu)選的是同SEQ ID No.1所示的序列具有95％的同源性，更加優(yōu)選的是具有98％的同源性。
同編碼所述酶的核苷酸序列相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“變體”，“同系物”或“片段”包括任何從該序列中取代，變異，修飾，替代，缺失或增加一個(gè)(或多個(gè))核苷酸的序列，只要所得到的核苷酸序列編碼一種具有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶的活性的酶，優(yōu)選至少具有同如SEQ IDNo.1所示的酶一樣的活性。尤其是，如果該所得核苷酸序列編碼一種具有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性的酶，術(shù)語(yǔ)“同系物”包括在結(jié)構(gòu)和/或功能上的同源性。就序列的同源性而言，優(yōu)選的是與SEQ IDNo.2所示的序列具有至少75％的同源性，更優(yōu)選的是至少有85％的同源性，更優(yōu)選的是至少有90％的同源性。更優(yōu)選的是同SEQ ID No.2所示的序列具有95％的同源性，更加優(yōu)選的是具有98％的同源性。
上述術(shù)語(yǔ)與所述序列的等位變異體是同義的。
術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”指的是本發(fā)明也包括能夠同本發(fā)明序列雜交的序列。
對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”包括基因組DNA，cDNA，合成DNA以及RNA。優(yōu)選的指的是DNA，更優(yōu)選的指的是編碼本發(fā)明序列的cDNA。
優(yōu)選的，所述核苷酸序列不是一個(gè)天然核苷酸序列。關(guān)于這一點(diǎn)，術(shù)語(yǔ)“天然核苷酸序列”是指一個(gè)處于其天然環(huán)境下的全長(zhǎng)核苷酸序列并且當(dāng)有效地連接到一個(gè)與其天然相關(guān)的完整啟動(dòng)子上時(shí)，該啟動(dòng)子也處于其天然環(huán)境中。
因此，本發(fā)明的酶可通過(guò)其天然生物體內(nèi)的核苷酸序列來(lái)表達(dá)，但是所述的核苷酸序列不在該生物體內(nèi)與其相關(guān)的啟動(dòng)子的控制之下。
本發(fā)明的酶可同其它的酶組合使用。
優(yōu)選的，所述酶不是天然酶。關(guān)于這一點(diǎn)，術(shù)語(yǔ)“天然酶”是指一種由其天然核苷酸序列所表達(dá)的處于其天然環(huán)境中的完整的酶。
術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建體”-與諸如“結(jié)合物”，“表達(dá)盒”以及“雜合體”的術(shù)語(yǔ)具有相同的含義-包括直接或間接與一個(gè)啟動(dòng)子相連或融合的核苷酸序列。間接相連的例子是提供象內(nèi)含子序列一樣的合適的間隔基團(tuán)，例如Sh1內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子，插入啟動(dòng)子和所述核苷酸序列之間。
在每種情況下，更優(yōu)選的是這些術(shù)語(yǔ)不包括編碼該酶的基因同野生型基因啟動(dòng)子均處于天然環(huán)境時(shí)它們之間通常的天然結(jié)合。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例涉及將本發(fā)明的核苷酸序列有效的連接到一個(gè)異源啟動(dòng)子上。
所述構(gòu)建體甚至可以含有或表達(dá)一種標(biāo)記物以便于從植物-如馬鈴薯中選擇出已經(jīng)被轉(zhuǎn)入其中的遺傳構(gòu)建體?，F(xiàn)有多種標(biāo)記物可供選用，比如那些編碼6-磷酸-甘露糖異構(gòu)酶(特別對(duì)于植物而言)或用于抗生素抗性-例如對(duì)G418，潮霉素，博來(lái)霉素，卡那霉素以及慶大霉素具有抗性的標(biāo)記物。
術(shù)語(yǔ)“載體”包括表達(dá)載體以及轉(zhuǎn)化載體。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指能夠在體內(nèi)或體外表達(dá)的構(gòu)建體。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化載體”是指能夠從一個(gè)物種轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種中的構(gòu)建體-例如從E.coli質(zhì)粒到土壤桿菌中再到植物中。
術(shù)語(yǔ)“組織”包括組織和器官，可以是分離出的組織或器官，也可以是在生物體內(nèi)的組織或器官。
本發(fā)明所涉及的術(shù)語(yǔ)“生物體”包括含有編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列的任何生物體和/或從中得到的產(chǎn)物，和/或其中本發(fā)明所述核苷酸序列在該生物體中能夠進(jìn)行表達(dá)。
優(yōu)選的生物是植物。
本發(fā)明中所涉及的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因生物體”包括含有編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列的任何生物體和/或從中得到的產(chǎn)物，和/或其中本發(fā)明的核苷酸序列在該生物體中能夠進(jìn)行表達(dá)。優(yōu)選的，所述核苷酸序列被整合到該生物體的染色體組中。
優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)基因生物是植物。
因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物包括含有編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列，本發(fā)明的構(gòu)建體，本發(fā)明的載體，本發(fā)明的質(zhì)粒，本發(fā)明的細(xì)胞，本發(fā)明的組織，或其產(chǎn)物之任何一種或其組合的生物。例如，該轉(zhuǎn)基因生物也可以含有在異源啟動(dòng)子控制下的編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列。所述轉(zhuǎn)基因生物不包括啟動(dòng)子和核苷酸序列對(duì)該生物均是天然的并且均處于它們的天然環(huán)境中的狀態(tài)下的編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列和啟動(dòng)子的結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是本領(lǐng)域常用的意思，例如Jacob-Mond的基因表達(dá)理論中的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。
所述啟動(dòng)子可以額外地具有一種或多種特性以確保或增強(qiáng)在適宜的宿主中的表達(dá)。例如，這些特性可以是諸如Pribnow框或TATA框的保守區(qū)。該啟動(dòng)子甚至可以帶有其它序列以影響(比如保持，增強(qiáng)，降低)本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)水平。例如，適宜的其它序列包括Sh1-內(nèi)含子或ADH-內(nèi)含子。其它的序列包括誘導(dǎo)因子-比如溫度，化學(xué)，光或激應(yīng)誘導(dǎo)因子。
也應(yīng)當(dāng)有促進(jìn)轉(zhuǎn)錄或翻譯的適宜因子存在。后面的因子的一個(gè)例子是TMV5’信號(hào)序列(見Sleat基因217217-225；以及Dawson植物分子生物學(xué)2397)。
因此，一方面，本發(fā)明的核苷酸序列是在啟動(dòng)子的控制之下，該啟動(dòng)子使所述核苷酸序列能夠表達(dá)。在這方面，該啟動(dòng)子可以是細(xì)胞或組織特異性啟動(dòng)子。例如，如果該生物是一種植物，那么該啟動(dòng)子是可以在種子，莖，塊莖，芽，根以及葉組織的任何一個(gè)或多個(gè)中影響該核苷酸序列的表達(dá)的啟動(dòng)子。
可以在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis T.(編者)的分子克隆。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約1989，中找到關(guān)于重組DNA技術(shù)的一般性指導(dǎo)。
雖然在EP-B-0470415和CA-A-2006454中沒(méi)有公開本發(fā)明的酶和核苷酸序列，但是兩個(gè)文件中的確提供了制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的有用的背景技術(shù)評(píng)論。這些背景技術(shù)指導(dǎo)中的一部分包括在下述評(píng)論中。
構(gòu)建遺傳修飾植物的基本原理是將遺傳信息插入到植物的染色體中并使插入遺傳材料能穩(wěn)定保持。
現(xiàn)有許多用作插入遺傳信息的技術(shù)，兩種主要的原理是遺傳信息的直接導(dǎo)入和用載體系統(tǒng)來(lái)導(dǎo)入遺傳信息。可以在Potrykus的文章(植物生理學(xué)分子生物學(xué)年報(bào)42205-225)和Christou的文章(農(nóng)業(yè)-食品-工業(yè)高技術(shù)3月/4月1994 17-27)中找到對(duì)這些常用技術(shù)的評(píng)論。
因此，一方面，本發(fā)明涉及一種攜帶有本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體的載體系統(tǒng)，該載體能夠?qū)⑺龊塑账嵝蛄谢驑?gòu)建體引入某種生物比如植物的染色體組中。
所述載體系統(tǒng)可以含有一個(gè)載體，但是也可以包括兩個(gè)載體。在含有兩個(gè)載體的情況下，通常將該載體系統(tǒng)稱作雙載體系統(tǒng)。Gynheung An等(1980)，在雙載體，植物分子生物學(xué)手冊(cè)A3，1-19一文中對(duì)雙載體系統(tǒng)作了進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
一個(gè)廣泛使用的以特定的啟動(dòng)子或核苷酸序列或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的系統(tǒng)是以使用來(lái)自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti質(zhì)?；騺?lái)自發(fā)根農(nóng)桿菌(agrobacteriumrhizogenes)的Ri質(zhì)粒為基礎(chǔ)的(An等(1986)，植物生理學(xué)，81，301-305以及Butcher D.N.等(1980)，植物病理學(xué)家組織培養(yǎng)方法，編輯Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。)已經(jīng)構(gòu)建了適用于構(gòu)建上述植物或植物細(xì)胞構(gòu)建體的幾種不同的Ti和Ri質(zhì)粒。
本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體應(yīng)優(yōu)選插入Ti質(zhì)粒的T-DNA末端序列或相鄰T-DNA序列之間，以避免緊鄰T-DNA邊緣的序列被破壞，因?yàn)橹辽倏雌饋?lái)這些區(qū)域之一對(duì)于修飾的T-DNA插入植物染色體組中是必需的。
從上述解釋中可以理解，如果該生物是一種植物，那么本發(fā)明的載體系統(tǒng)優(yōu)選含有對(duì)感染該植物所必需的序列(例如vir區(qū))以及至少一個(gè)T-DNA序列的邊緣部分，該邊緣部分位于同遺傳構(gòu)建體相同的載體上。
另外，該載體系統(tǒng)優(yōu)選是根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蛎r(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒或其衍生物，因?yàn)檫@些質(zhì)粒是公知的而且廣泛用于轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建，許多現(xiàn)有的載體系統(tǒng)是以這些質(zhì)?；蛩鼈兊难苌餅榛A(chǔ)的。
在轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建中，可將本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體在插入植物體之前首先在能夠使其復(fù)制并且易于擴(kuò)增的微生物中構(gòu)建。一個(gè)有用的微生物的例子是E.coli，但是也可以使用具有上述特性的其它微生物。當(dāng)在E.coli中構(gòu)建上述定義的載體系統(tǒng)中的載體時(shí)，如果需要，就將該載體轉(zhuǎn)入適宜的農(nóng)桿菌菌株中，例如根癌農(nóng)桿菌中。這樣，優(yōu)選的將帶有本發(fā)明核苷酸序列或構(gòu)建體的Ti-質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌菌株中，例如根癌農(nóng)桿菌中，以獲得帶有本發(fā)明核苷酸序列或構(gòu)建體的農(nóng)桿菌細(xì)胞，然后將該DNA轉(zhuǎn)入待修飾的植物細(xì)胞中。
如CA-A-2006454中所報(bào)道的，有大量的克隆載體可供選用，所述載體含有E.coli復(fù)制系統(tǒng)以及使轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠被選出的標(biāo)記物。所述載體包括例如pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。這樣，本發(fā)明的核苷酸或構(gòu)建體可以被導(dǎo)入所述載體中適宜的限制性位點(diǎn)上。將含有的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化E.coli。在適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些E.coli細(xì)胞然后回收并裂解。然后回收質(zhì)粒。作為一種分析方法，這里通常用序列分析，限制性分析，電泳和進(jìn)一步的生物化學(xué)分子生物學(xué)方法。每次操作后，用限制酶切割所用DNA序列并同另一個(gè)DNA序列連接起來(lái)?？蓪⒚總€(gè)序列克隆在相同或不同的質(zhì)粒中。
每次根據(jù)本發(fā)明的方法將構(gòu)建體或核苷酸序列引入植物后還可能需要存在和/或插入另外的DNA序列，例如，如果用Ti-或Ri-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，那么作為引入基因的側(cè)翼區(qū)，至少Ti-或Ri-質(zhì)粒T-DNA的右邊界而且通常是右邊界同左邊界應(yīng)被連接起來(lái)。已經(jīng)對(duì)用T-DNA進(jìn)行植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化有了深入細(xì)致的研究并在EP-A-120516中作了描述；見Hoekema的The Binary Plant Vector SystemOffset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第5章；Fraley，等，植物科學(xué)評(píng)論，41-46；以及An等，歐洲分子生物學(xué)雜志(1985)4277-284。
用土壤桿菌屬直接侵染植物組織是一種已被廣泛使用并且由Butcher D.N.等在(1980)，植物病理學(xué)家的組織培養(yǎng)方法，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208頁(yè)中作了描述的簡(jiǎn)單技術(shù)。對(duì)于這一主題的進(jìn)一步的介紹見Potrykus(植物生理學(xué)植物分子生物學(xué)年報(bào)42205-225)和Christou(農(nóng)業(yè)-食品-工業(yè)高技術(shù)3月/4月1994 17-27)。用這種技術(shù)，可侵染植物特定的部分或組織，即葉子，塊莖，根，莖的一部分或該植物的其它部分。
一般地，用帶有本發(fā)明核苷酸序列的農(nóng)桿菌屬直接侵染植物組織時(shí)，要用例如剃刀劃傷植物或用針刺破植物或用研磨劑對(duì)植物擦磨以使待侵染的組織受傷。然后用農(nóng)桿菌屬在傷口處接種。然后將被接種的植物或植物的一部分在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其發(fā)育成成熟的植物。
當(dāng)構(gòu)建植物細(xì)胞時(shí)，可根據(jù)公知的組織培養(yǎng)方法使這些細(xì)胞生長(zhǎng)并保存下來(lái)，比如將細(xì)胞在適宜的含有氨基酸，植物激素，維生素等必需的生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
用已知的用于由細(xì)胞或組織培養(yǎng)物再生植物的方法可使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成遺傳修飾過(guò)的植物，例如，用一種抗生素選擇出轉(zhuǎn)化的芽并在含有適宜營(yíng)養(yǎng)物，植物激素等的培養(yǎng)基中對(duì)其傳代培養(yǎng)。
在丹麥的專利申請(qǐng)No.940662(1994年6月10日申請(qǐng))和/或英國(guó)專利申請(qǐng)No.9702592.8(1997年2月7日申請(qǐng))中可找到對(duì)植物轉(zhuǎn)化的更進(jìn)一步的有用的介紹。
更可以參考Spngstad等(1995年植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)40第1到15頁(yè))，因?yàn)檫@些作者對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建作了一般性的綜述。
總之，本發(fā)明涉及一種具有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性的酶及編碼這種酶的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了可用該酶得到的修飾的糖類(優(yōu)選的是淀粉)。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1996年3月7日將下面的樣品保藏在位于23 St.Machar Drive，Aberdeen，蘇格蘭，英國(guó)，AB2 1RY的認(rèn)可的保藏機(jī)構(gòu)-國(guó)家工業(yè)及海洋細(xì)菌保藏有限公司(NCIMB)。
DH5α-pMAC3(它包含來(lái)自E.coli的含有mac基因的一個(gè)3.2kbEcoRI-Pst1片段)。
保藏號(hào)為NCIMB 40789。
相關(guān)的保藏質(zhì)粒是pMAC3。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1996年3月7日將下面的樣品保藏在位于23 St.Machar Drive，Aberdeen，蘇格蘭，英國(guó)，AB2 1RY的認(rèn)可的保藏機(jī)構(gòu)-國(guó)家工業(yè)及海洋細(xì)菌保藏有限公司(NCIMB)。
NF1830-pMAC5(含有E.coli的mac基因)。
保藏號(hào)為NCIMB 40790。
相關(guān)的保藏質(zhì)粒是pMAC5。
因此本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的方面涉及一種具有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性的酶，其中，所述酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或其變體，同系物，或其片段；并且所述酶是由可從保藏號(hào)NCIMB 40789或保藏號(hào)NCIMB 40790中得到的核苷酸序列所表達(dá)的。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選的方面涉及一種含有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列，或其變體，同系物，或其片段，或與其互補(bǔ)的序列；并且所述核苷酸序列可從保藏號(hào)NCIMB 40789或保藏號(hào)NCIMB40790中得到。
本發(fā)明還提供了用這一質(zhì)粒可得到的一種修飾糖類(優(yōu)選的是淀粉)。
現(xiàn)將本發(fā)明僅以舉例的方式予以描述，其中參考下列附圖

圖1顯示了相當(dāng)于SEQ ID No.2的核苷酸序列；圖2顯示了相當(dāng)于SEQ ID No.1的氨基酸序列；圖3顯示了含有相當(dāng)于SEQ ID No.2序列的核苷酸序列；圖4是pMAC1的質(zhì)粒圖譜；圖5是pMAC2的質(zhì)粒圖譜；圖6是pMAC3的質(zhì)粒圖譜；圖7是pMAC5的質(zhì)粒圖譜；圖8是pMAC8的質(zhì)粒圖譜；
圖9是pMAC9的質(zhì)粒圖譜；并且圖10是pMAC10的質(zhì)粒圖譜。
附圖的一些詳情如下圖1相當(dāng)于Seq ID No 2的核苷酸序列圖2相當(dāng)于Seq ID No 1的氨基酸序列183個(gè)氨基酸20076 MW圖4質(zhì)粒名稱pMAC1質(zhì)粒大小7.26kb說(shuō)明來(lái)自λ151的一個(gè)4.3kb的EcoR1片段插入pBluscript IISK+的EcoR1位點(diǎn)中。
圖5質(zhì)粒名稱pMAC2質(zhì)粒大小7.26kb說(shuō)明來(lái)自λ151(Kohara保藏中心)的一個(gè)4.3kb的EcoR1片段插入pBluscript II SK+的EcoR1位點(diǎn)中。
圖6質(zhì)粒名稱pMAC3質(zhì)粒大小7.26kb說(shuō)明從pMAC2中去除1.1kb的Pst1片段。
圖7質(zhì)粒名稱pMAC5質(zhì)粒大小4060bp說(shuō)明用下面的引物擴(kuò)增E.coli mac基因#B411(有EcoRI位點(diǎn)的上游引物)CGG AAT TCC GCC ATG AAG ACA TAC CC#B412(有HindIII位點(diǎn)的下游引物)CAC AAG CTT ATT TTG CAT AAC AGT TGC用pMAC3作模板。
用EcoR1和HindIII消化704bp的PCR產(chǎn)物并插入到用相同的限制酶消化的pUHE21-2中。
圖8質(zhì)粒名稱pMAC8質(zhì)粒大小4935bp說(shuō)明用下列引物并以pMAC3為模板擴(kuò)增E.coli的mac基因#B478 CGG GAT CCG AGC ACA GAA AAA GAA AAG ATG(有BamHI位點(diǎn)的上游引物)#B479 AAC TGC AGA TTT TGC ATA ACA GTT GC(有PstI位點(diǎn)的下游引物)用BamHI和PstI消化PCR產(chǎn)物并插入到用同樣的酶消化了的pBETP5中。
用引物#C028對(duì)SBE TP-mac融合物進(jìn)行控制測(cè)序用引物#B456或#C027對(duì)35S中止子-mac融合物測(cè)序。
圖9質(zhì)粒名稱pMAC9質(zhì)粒大小9.37kb說(shuō)明將來(lái)自pMAC8的2294bp的EcoRI片段(Patatin啟動(dòng)子-SBE TP-mac-35S終止子)插入到pVictor IV Man的EcoRI位點(diǎn)上。
圖10質(zhì)粒名稱pMAC10質(zhì)粒大小9.37kb說(shuō)明將pMAC8的2294bp的EcoRI片段(Patatin啟動(dòng)子-SBETP-mac-35S終止子)插入到pVictor IV Man的EcoRI位點(diǎn)上。
來(lái)自E.coli的mac基因的克隆與測(cè)序首先根據(jù)Boos和Brand的指導(dǎo)(3)，從Kohara保藏中心的λ噬菌體8C4(151)的4.3kb EcoRI片段中分離出mac基因(4)。將該片段以兩種取向插入到質(zhì)粒pBluescriptII SK(+)的EcoRI位點(diǎn)從而生成質(zhì)粒pMAC1和pMAC2(圖4和圖5)。當(dāng)E.coli攜帶這些質(zhì)粒時(shí)，麥芽糖乙酰轉(zhuǎn)移酶的量大大增高，說(shuō)明4.3kb EcoRI片段含有mac基因。
為了在4.3kb EcoRI片段上定位mac基因，從質(zhì)粒pMAC2中去除1.1kb的EcoRI片段。該質(zhì)粒構(gòu)建體pMAC3(圖6)也使有這種質(zhì)粒的菌株的麥芽糖轉(zhuǎn)乙酰酶表達(dá)量大大增高，因此證明mac基因存在于3.2kb的EcoRI-PstI片段上。
然后用A.L.F測(cè)序儀自動(dòng)測(cè)序以確定插入pMAC3的3.2kbEcoRI-PstI的核苷酸序列。3137bp的DNA序列揭示了E.coli acrB基因的3’端的372bp區(qū)以及可能分別編碼蛋白質(zhì)的124，126和183個(gè)氨基酸的三個(gè)開放閱讀框(圖3)。
相應(yīng)的，用含有pMAC3的E.coli小細(xì)胞做35S-甲硫氨酸標(biāo)記試驗(yàn)，表明具有相當(dāng)于這些分子量大小的蛋白質(zhì)的合成。
由于E.coli麥芽糖轉(zhuǎn)乙酰酶有一個(gè)估計(jì)分子量為20000的亞基(3)，預(yù)測(cè)編碼分子量為20073蛋白的183個(gè)密碼子(圖2)是mac基因。
Mac酶在E.coli中的過(guò)量表達(dá)為了純化Mac酶，在pUHE21-2中可被異丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)誘導(dǎo)的噬菌體T7-啟動(dòng)子之后插入mac基因，得到pMAC5(圖7)。當(dāng)向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入IPTG以誘導(dǎo)mac基因的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)獲得了pMAC5的E.coliNF1830菌株培養(yǎng)物(MC1000，recA1，F(xiàn)’lacIq1Ztm5，由哥本哈根大學(xué)的Niels Fiil惠贈(zèng))中有大量的麥芽糖轉(zhuǎn)乙酰酶。
生長(zhǎng)條件在NF1830-pMAC5的A1L LB培養(yǎng)基物添加氨芐青霉素(100μg/ml)及卡那霉素(25μg/ml)，并在37℃下強(qiáng)力振動(dòng)培養(yǎng)直到A600達(dá)到0.7。加入IPTG使最終濃度為2mM并繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。離心(4000×g下10分鐘)回收細(xì)胞并在200ml 0.9％的NaCl中重懸浮洗滌。然后將細(xì)胞沉淀物重懸浮于pH值為7.5并含有0.4mM PMSF，0.4mg/ml胃蛋白酶抑制劑以及1.6mM EDTA的250ml的20mM磷酸鉀中。用Vibra Cell VC600及19mm的High Gain Horn以及充填器(均由Sonics and Materials有限公司提供，美國(guó))將懸浮液用超聲處理5×1分鐘。在4℃下以90000×g離心60分鐘使細(xì)胞勻漿澄清，然后用0.22μm的濾膜過(guò)濾。
重組Mac的純化將所得的粗提取物以2ml/min的流速流經(jīng)用20mM pH 7.5的磷酸鉀(下文中稱作“緩沖液A”)平衡的Q-Sepharose 26/10柱(Pharmacia生物技術(shù)公司)。用300ml緩沖液A洗滌該柱并用線性梯度濃度為0到3M NaCl的緩沖液A(300ml)洗脫附著蛋白。收集具有酶活性的餾分以1ml/min的低流速使其流經(jīng)用緩沖液A平衡的8mlAffi-Gel Blue(Biorad)柱(16mm×26mm)。用50ml含有0.4M NaCl相同的緩沖液洗滌該柱。然后用含有2M NaCl的相同緩沖液洗脫該酶。在緩沖液A中將活性收集液透析過(guò)夜，并用Centriprep-30(Amico)濃縮到大約3ml。使餾分以0.3ml/min的低流速流經(jīng)用緩沖液A平衡的6ml Acetyl-coA-Minileak柱。室溫下在10ml pH 11的1M NaCO3中將200mg的Acetyl-coA和5g(干重)的Minileak High(Kem-En-Tek，丹麥)偶聯(lián)20小時(shí)制備成吸附樹脂。用20ml的緩沖液A洗滌該柱。然后倒置并用少于20ml的含有0.5M NaCl的緩沖液A洗脫純化酶。
經(jīng)三個(gè)層析步驟后，使純化的麥芽糖乙酰轉(zhuǎn)移酶變?yōu)榫|(zhì)。從1升培養(yǎng)基中我們能夠獲得5.8mg純化Mac?；厥章蕿?9％并且該酶被純化了80-倍。用SDS-PAGE和質(zhì)譜分析法來(lái)確定酶的純度。后一方法揭示分子量為19，982 Da。
酶濃度和活性的測(cè)定根據(jù)(5)的Mac的氨基酸組分的測(cè)定，以0.66為消先系數(shù)，用分光光度計(jì)法在280nm處確定純Mac溶液的濃度。按照改進(jìn)的Alpers的分析法(6)，用分光光度計(jì)分析Mac的乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。使用Perkin Elmer生產(chǎn)的Lambda 18分光光度計(jì)。總體積為1ml的分析混合物含有50mM的磷酸鉀，pH 7.5的2mM EDTA緩沖液，1M的麥芽糖100μl，0.4mM的乙酰-輔酶A 100μl，溶于甲醇的40mM的5，5’-二硫雙(2-苯甲酸)(DTNB)10μl以及10μl的酶。通過(guò)加入酶或麥芽糖來(lái)起始反應(yīng)并于25℃下在412nm處監(jiān)測(cè)。將25℃下每分鐘能提高一個(gè)吸光度的酶量定義為一個(gè)活性單位。為了計(jì)算乙酰輔酶A的消耗量，用13,600M-1×cm-1作為DTNB的消光系數(shù)。
對(duì)重組Mac的N-端測(cè)序用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的476A蛋白質(zhì)測(cè)序儀對(duì)純Mac的N-末端測(cè)序。在裝入測(cè)序儀前，用反向高效液相層析在C2柱(4.6/30)中將1納摩爾的蛋白質(zhì)脫鹽。已將Mac的N-端序列測(cè)定到殘基48并與mac基因(圖1)的核苷酸序列完全一致。而且，在成熟蛋白上沒(méi)有N-末端的甲硫氨酸殘基(圖2)。
用重組Mac生產(chǎn)多克隆抗體在6周中每隔2周用90μg被弗氏佐劑乳化(1∶1，體積比)的純化蛋白給兔子予以皮下注射免疫，此后免疫間隔時(shí)間為4周。用免疫印跡檢測(cè)Mac的抗血清并發(fā)現(xiàn)其具有高度的特異性。
重組Mac的性質(zhì)鑒定及活性分布圖經(jīng)質(zhì)譜研究表明Mac是一個(gè)三聚體。
在PhastGel IEF 4-6.5(Pharmacia)上通過(guò)等電聚焦測(cè)定Mac的等電點(diǎn)為5.7。
在含有100mM NaCl的50mM緩沖液中，麥芽糖濃度為100mM下，在pH為5和8.5之間研究Mac的pH值分布圖。在這樣的條件下，最佳pH值為7.7。
于25℃下在pH 3.0到10.0之間檢測(cè)pH的穩(wěn)定性。在pH為3.0時(shí)Mac馬上失活，但在pH 4.0到10.0之間至少穩(wěn)定6個(gè)小時(shí)。
pH為7.5時(shí)，在40℃和70℃之間研究Mac的熱穩(wěn)定性。在40℃和50℃下溫浴4小時(shí)后，Mac的剩余活性分別為100％和75％。其在60℃和70℃下的半衰期分別為70分鐘和22分鐘。
按照“酶的濃度及活性的測(cè)定”中所述的方法，通過(guò)測(cè)量不同糖(在50和100mM的濃度下)的乙?；跏妓俣葋?lái)研究糖乙?；荏w底物中優(yōu)選的Mac底物。結(jié)果如表1，2和3所示。在試驗(yàn)過(guò)的單糖中，葡萄糖是最佳底物，在試驗(yàn)過(guò)的二糖中，麥芽糖和異麥芽糖是最佳底物。
表1.以不同的單糖作為乙?；荏w時(shí)Mac的相對(duì)活性比較
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表2.以不同的二糖作為乙酰基受體時(shí)Mac的相對(duì)活性比較。
表3.以不同的寡聚麥芽糖作為乙?；荏w時(shí)Mac的相對(duì)活性比較。
動(dòng)力學(xué)研究對(duì)Mac催化乙酰化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究表明受體底物的Km值在mM的范圍而乙酰-輔酶A的Km值在μM的范圍。因此，Mac對(duì)于乙酰-輔酶A的親和性是對(duì)受體的親和性的1000倍。
NMR研究用Mac得到葡萄糖和麥芽糖的乙酰化產(chǎn)物，并對(duì)產(chǎn)物的1H-NMR結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)行研究。
為了研究關(guān)于Mac受體底物乙酰化位點(diǎn)的底物區(qū)域特異性，我們通過(guò)將10mg葡萄糖或麥芽糖同E.coliMac和1mg乙酰-輔酶A在pH7.5的磷酸緩沖液中一起溫浴48小時(shí)從而制備了毫克量的乙?；咸烟呛望溠刻?。在溫浴的過(guò)程中另加入1mg等分試樣的乙酰-輔酶A。通過(guò)薄層層析分離反應(yīng)物并從層析譜中分離出乙?；钠咸烟呛望溠刻遣⒗鋬龈稍?。用1H-NMR鑒定這些乙?；堑慕Y(jié)構(gòu)。葡萄糖僅在C6位置被乙?；?，麥芽糖的乙酰化位點(diǎn)在其非還原萄葡糖部分的C6位置。結(jié)果表明Mac乙?；堑腃6位點(diǎn)。
E.coli中的SBE-Mac融合體的活性由于下面描述的pMAC9和pMAC10中的SBE-Mac融合體的27個(gè)氨基酸的SBE部分會(huì)影響乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，為了使融合酶在E.coli中過(guò)量表達(dá)并分析其活性，將SBE-Mac融合體插入到E.coli表達(dá)載體pAL781(Invitrogene，San Diego，美國(guó))中。在SDS凝膠上比較大大過(guò)量表達(dá)的SBE-Mac融合體與純化的野生型Mac酶，結(jié)果表明由于增加的27個(gè)氨基酸使融合體的遷移速度略有降低。而且，融合體保持了麥芽糖作為乙?；孜锏哪芰?。因此，看起來(lái)E.coli中的融合酶是完整的并且具有完全的活性。所以，可以設(shè)想SBE-Mac融合酶在馬鈴薯中將是有活性的。
馬鈴薯淀粉的體內(nèi)修飾在我們的另外的正在審查之中的專利申請(qǐng)PCT/EP96/03053，PCT/EP96/03052，PCT/EP94/01082中(每個(gè)申請(qǐng)的內(nèi)容均被收作本文的參考文獻(xiàn))可以找到有關(guān)于馬鈴薯轉(zhuǎn)化的一般性介紹。
對(duì)本研究而言，采用下述方法。
構(gòu)建質(zhì)粒以在馬鈴薯中表達(dá)E.coli mac基因。
用下面的引物并以pMAC3作為模板擴(kuò)增E.coli mac基因5’-CGG GAT CCG AGC ACA GAA AAA GAA AAG ATG-3’(有BamHI位點(diǎn)的上游引物)和5’-AAC TGC AGA TTT TGC ATA ACA GTT GC-3’(有PstI位點(diǎn)的下游引物)。
用BamHI和PstI消化PCR產(chǎn)物并插入用同樣的酶消化的pBETP5(見PCT專利申請(qǐng)No.WO94/24292，該申請(qǐng)的內(nèi)容被收作本文的參考文獻(xiàn))中以得到pMAC8。這樣，mac基因插入到了可提供塊莖特異性表達(dá)-從patatin啟動(dòng)子開始并在CaMV 35S終止子處終止轉(zhuǎn)錄的表達(dá)盒中。而且，Mac酶同馬鈴薯淀粉分支酶N-端的102個(gè)氨基酸的融合，其中包括引導(dǎo)mac基因產(chǎn)物至馬鈴薯塊莖造粉體的75個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。在進(jìn)入造粉體中時(shí)，切除75個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，以得到具有來(lái)自成熟淀粉分支酶N-端的27個(gè)氨基酸的Mac融合蛋白。從pMAC8中分離出2294bp EcoRI表達(dá)盒并插入植物轉(zhuǎn)化載體pVictorIV Man的EcoRI位點(diǎn)中(見PCT專利申請(qǐng)No.WO 94/24292和英國(guó)專利申請(qǐng)No.951443.8，每個(gè)專利申請(qǐng)的內(nèi)容均被收作本文的參考文獻(xiàn))從而得到質(zhì)粒pMAC9和pMAC10(分別為圖9和圖10)。
馬鈴薯小塊莖的制備含有節(jié)(nodium)的片段-即從該節(jié)上部2mm到其下部5mm的片段-從體外生長(zhǎng)的馬鈴薯植物或甘露糖選擇根上切出的片段(關(guān)于甘露糖選擇我們以前的專利申請(qǐng)WO 93/05163和/或WO 94/20627)上切下的。從所述節(jié)段上去除葉子后垂直放在含有MS培養(yǎng)基(Sigma)的瓊脂平板上，該培養(yǎng)基添加每升60g的蔗糖和每升2mg的6-芐基-氨基嘌呤。在20℃下使所述節(jié)段以16小時(shí)的光照周期和8小時(shí)的黑暗周期生長(zhǎng)7天。然后，用鋁箔將平板包起來(lái)并置于20℃下的黑暗中。28天后收集小塊莖并用蛋白質(zhì)印跡分析以檢測(cè)Mac的表達(dá)。
馬鈴薯小塊莖中SBE-Mac融合物的表達(dá)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析用E.coli麥芽糖乙酰轉(zhuǎn)移酶制備的抗體和E.coli mac基因的表達(dá)以檢測(cè)被構(gòu)建體pMAC9和pMAC10轉(zhuǎn)化的馬鈴薯小塊莖。分析結(jié)果清楚地證明了5個(gè)MAC9小塊莖中的3個(gè)和7個(gè)MAC10小塊莖中的5個(gè)明顯有E.coli麥芽糖乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。陽(yáng)性小塊莖表達(dá)了209個(gè)氨基酸的SBE-Mac融合物，該融合物同一個(gè)在E.coli中表達(dá)的相似構(gòu)建體共遷移。這些結(jié)果表明最初同209個(gè)氨基酸的SBE-Mac融合體融合的75個(gè)氨基酸的SBE轉(zhuǎn)運(yùn)肽已從SBE-融合體中去除。而且，這意味著在造粉體細(xì)胞膜中的信號(hào)肽酶正確地對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)行了處理，并且SBE-Mac融合體已經(jīng)被引入造粉體中。
馬鈴薯塊莖提取物的免疫印跡在冰中用20％的三氯乙酸將0.5ml馬鈴薯蛋白提取物沉淀30分鐘。離心后回收蛋白質(zhì)沉淀并在50μl SDS-PAGE樣品緩沖液中重懸浮。然后向15％的聚丙烯酰胺凝膠中加入25μl。在電泳后通過(guò)半干印跡把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Problot PVDF膜上。為了進(jìn)行免疫檢測(cè)，將Mac抗血清稀釋為1∶2000，并把第二抗體同堿性磷酸酶偶合。
同上述的小塊莖的蛋白質(zhì)印跡分析相一致，轉(zhuǎn)基因塊莖的蛋白質(zhì)印跡分析清楚地證明了209個(gè)氨基酸的SBE-Mac融合體在塊莖中得到表達(dá)。
用馬鈴薯塊莖分析Mac的活性選出可大小相當(dāng)?shù)鸟R鈴薯塊莖并切成片，并用研缽和研杵或電動(dòng)搗碎機(jī)使其在提取物緩沖液和Dower(1％，w/vol)中形成勻漿。每克馬鈴薯用5ml提取緩沖液(50mM磷酸鉀pH7.5，2mM EDTA，0.5mMPMSF)。將混合物置于冰上30分鐘并通過(guò)離心去除不溶物。用BCA試劑(Pierce)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
用如下方法測(cè)定Mac的活性，重復(fù)2次或3次在微量滴定板加樣孔中混合0，50，100或200μl馬鈴薯提取物，1mM的乙酰-輔酶A10μl，1M的葡萄糖25μl以及試驗(yàn)緩沖液(50mM的磷酸鉀，2mM的EDTA，pH 7.5)并使每個(gè)加樣孔中的總體積為250μl。加入乙酰-輔酶A以起始反應(yīng)。在室溫下反應(yīng)10分鐘后，加入4mM的新制備的DTNB并立即測(cè)量A405值。給每一次測(cè)試準(zhǔn)備兩個(gè)加樣孔，一個(gè)有葡萄糖一個(gè)沒(méi)有。從含有葡萄糖的加樣孔的吸光度中扣除不含葡萄糖加樣孔的吸光度(背景吸光度)從而計(jì)算出活性。
9個(gè)轉(zhuǎn)基因塊莖中的8個(gè)可測(cè)定到相當(dāng)高的Mac活性水平。一些塊莖的Mac活性高于在未轉(zhuǎn)化塊莖中發(fā)現(xiàn)的幾乎可忽略的活性15到20倍。
粘度研究用水懸浮液淀粉粘度測(cè)定儀Newport Scientific Rapid ViscoAnalyser對(duì)未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯和根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的馬鈴薯的塊莖中的淀粉樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明轉(zhuǎn)化的馬鈴薯中的淀粉與未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯的淀粉的粘度測(cè)定圖譜不同。
DSC研究用差分掃描比色法對(duì)未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯和本發(fā)明轉(zhuǎn)化的馬鈴薯的塊莖中的淀粉樣品進(jìn)行分析(用10％w/w的水淀粉懸浮液)。將樣品以每分鐘10℃的速度從20℃加熱到100℃。所得結(jié)果表明轉(zhuǎn)化的馬鈴薯淀粉與未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯淀粉具有不同的焓。我們也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化馬鈴薯的淀粉同未轉(zhuǎn)化馬鈴薯的淀粉相比較，其凝膠化溫度也有差別。
對(duì)本發(fā)明的其它的修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。參考文獻(xiàn)1.Boos W.，F(xiàn)erenci T.和Shuman H.A.1981.細(xì)菌學(xué)雜志146，725-732。
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7.Ogasawara N.，Nakai S.和Yoshikawa H.1994，DNA研究1，1-14。序列SEQUENCE ID NO.1氨基酸序列MSTEKEKMIAGELYRSADETLSRDRLRARQLIHRYNHSLAEEHTLRQQIL 50ADLFGQVTEAYIEPTFRCDYGYNIFLGNNFFANFDCVMLDVCPIRIGDNC 100MLAPGVHIYTATHPIDPVARNSGAELGKPVTIGNNVWIGGRAVINPGVTI 150GDNVVVASGAVVTKDVPDNVVVGGNPARIIKKL 183SEQUENCE ID NO.2核苷酸序列ATGAGCACAG AAAAAGAAAA GATGATTGCT GGTGAGTTGTATCGCTCGGC AGATGAGACG TTATCTCGCG ATCGCCTGCGCGCTCGTCAG CTTATTCACC GATACAATCA TTCCCTGGCGGAAGAGCACA CATTACGCCA GCAAATTCTC GCTGATCTATTCGGTCAGGT GACAGAGGCT TATATTGAGC CAACGTTTCGCTGTGACTAT GGCTATAACA TTTTTCTCGG TAATAATTTTTTCGCCAACT TCGATTGCGT GATGCTTGAT GTCTGCCCTATTCGCATCGG TGATAACTGT ATGTTGGCAC CAGGCGTTCATATCTACACG GCAACACATC CCATCGACCC TGTAGCACGTAATAGCGGTG CTGAACTGGG GAAACCCGTC ACCATCGGTAATAACGTCTG GATTGGCGGA CGCGCGGTCA TTAACCCTGGTGTGACCATT GGTGATAACG TCGTGGTAGC CTCAGGTGCAGTTGTCACAA AAGATGTCCC GGACAACGTT GTCGTGGGCGGTAATCCAGC CAGAATAATT AAAAAATTGT AASEQUENCE ID NO.3核苷酸序列pMAC3中的3.2kb EcoRI-Pst片段的全長(zhǎng)核苷酸序列GAATTCGCCA AAGACTTGAT GGATAAAGAA GGTAAAGGTC TGATTGAAGC GACGCTTGAT60GCGGTGCGGA TGCGTTTACG TCCGATCCTG ATGACCTCGC TGGCGTTTAT CCTCGGCGTT 120ATGCCGCTGG TTATCAGTAC TGGTGCTGGT TCCGGCGCGC AGAACGCAGT AGGTACCGGT 180GTAATGGGCG GGATGGTGAC CGCAACGGTA CTGGCAATCT TCTTCGTTCC GGTATTCTTT 240GTGGTGGTTC GCCGCCGCTT TAGCCGCAAG AATGAAGATA TCGAGCACAG CCATACTGTC 300GATCATCATT GATACAACGT GTAATCACTA AGGCCGCGTA AGCGGCCTTT TTTATGCATA 360ACCTACGAAC ATTAAGGAGT AATTGAACCA CCAACTCAGG ATCTCATACG AAAACCAGTA 420TTAACCACGG ATAAAATTCA TAAAAAATAC TGATTGTTAG TTAATTTATA TTAAGTAGCG 480CTAATAGATT TAATAATCCA TAATCATTTA GAGGCTATTC TTAATTATTT GCGGTAATTC 540TTTATTCATT CCTCGGTTAT TACGTCATAT TCAGAGCAAT CCTGGTATTA GTGTCACCAA 600TTTCATCTGG CGATAATCCT GAAATGTTAT GAATAGTTCG AGCAAACTGC TTTTACCTGC 660TGCGGGTTAG TGCTAGTATG AAAAAGTGAG TCCTGTCCCG CTTCCTTCCT AATTGTAATT 720TTTCGTAATA ATGCGATGAA AACCTGCAAA GAGTGGCTTA TAGTTAAGCT AACAAACGAG 780AGGGCAAGTC CAGGTCAGTA AGTTTTTTCC ATCCCGAAAG GTGTCCGTTA GTTCAACCGC 840TAAGAAGGGG ACGCGTTATG GATGAATACT CACCCAAAAG ACATGATATC GCACAGCTTA 900AGTTTCTCTG TGAAACCCTG TATCATGACT GCCTTGCAAA CCTTGAAGAA AGCAATCATG 960GCTGGGTAAA CGACCCAACC TCGGCGATCA ACCTCCAGTT GAATGAACTG ATTGAGCATA 1020TTGCGACCTT CGCACTTAAT TACAAAATTA AGTATAATGA AGACAATAAG CTCATTGAGC 1080AGATCGACGA ATATCTGGAT GACACCTTTA TGTTGTTCAG TAGTTATGGT ATTAATATGC 1140AGGATCTTCA GAAATGGCGG AAGTCAGGTA AHCGACTATH CCGTTGTTTT GTCAATGCGA 1200CGAAAGAGAA TCCTGCGAGT TTATCTTGTT AGAATTATTA CAACCATAGG TAGAAGTATG 1260TCCGAAAAAC CTTTAACGAA AACCGATTAT TTAATGCGTT TACGTCGTTG CCAGACAATT 1320GACACGCTGG AGCGGTTTAW TCGAGAAAAA TAAATACGAA TTATCAGATA ATGAACTGGC 1380GGTATTTTAC TCAGCCGCAG ATCACCGCCT CGCCGAATTG ACCATGAATA AACTGTACGA 1440CAAGATCCCT TCCTCAGTAT GGAAATTTAT TCGCTAATAA ATAATTCGCT TTCGGAGCTA 1500TAACCGGCTG TTTATTAAGA ATTTTATACT TTTTCGCCAT GAAGACATAC CCTATGTGAT 1560CTTTATCACA CAGATGTAAT GGGAACGTTC TCTTCACTGA CTTTTCGTCT TACTGTGTTG 1620CCGCATTTTC AGCAACCGGA GTCAGTAATG AGCACAGAAA AAGAAAAGAT GATTGCTGGT 1680GAGTTGTATC GCTCGGCAGA TGAGACGTTA TCTCGCGATC GCCTGCGCGC TCGTCAGCTT 1740ATTCACCGAT ACAATCATTC CCTGGCGGAA GAGCACACAT TACGCCAGCA AATTCTCGCT 1800GATCTATTCG GTCAGGTGAC AGAGGCTTAT ATTGAGCCAA CGTTTCGCTG TGACTATGGC 1860TATAACATTT TTCTCGGTAA TAATTTTTTC GCCAACTTCG ATTGCGTGAT GCTTGATGTC 1920TGCCCTATTC GCATCGGTGA TAACTGTATG TTGGCACCAG GCGTTCATAT CTACACGGCA 1980ACACATCCCA TCGACCCTGT AGCACGTAAT AGCGGTGCTG AACTGGGGAA ACCCGTCACC 2040ATCGGTAATA ACGTCTGGAT TGGCGGACGC GCGGTCATTA ACCCTGGTGT GACCATTGGT 2100GATAACGTCG TGGTAGCCTC AGGTGCAGTT GTCACAAAAG ATGTCCCGGA CAACGTTGTC 2160GTGGGCGGTA ATCCAGCCAG AATAATTAAA AAATTGTAAT CGGTTTTTCG CAACTGTTAT 2220GCAAAATTGT GGTAGATCTG TTACTTCCCC TCTACTATTC CCACGTTAAA ATAGGGTGTT 2280CCCTGGAAAG TTGCAGATAC CACGAAGGCA AACGATGACC GAAATACAAC GCCTGCTGAC 2340CGAAACGATT GAGTCTCTGA ATACCCGCGA AAAACGCGAC AACAAACCCC GCTTTAGTAT 2400CAGTTTTATC CGTAAACATC CGGGGCTGTT TATCGGTATG TACGTTGCTT TTTTTGCCAC2460CCTGGCGGTG ATGTTGCAGT CCGAAACGCT GTCAGGCTCT GTCTGGCTAC TGGTTGTATT2520ATTTATCCTG CTTAATGGTT TCTTCTTTTT CGATGTCTAC CCACGCTACC GCTATGAAGA2580TATCGACGTG CTGGATTTCC GCGTTTGCTA TAACGGCGAA TGGTACAACA CGCGCTTTGT2640ACCTGCCGCG CTGGTTGAAG CCATCTTGAA CTCTCCGTGT CGCGGATGTT CATAAGGAAC2700AACTGCAAAA AATGATCGTC CGTAAAGGTG AACTGTCTTT TTACGATATT TTTACCCTCS2760TCGCGCCGAA TCAACATCTT AAGTTAGGGT TACATACCAG GCGTAAAGCT CTGCGCCTGG2820TCAAATGACA ATGATCGTTT CCACCCATCA CTTCATGAAA TACCAGCTCT ACCTCCTTAT2880CTCCAGCCAG CCTTTTTCCA CAATCAGATA TACTTTCCCT ACACTGTGTT AATAAGGATA2940TGCTGGTGAG AACACGACAT CTGGTCGGCC TTATTTCGGG AGTACTGATT CTTTCAGTAT3000TGCTGCCTGT CGGCTTAAGC ATCTGGCTGG CCCATCAGCA GGTAGAAACA TCGTTTATTG3060AAGAGCTGGA TACCTATTCC TCCCGCGTCG CTATTCGAGC CAATAAGGTG GCGACACAAG3120GGAAAGATGC GCTGCAG 3137SEQUENCE ID NO.4pMAC3中的3.2kb EcoRI-Pst片段的全長(zhǎng)核苷酸序列。在mac基因編碼序列下也給出了由其編碼的Mac酶的氨基酸序列。GAATTCGCCAAAGACTTGATGGATAAAGAAGGTAAAGGTCTGATTGAAGCGACGCTTGAT 60GCGGTGCGGATGCGTTTACGTCCGATCCTGATGACCTCGCTGGCGTTTATCCTCGGCGTT 120ATGCCGCTGGTTATCAGTACTGGTGCTGGTTCCGGCGCGCAGAACGCAGTAGGTACCGGT 180GTAATGGGCGGGATGGTGACCGCAACGGTACTGGCAATCTTCTTCGTTCCGGTATTCTTT 240GTGGTGGTTCGCCGCCGCTTTAGCCGCAAGAATGAAGATATCGAGCACAGCCATACTGTC 300GATCATCATTGATACAACGTGTAATCACTAAGGCCGCGTAAGCGGCCTTTTTTATGCATA 360ACCTACGAACATTAAGGAGTAATTGAACCACCAACTCAGGATCTCATACGAAAACCAGTA 420TTAACCACGGATAAAATTCATAAAAAATACTGATTGTTAGTTAATTTATATTAAGTAGCG 480CTAATAGATTTAATAATCCATAATCATTTAGAGGCTATTCTTAATTATTTGCGGTAATTC 540TTTATTCATTCCTCGGTTATTACGTCATATTCAGAGCAATCCTGGTATTAGTGTCACCAA 600TTTCATCTGGCGATAATCCTGAAATGTTATGAATAGTTCGAGCAAACTGCTTTTACCTGC 660TGCGGGTTAGTGCTAGTATGAAAAAGTGAGTCCTGTCCCGCTTCCTTCCTAATTGTAATT 720TTTCGTAATAATGCGATGAAAACCTGCAAAGAGTGGCTTATAGTTAAGCTAACAAACGAG 780AGGGCAAGTCCAGGTCAGTAAGTTTTTTCCATCCCGAAAGGTGTCCGTTAGTTCAACCGC 840TAAGAAGGGGACGCGTTATGGATGAATACTCACCCAAAAGACATGATATCGCACAGCTTA 900AGTTTCTCTGTGAAACCCTGTATCATGACTGCCTTGCAAACCTTGAAGAAAGCAATCATG 960GCTGGGTAAACGACCCAACCTCGGCGATCAACCTCCAGTTGAATGAACTGATTGAGCATA1020TTGCGACCTTCGCACTTAATTACAAAATTAAGTATAATGAAGACAATAAGCTCATTGAGC1080AGATCGACGAATATCTGGATGACACCTTTATGTTGTTCAGTAGTTATGGTATTAATATGC1140AGGATCTTCAGAAATGGCGGAAGTCAGGTAAHCGACTATHCCGTTGTTTTGTCAATGCGA1200CGAAAGAGAATCCTGCGAGTTTATCTTGTTAGAATTATTACAACCATAGGTAGAAGTATG1260TCCGAAAAACCTTTAACGAAAACCGATTATTTAATGCGTTTACGTCGTTGCCAGACAATT1320GACACGCTGGAGCGGTTTAWTCGAGAAAAATAAATACGAATTATCAGATAATGAACTGGC1380GGTATTTTACTCAGCCGCAGATCACCGCCTCGCCGAATTGACCATGAATAAACTGTACGA1440CAAGATCCCTTCCTCAGTATGGAAATTTATTCGCTAATAAATAATTCGCTTTCGGAGCTA1500TAACCGGCTGTTTATTAAGAATTTTATACTTTTTCGCCATGAAGACATACCCTATGTGAT1560CTTTATCACACAGATGTAATGGGAACGTTCTCTTCACTGACTTTTCGTCTTACTGTGTTG 1620CCGCATTTTCAGCAACCGGAGTCAGTAATGAGCACAGAAAAAGAAAAGATGATTGCTGGT 1680M S T E K E K M I A GGAGTTGTATCGCTCGGCAGATGAGACGTTATCTCGCGATCGCCTGCGCGCTCGTCAGCTT 1740E L Y R S A D E T L S R D R L R A R Q LATTCACCGATACAATCATTCCCTGGCGGAAGAGCACACATTACGCCAGCAAATTCTCGCT 1800I H R Y N H S L A E E H T L R Q Q I L AGATCTATTCGGTCAGGTGACAGAGGCTTATATTGAGCCAACGTTTCGCTGTGACTATGGC 1860D L F G Q V T E A Y I E P T F R C D Y GTATAACATTTTTCTCGGTAATAATTTTTTCGCCAACTTCGATTGCGTGATGCTTGATGTC 1920Y N I F L G N N F F A N F D C V M L D VTGCCCTATTCGCATCGGTGATAACTGTATGTTGGCACCAGGCGTTCATATCTACACGGCA 1980C P I R I G D N C M L A P G V H I Y T AACACATCCCATCGACCCTGTAGCACGTAATAGCGGTGCTGAACTGGGGAAACCCGTCACC 2040T H P I D P V A R N S G A E L G K P V TATCGGTAATAACGTCTGGATTGGCGGACGCGCGGTCATTAACCCTGGTGTGACCATTGGT 2100I G N N V W I G G R A V I N P G V T I GGATAACGTCGTGGTAGCCTCAGGTGCAGTTGTCACAAAAGATGTCCCGGACAACGTTGTC 2160D N V V V A S G A V V T K D V P D N V VGTGGGCGGTAATCCAGCCAGAATAATTAAAAAATTGTAATCGGTTTTTCGCAACTGTTAT 2220V G G N P A R I I K K LGCAAAATTGTGGTAGATCTGTTACTTCCCCTCTACTATTCCCACGTTAAAATAGGGTGTT 2280CCCTGGAAAGTTGCAGATACCACGAAGGCAAACGATGACCGAAATACAACGCCTGCTGAC 2340CGAAACGATTGAGTCTCTGAATACCCGCGAAAAACGCGACAACAAACCCCGCTTTAGTAT 2400CAGTTTTATCCGTAAACATCCGGGGCTGTTTATCGGTATGTACGTTGCTTTTTTTGCCAC 2460CCTGGCGGTGATGTTGCAGTCCGAAACGCTGTCAGGCTCTGTCTGGCTACTGGTTGTATT 2520ATTTATCCTGCTTAATGGTTTCTTCTTTTTCGATGTCTACCCACGCTACCGCTATGAAGA 2580TATCGACGTGCTGGATTTCCGCGTTTGCTATAACGGCGAATGGTACAACACGCGCTTTGT 2640ACCTGCCGCGCTGGTTGAAGCCATCTTGAACTCTCCGTGTCGCGGATGTTCATAAGGAAC 2700AACTGCAAAAAATGATCGTCCGTAAAGGTGAACTGTCTTTTTACGATATTTTTACCCTCS 2760TCGCGCCGAATCAACATCTTAAGTTAGGGTTACATACCAGGCGTAAAGCTCTGCGCCTGG 2820TCAAATGACAATGATCGTTTCCACCCATCACTTCATGAAATACCAGCTCTACCTCCTTAT 2880CTCCAGCCAGCCTTTTTCCACAATCAGATATACTTTCCCTACACTGTGTTAATAAGGATA 2940TGCTGGTGAGAACACGACATCTGGTCGGCCTTATTTCGGGAGTACTGATTCTTTCAGTAT 3000TGCTGCCTGTCGGCTTAAGCATCTGGCTGGCCCATCAGCAGGTAGAAACATCGTTTATTG 3060AAGAGCTGGATACCTATTCCTCCCGCGTCGCTATTCGAGCCAATAAGGTGGCGACACAAG 3120GGAAAGATGCGCTGCAG 313權(quán)利要求
1.一種具有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性的酶，其中所述酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或其變體，同系物或片段。
2.一種具有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性的重組酶，其中，所述酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或其變異體，同系物或片段。
3.一種具有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性的重組酶，其中，所述酶具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
4.一種具有α(1，4)葡聚糖乙酰-轉(zhuǎn)移酶活性的重組酶，其中，所述重組酶可同用根據(jù)權(quán)利要求3所述的純化的重組酶制備的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。
5.一種編碼如權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的酶的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列是一個(gè)DNA序列。
7.一種核苷酸序列，含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或其變異體，同系物或片段或與其互補(bǔ)的序列。
8.一種具有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列。
9.一種含有或表達(dá)本發(fā)明權(quán)利要求1到8的任何一個(gè)的構(gòu)建體。
10.一種含有或表達(dá)本發(fā)明權(quán)利要求1到9的任何一個(gè)的載體。
11.一種含有或表達(dá)本發(fā)明權(quán)利要求1到10的任何一個(gè)的質(zhì)粒。
12.一種含有或表達(dá)本發(fā)明權(quán)利要求1到11的任何一個(gè)的轉(zhuǎn)基因生物。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述轉(zhuǎn)基因生物是一種植物。
14.一種制備修飾糖類(優(yōu)選的是淀粉)的方法，所述方法包括或表達(dá)或使用根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求1到13中的任何之一。
15.一種實(shí)質(zhì)上如本文所描述的酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酶。該酶具有α(1,4)葡聚糖乙酰－轉(zhuǎn)移酶活性。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1259997SQ97194352
公開日2000年7月12日 申請(qǐng)日期1997年3月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月13日
發(fā)明者F·達(dá)爾德甘, P·鮑爾森, J·馬庫(kù)森, S·奧克森波爾·索倫森 申請(qǐng)人:丹尼斯科有限公司