專利名稱：由sod族衍生的寡核苷酸類的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用超氧物歧化酶(SOD;EC 1.15.1.1)基因體系作為靶來檢測和分化病原和非病原生物體，這些生物體包括細菌、真菌及原生動物類。另一方面，本發(fā)明涉及由SOD基因族衍生的寡核苷酸類。更具體地講，本發(fā)明涉及能夠同單鏈核酸序列(靶序列)雜交的寡核苷酸類，單鏈核酸序列可以用聚合酶鏈反應(PCR)及一對引物通過擴增和變性編碼超氧物歧化酶(SOD)的基因片段而獲得。第一個引物含有下列序列作為引物序列5′-AGC TTC ACC ACA GCA AGC ACC A-3′(Seq.Id.No.1;Z205)而第二個引物含有下列序列作為引物序列5′-TCGGTCC CAG TTC ACG ACA6TTC CA-3′(Seq.Id.No.2;Z212)這些寡核苷酸類可以以引物和探針的形式使用以擴增和檢測由SOD基因衍生的靶序列，特別是由病原生物體類(包括細菌、真菌及原生動物)的SOD基因衍生的靶序列。本發(fā)明的引物和探針也可以用來擴增和檢測由非病原生物體SOD基因衍生的靶序列。
本發(fā)明的目的是前面提到的寡核苷酸類;基于這些寡核苷酸類的引物和探針;用來擴增和檢測由SOD基因衍生的靶序列以及診斷由原核生物體類而引起的感染的方法、試劑和試劑盒;所說的寡核苷酸類在前面提到的各種目的中的應用。
SOD是一個酶，它催化超氧化物自由基(O-2)的歧化，產生如下的分子氧和過氧化氫
所得的過氧化物然后再被過氧化氫酶或過氧化物酶轉變成H2O。超氧化物(O-2)是有氧呼吸的毒性副產物，它與過氧化物(O2-2)反應會對蛋白質類、類脂類和核酸類造成損害。超氧物歧化酶(SOD)通過將超氧化物轉變成分子氧和過氧化物而抑制了自由基的有毒作用。
術語“聚合酶鏈反應”或“PCR”指得是擴增一個或多個特定核酸序列的過程。其中(1)決定待擴增序列未端的寡核苷酸引物與實驗樣品中的單鏈核酸類退火，(2)一種核酸聚合酶使退火后引物的3′-端延伸，產生一核酸鏈，該鏈與同引物退火的核酸序列互補，(3)生成的雙鏈核酸經變性產生兩條單鏈核酸，(4)引物退火、引物延伸和產物變性過程重復足夠多次，生成容易鑒別和測定量的序列，該序列是由引物限定的。接續(xù)的退火、延伸和變性步驟的實際控制是通過改變反應容器的溫度實現(xiàn)的，通常是以重復的循環(huán)方式實現(xiàn)的。退火和延伸最適宜發(fā)生在37℃-80℃的溫度范圍(準確值依賴于引物濃度和序列)，而變性需要的溫度范圍是80℃-100℃(準確值依賴于靶序列和濃度)。
術語“寡核苷酸”是指一個單鏈核酸，它含有兩個或多個脫氧核糖核苷酸，例如引物、探針、待檢測的核酸片段和核酸控制。一個寡核苷酸的大小由多種因素決定，且依賴于該寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸類可以用任何適宜的方法制備，例如，包括克隆、適當序列的限定和直接化學合成。直接化學合成方法有磷酸三酯法(Narang等人，Meth Enzymol.68，90-99(1979));磷酸二酯法(Brown等人，Meth.Enzymol.68，109-151(1979));氨基磷酸二乙酯法(Beaucage等人，Tetrahedron Lett.22，1859-1862(1981));以及美國專利說明書第4，458，066號中所述的固相載體法。
術語“引物”指一個寡核苷酸，不管是天然的，還是合成的，它能在一定條件下作為DNA合成的起始點。在該條件下可誘導與核酸鏈互補的引物延伸產物的合成，即在適當緩沖液和適宜溫度下在不同的三磷酸核苷類和聚合試劑(如DNA聚合酶或逆轉錄酶)存在下。引物的適宜長度依賴于其預期的用途，但典型地是從15到40個核苷酸。短的引物分子通常需要較低的溫度來與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復合物。一個引物不必反映模板的準確序列，但必須是充分地互補以與模板雜交，并用來在所選擇的反應條件下起始DNA合成。
術語“引物”可以指不只一個引物，特別是在這樣的情況，其中待擴增的靶區(qū)域的一端或兩端的信息不清楚。假如一個保留區(qū)域顯示出顯著的種群多態(tài)性水平，則可以制備引物混合物來擴增這樣的序列，或者引物可被設計成擴增甚至錯配的序列。如果需要，引物可以被標記，方法是摻入可以通過放射性、分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段檢測的標記物。例如，有用的標記物包括32P、熒光染料、電子致密試劑、酶類(常用于ELISAs)、生物素或半抗原和蛋白質類，抗血清或單克隆抗體是適宜的半抗原和蛋白質。標記物也可以用來“捕獲”引物，以促使引物或引物延伸產物(如擴增的DNA)在一種固相載體上定位。
術語“探針”指一種寡核苷酸，它包含一個雜交序列，此序列可以與靶序列的一部分互補。寡核苷酸可以用標記物標記，或接到一固相載體上。依賴用于檢測在探針和核酸序列間形成的雜交體的測定方法，除雜交區(qū)域外，探針還可以含有附加的特性。例如，在斑點印跡法中，探針一般被標記。如果探針先被固定，像下面所述的“逆向”斑點印跡法中那樣，探針也可含有長的多聚-dT臂，此臂可以經照射被固定在尼龍載體上，此技術在PCT專利公報No.89/11548上進行了更詳細的描述。探針的合適長度依賴于其預期的用途，但一般為15-40個核苷酸。短的探針分子通常需要較低的溫度以與靶分子形成足夠穩(wěn)定的雜交復合物。一個探針不必反映模板的準確序列，但必須充分地互補以與靶序列雜交。
本發(fā)明的探針可以使用上述用于合成寡核苷酸類的技術進行合成和標記。例如，通過把探針與32P-ATP和激酶一起溫育，探針可以在5′-端標記上32P。一個適宜的探針非放射性標記物是辣根過氧化物酶(HRP)。制備和檢測含有此種標記物的探針的方法在美國專利說明書第4，914，210號和第4，962，02號中進行過描述。有關此標記探針的應用的進一步信息參見美國專利說明書第4，789，630號;Saiki等人，N.Eng.J.Med.319，537-541(1988);及Bugawan等，Biol/Technology6，943-947(1988)。有用的色原包括紅色染料隱色基和3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。Helmuth描述了PCR產物的非同位素檢測方法(PCR Protocols，San.Diego，California，Academic Press，Inc.1990，pp.119-128)。
本發(fā)明優(yōu)選的寡核苷酸類是那些能與靶序列的一個區(qū)域雜交的寡核苷酸類，此靶序列在不同生物體(如細菌、真菌和原生動物(通用引物))的SOD基因中基本上得到保留，或者此靶序列在屬于一個特定屬的不同種的SOD基因中基本上得到保留(屬特異寡核苷酸類);以及那些能與靶序列的一個區(qū)域雜交的寡核苷酸類，而此序列在一定程度上是可變的，即允許屬于一特定屬的不同種的SOD基因的分化(種特異寡核苷酸類)。
能夠與單鏈核酸序列(靶序列)雜交的寡核苷酸類是特別優(yōu)選的，而此靶序列是使用聚合酶鏈反應(PCR)和一對引物，通過擴增編碼分枝桿菌種的超氧物歧化酶(SOD)的基因片段獲得的，第一個引物含序列Seq.Id.No.3(Z261，見表17)作為引物序列，第二個引物含上面序列Seq.Id.No.2(Z212)作為引物序列。其中，具有以下特點的寡核苷酸是更加優(yōu)選的能與靶序列的一個區(qū)域雜交，此序列在屬于分枝桿菌屬的不同種的SOD基因中是基本上得到保留的(屬特異寡核苷酸類)，和能夠與靶序列的一個區(qū)域雜交，此序列在一定程度上是可變的，即允許屬于分枝桿菌屬的不同種的SOD基因的分化(種特異寡核苷酸類)。
像早些時候提到的，本發(fā)明的寡核苷酸類可以引物和探針的形式用于擴增和檢測由病原生物體和非病原生物體的SOD基因衍生來的靶序列。病原生物體包括細菌、真菌和原生動物。在一個優(yōu)選的方面，靶核酸是通過PCR，并使用一對引物進行擴增的，這對引物允許屬于一特定屬的不同種的SOD基因片段的擴增。然后，屬檢測可以通過將擴增的核酸與屬特異探針混合并檢測是否存在雜交來完成的，而種的鑒定是通過測定擴增的核酸與種特異探針雜交的類型來完成。
在一特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及能以引物和探針的形式使用，以擴增和檢測靶序列的寡核苷酸類。此靶序列是由分枝桿菌種(優(yōu)選病原分枝桿菌種)的SOD基因衍生而來的。靶核酸通過PCR用一對引物擴增，這對引物允許屬于分枝桿菌屬的不同分枝桿菌種的SOD基因片段的擴增。優(yōu)選的是，這對引物的組成是第一個引物，它含有作為引發(fā)序列，基本上與序列Seq.Id.No.3(Z261)同源的序列;第二個引物，它含有作為引發(fā)序列，基本上與序列Seq.Id.No.2(Z212)同源的序列。更優(yōu)選的是，這對引物由作為引發(fā)序列的含有序列Seq.Id.No.3(Z261)的第一引物和含有序列Seq.Id.No.2(Z212)的第二引物組成。
然后屬檢測可以通過將擴增的核酸與屬特異探針混合以及檢測雜交是否存在來完成。屬特異探針由作為雜交序列的寡核苷酸序列Seq.Id.No.4組成，優(yōu)選探針庫，它包含作為雜交序列的寡核苷酸序列Z310-Z317(表18)。種鑒定可以通過測定擴增的核酸與種特異探針的雜交類型來完成，這種種特異探針能與靶序列的一個區(qū)域雜交，此靶序列在一定程度上是可變化的，即允許屬于分枝桿菌屬的不同種的SOD基因的分化。
本發(fā)明可以利用的優(yōu)選種特異探針是那些含有作為雜交序列，基本上與以下序列同源的序列的探針對于胞內分枝桿菌為5′-CCT TCG GAT CCT TCG ACC GGT TCC GCG CGC AGT TCA G-3′(Z303，Seq.Id.No.13);對于結核分枝桿菌為5′-GCT AGG CAT TGT TCC GCT GCT GCT GC-3′(Z336，Seq.Id.No.17)和5′-ACG AAC TTC CCG CTA GGC ATT GTT CCG CTG CTG CTG C-3′(Z302，Seq.Id.No.22)及5′-AGT CGA CTT TGC CAA GGC GTT T-3′(Z337，Seq.Id.No.23);對于偶發(fā)分枝桿菌為5′-ACG ACA GCC TGG GCG ATC GGC T-3′(Z369，Seq.Id.No.21);對于戈氏分枝桿菌為5′-TCT GCG CGC CCG GTT GCT CAC CTT T-3′(Z366，Seq.Id.No.15);對于蟾分枝桿菌為5′-TCC GCG ATC GTC GGG CAT GAG AAG GCC CTC GCG TTC A-3′(Z309，Seq.Id.No.18);對于瘰疬分枝桿菌為5′-TGA CAC ACT CGG CAG CAG GCT GCT CAC CTT CCA GCT T-3′(Z306，Seq.Id.No.20);對于猿分枝桿菌為5′-GTC CCC GAA CGG CGG AGA CAA GCC GAC CGG AGA TCT C-3′(Z304，Seq.Id.No.16);對于堪薩斯分枝桿菌為5′-CCA GAC GAA CTT TCC ACT CGG A-3′(Z340，Seq.Id.No.19);以及對于鳥分枝桿菌/布蘭分枝桿菌為5′-GTC CTT CGA CAA GTT CCG AGC GCA ATT CAG CGC CGC C-3′(Z301，Seq.Id.No.14)。
在用引物Z205和Z212得到的擴增子(amplicon)的序列內的其它區(qū)域也可以用來設計種特異探針。
本發(fā)明提供的診斷由病原生物體引起的感染的方法由幾步組成擴增靶序列(如果存在的話)，并通過探針雜交測定來檢測和鑒定擴增子(如果有的話)。
本發(fā)明的一個重要方面是編碼SOD的基因片段的擴增。使用本發(fā)明者應當注意，盡管聚合酶鏈反應是優(yōu)選的擴增方法，但是一個樣品中靶序列的擴增可以用任何已知方法來完成，例如，連接酶鏈反應(LCR)、轉錄擴增和自身連續(xù)序列復制以及其他此處未列出的方法。每一種方法都提供了足夠的擴增，以使靶序列能通過核酸與一個或多個合適探針雜交而得到檢測。
盡管PCR方法在本領域中是公知的(參見美國專利說明書第4，683，195號;4，683，202號和4，965，188號)，下面仍提供一些一般的PCR知識，目的是讓那些不熟悉PCR方法的人弄清楚并完全了解本發(fā)明。
為了通過PCR來擴增樣品中的靶核酸序列，此序列必須容易接近擴增體系的組分。總之，這種可及性通過從樣品中分離核酸類得到保證。各種從生物樣品中抽提核酸類的技術在本領域中都是已知的。例如，參見Higuchi等在PCR Technology(Erlich ed.，Stockton Press，New York，1989)中描述的技術。另外，如果樣品很易破壞，核酸在用PCR技術擴增前不必純化，即如果樣品是由細胞組成，特別是由末梢血液淋巴細胞或aminiocytes組成，那么細胞內組分的溶胞作用和分散可以僅僅通過把細胞懸浮在低滲緩沖液中就可完成。
PCR的每一個循環(huán)都包括由引物延伸形成的核酸雙鏈的解鏈。在PCR方法的一個優(yōu)選實施方案中，鏈解離是通過加熱反應到足夠高的溫度，并持續(xù)有效的時間以引起雙鏈變性，但不會造成聚合酶的不可逆變性(參見美國專利說明書第4，965，188號)，這樣來完成。典型的熱變性包括溫度范圍約80°到105℃，時間從幾秒到幾分鐘。然而，鏈解離也可用任何適宜的變性方法來實現(xiàn)，這包括物理、化學或酶方法。例如，鏈解離可(例如)由解旋酶(helicase)，或一個能表現(xiàn)解旋酶活性的酶誘導。例如，酶RecA在ATP存在下有解旋酶活性。適合解旋酶鏈解離的反應條件在本領域中是已知;參見Kuhn Hoffman-Berling，CSH-Quantitative Biology 43，63-67(1978)和Radding，Ann.Rev.Genetics 16，405-436(1982)。
然而，不管怎樣達到鏈解離，一旦鏈分開，PCR的下一步包括解離的鏈與同靶序列相接的引物的雜交。然后引物被延伸，形成靶鏈的互補拷貝。對于成功的PCR擴增，引物是如此設計的每一個引物沿雙鏈序列雜交的位置是由一個引物合成的延伸產物，一旦從模板(補體)上解離，可以作為另一引物延伸的模板。變性、雜交和延伸的循環(huán)按需要重復許多次以獲得期望量的擴增核酸。
在足量的三磷酸脫氧核糖核苷(通常是dATP，dGTP，dCTP和dTTP;如果結合下面描述的UNG凈化系統(tǒng)，dUTP用來代替dTTP，或除dTTP外再加入dUTP)及在由適宜的鹽類、金屬陽離子和pH緩沖體系組成的反應介質中，用聚合試劑催化PCR中依賴于模板的引物延伸。適宜的聚合試劑是催化依賴模板的DNA合成中已知的酶。適合于DNA模板使用的聚合酶的實例包括大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ或此酶的Klenow片段、T4DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶、從水棲熱菌中分離出的一個熱穩(wěn)定DNA聚合酶。后一種酶廣泛用于核酸類的擴增和測序。對于使用Taq DNA聚合酶的反應條件是在本領域中已知的，并在上述Gelfand，PCR Technology(1989)中進行了描述。其它熱穩(wěn)定聚合酶也可以是適宜的。
PCR方法可以逐步的方式進行(其中在每一步后都加入新試劑);或以將所有試劑同時加入的方式;或以部分逐步方式進行(其中新鮮試劑或不同試劑是在一給定數(shù)目步驟之后加入)。例如，如果鏈解離由熱引起，并且聚合酶是熱敏感的，那么聚合酶不得不在鏈解離每一回合后加入。然而，假如(例如)一解旋酶用于變性，或如果一種熱穩(wěn)定聚合酶用于延伸，那么所有試劑開始就可以加入，或者，用另一種方法，如果試劑的摩爾比對反應重要，那么可以定期補充試劑，因為它們在合成反應中被耗盡。
本領域的普通技術人員將知道PCR方法最常使用熱穩(wěn)定酶作為一種自動化方法進行。在此方法中，反應混合物的溫度通過變性區(qū)、引物退火區(qū)和反應區(qū)進行循環(huán)。特別適合于熱穩(wěn)定酶使用的儀器(熱循環(huán)器)可以購買到。
本領域的普通技術人員也會意識到PCR的污染問題，它來自前幾步反應擴增的核酸。減少這一問題的方法是讓酶降解任何來自前幾步反應擴增的DNA。PCR擴增是在dUTP而不是dTTP存在下進行的，所產生的雙鏈含尿嘧啶的產物易于被尿嘧啶N-糖基酶(glycosylase)(UNG)降解，而正常含胸腺嘧啶的DNA不能被UNG降解。在擴增開始前，向擴增反應混合物中加入UNG，會降解所有可能作為靶的含尿嘧啶的DNA。由于含尿嘧啶的DNA的唯一來源是在先反應的擴增產物，這一方法有效地凈化反應混合物，消除來自在先反應的污染問題(遺留物)。UNG可被熱暫時失活，因此在擴增過程中的變性步驟也可用作使UNG失活。因此，通過摻入尿嘧啶，新的擴增產物在無UNG的環(huán)境中生成且不被降解。
在本方法的成功實施中，本發(fā)明的另一重要方面是探針雜交。本發(fā)明的寡核苷酸探針特定地與一待檢測和鑒定的生物體的SOD基因的特殊片段雜交，并且就屬特異探針來說，該探針同來自不同生物體的序列有足夠的去穩(wěn)定的錯配;而就種特異探針來說，該探針與相同屬的其他種生物體的序列有足夠的去穩(wěn)定錯配。
通過測定探針是否結合到存在于樣品中的序列上，本發(fā)明的探針能用于確定核酸序列中是否在樣品中存在。為了本發(fā)明目的，用于檢測在探針和樣品中核酸序列間形成的雜交體的合適測定方法在本領域中是已知的。例如，該檢測可通過Southern印跡法和使用斑點印跡法的液體雜交法來實現(xiàn)。在斑點印跡法中，未標記的擴增樣品結合到固相載體上，例如膜，此膜與標記的探針在適宜的雜交條件下溫育，未雜交的探針通過洗滌除掉，并監(jiān)測濾器以確定結合探針的存在。當用少量探針分析多倍樣品時，例如許多樣品用屬特異探針篩選以確定一個特殊屬的核酸的存在就是這種情況，斑點印跡法是相當有用的。
當要使用許多不同探針時，一個可供替代的方法相當有用。這種方法是一種“逆”斑點印跡，其中擴增的序列含有一個標記物，并且探針結合到固相載體上。在此方法中，未標記的探針結合到膜上，并在適宜的雜交條件下暴露于標記的樣品中。未雜交的標記樣品然后在適宜條件下通過洗滌除去，并且隨后監(jiān)視濾器以確定結合序列的存在。因為種的確定對每一擴增樣品來說都需要使用多倍種特異探針，逆斑點印跡法在這一步是優(yōu)選的實驗方法。
或者理想的是可以使用具有許多探針雜交位點或孔的檢測方法。例如，一種固相載體，如微滴定板在本方法的大規(guī)模臨床應用中特別有用。PCR擴增的DNA的雜交/捕獲方法或固相載體是已知的。在這些方法的一個實施方案中，擴增的靶DNA在PCR反應的擴增過程中被標記(如用生物素)。標記的DNA通過PCR產物的雜交特定地被捕獲到一靶特異寡核苷酸捕獲探針上，此探針已被結合到微滴定板孔上。此結合產物根據(jù)所用的標記物的類型進行適當?shù)貦z測。例如，如果用生物素做標記物，則加入抗生物素蛋白HRP復合物并將其與下列兩者之一反應(a)過氧化氫底物和鄰苯二胺(OPD)色原，或(b)過氧化氫底物和四甲基聯(lián)苯胺色原(TMB)。發(fā)展起來的彩色測量信號可以用作PCR擴增的DNA的定量檢測。
正如在實驗室中所實踐的那樣，利用微滴定板測定的檢測方法可對大范圍的靶標準化?？紤]到所用探針的長度，為保證最大專一性，有必要分別確定適宜的雜交和嚴格的條件。
在另一適宜的測定體系中，在PCR擴增過程中加入標記的探針。在每一合成步驟中，任何與靶DNA雜交的探針都可以被用于催化引物延伸的聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性降解。然后檢測來自探針的降解產物。因此，降解產物的存在表明在探針和靶DNA之間的雜交發(fā)生了。
在發(fā)明還涉及成套試劑，它們用于擴增編碼超氧物歧化酶(SOD)的基因片段，尤其是分枝桿菌種的SOD的基因片段，還涉及用于檢測分枝桿菌種和區(qū)分屬于分枝桿菌屬的不同種的成套試劑。
用于擴增的成套試劑包含本發(fā)明的引物，即一對通用引物和/或一對適于擴增屬于一種特殊屬的不同種的SOD基因片段的引物，特別是一對適于擴增分枝桿菌種的SOD基因片段的引物。它們也可以任選包含一個DNA聚合酶，例如，前面提到的DNA聚合酶之一，和/或上面提到過的底物三磷酸核苷和/或用于PCR的合適緩沖液。除以上組分外，這些成套試劑也可以含有執(zhí)行本發(fā)明的擴增的指令。
檢測分枝桿菌種的成套試劑包含一個或多個屬特異探針，特別是本發(fā)明的屬特異探針庫。在某些情況下，探針可以被固定在一合適的載體膜上。試劑盒的其它任選組分包括，例如用于標記和/或檢測標記物的方法(例如，一個抗生物素蛋白-酶結合物、酶底物和色原，如果標記物是生物素)和用于雜交反應的合適緩沖液。除以上組分外，成套試劑也可以含有執(zhí)行本發(fā)明的檢測方法的指令。
用于區(qū)分屬于分枝桿菌屬的不同種的成套試劑包含一個或多個本發(fā)明的種特異探針。在某些情況下，探針可以被固定在一合適的載體膜上，試劑盒的其它任選組分包括，例如用于標記和/或檢測標記物的方法(例如，一個抗生物素蛋白-酶結合物、酶底物和色原，如果標記物是生物素)和用于雜交反應的合適緩沖液。除以上組分外，成套試劑也可含有執(zhí)行本發(fā)明的區(qū)分方法的指令。
此外，用于檢測分枝桿菌種以及用于區(qū)分屬于分枝桿菌屬的不同種的成套試劑也可以含有一個或多個上面提到的用于擴增的成套試劑的組分。
在本發(fā)明的其它實施方案中，用于擴增、檢測和區(qū)分的成套試劑也可以含有陽性和/或陰性對照。陽性對照優(yōu)選包括一核酸序列，它可利用用于擴增試驗樣品中所期望的靶核酸類的相同引物對進行擴增。使用陽性對照的方法(其中可以存在或不存在的靶以及陽性對照使用相同引物對)對于本領域的普通技術人員是已知的。陽性對照的優(yōu)選設計是使產物DNA具有與靶的大小易于區(qū)分的顯然有別的大小，或以對于本領域普通技術人員已知的方式修飾(突變/限定位置)。
下列實施例是為了更詳細地描述本發(fā)明。它們只用于說明目的，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例1用引物Z205和Z212擴增分枝桿菌SOD-序列引物是利用DNA合成試劑盒在MilliGen/Biosearch Cyclone Plus合成儀上合成的，序列最多達50個核苷酸(Millipore GmbH，Eschborn FRG)。此寡核苷酸類用25%NH4OH從柱體上洗脫下，真空干燥，并溶解(未經進一步純化)至最終濃度為20μM。
將約1ng預先純化的表1a所列的分枝桿菌種和表2a所列的非分枝桿菌種的染色體DNA，按下面的循環(huán)程序，在熱循環(huán)儀480(Perkin Elmer)中通過PCR擴增在98℃加熱5分鐘(初變性)，冷至55℃，然后加入5U Taq聚合酶(Perkin Elmer AG，Küsnacht，Switzerland)，并循環(huán)35次，其條件是在94℃30秒(變性);在37-55℃30秒(退火);在72℃30秒(延伸)，并在72℃保持10分鐘。
一個標準的PCR反應組成是10μl 10X緩沖液(100mM Tris;室溫下pH＝8.3;500mM KCl;15mM MgCl2;0.015%明膠)，16μl脫氧核糖核苷酸混合液(dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1.25μmol)，5μl引物Z205(20μM)，5μl引物Z212(20μM)，10μl待擴增的DNA和53μlH2O。10μl的擴增后混合物上樣到1%瓊脂糖凝膠上，在200V分離，用123bp和1kb帶作為大小標準(Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg)。適當分離后，凝膠用溴化乙錠染色并拍照。進一步實驗細節(jié)見Molecular Cloning，1989，J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis;(eds.);Cold Spring Harbor Laboratory Press.
結果匯集在表1a和2a中，“+”表示得到了可見的擴增子。在37℃的退火溫度下，使用引物對Z205和Z212時，來自被試的分枝桿菌的27個不同種(列于表1a中)及列于表2a中全部106個非分枝桿菌種的所有DNA樣品，在染色凝膠上都有可見的擴增子。最主要的(和大多數(shù)情況下唯一可見的片段)是一個與預期擴增子共遷移的DNA片段，該擴增子是來自結核分枝桿菌的489bp，跨越結核分枝桿菌序列的188至678區(qū)域。因此，引物對Z205和Z212可以認為是通用引物。
實施例2用引物Z205和Z212從所選細菌所獲得的擴增子的克隆及測序在下面所列9種分枝桿菌種中的結核分枝桿菌和4種非分枝桿菌種的SOD基因中，相應于188至666位置的區(qū)域用引物對Z205和Z212擴增。擴增子然后克隆、測序如下結核分枝桿菌(ATCC 1400);鳥分枝桿菌(ATCC 25291);胞內分枝桿菌(DSM 43223);瘰疬分枝桿菌(ATCC 19981);堪薩斯分枝桿菌(DSM 43224);偶發(fā)分枝桿菌(ATCC 6841);猿分枝桿菌(ATCC 25275);戈氏分枝桿菌(DSM 610);蟾分枝桿菌(ATCC 19250);白喉棒狀桿菌(ATCC 11913);假白喉棒狀桿菌(RC 181);星狀諾卡氏菌(ATCC 43005)和粘性放線菌(Actinomyces Viscosus)(ATCC 15987)。
操作細節(jié)可在前面參考的實驗室提南中找到“Molecular Cloning”。約lng來自13個前面所列生物體的染色體DNA像實施例1中描述的那樣進行擴增。PCR擴增子的可能缺損端用四種脫氧核苷酸(dNTP)和Klenow聚合酶來填補。未摻入的引物和dNTP通過稀釋反應并遵照生產商(Diagen，Dü sseldort，F(xiàn)RG)的建議使反應液流過Quiagen tip 5而從擴增子中分離出來。洗脫并沉淀的DNA溶解并用5′-端標記試劑盒(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，F(xiàn)RG)磷酸化。經填補和激酶的擴增子在NuSieve CTG瓊脂糖(FMC，BioProducts Europe，Vallensbaek Strand，Denmark)上電泳分離，并將與結核分枝桿菌的489bp片段共遷移的擴增子切下。將DNA從膠片中回收，并用上面所述Quiagen tip 5純化。沉淀后得到的小球溶解、定量并用于聯(lián)結。
質粒pUC19用SmaⅠ消化完全，用苯酚抽提、沉淀，并在用小牛胸腺堿性磷酸酶脫磷酸化前溶解。載體DNA再經苯酚抽提、沉淀，稀釋到約1ng/μl。載體制備中所用的載體DNA和全部酶來自Boehringer Mannheim(Mannheim，F(xiàn)RG)。
被消化和脫磷酸化的載體DNA用1U T4-連接酶在22℃經18小時連接到純化的SOD擴增子上。DH5a反應潛能細胞(Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，USA)用2-5μl連接酶混合物轉化，并依供者建議接種于含X-gal、IPTG和α-氨基芐青霉素的LB-瓊脂上(詳細內容見“Molecular Cloning)。
從13個克隆的擴增子的每一個轉化中，挑出10個(無色的)重組克隆并分別在含200μl LB-肉湯的微量滴定板孔內生長。粗DNA樣品用煮沸-冰凍方法處理，合適等分的DNA溶液未經進一步純化用pUC-測序和逆測序引物(Boehringer Mannheim;Mannheim，F(xiàn)RG)通過PCR擴增。13個不同擴增中，每個都有兩孔含有期望插入的592bp大小的質粒(103bp來自多克隆位點，而489bp來自SOD擴增子)，它們用于進一步測序。從上列13種不同生物體中每個得到的2個獨立克隆的重組質粒DNA，用Quiagen“質?！贝笤噭┖?Diagen，Dü sseldorf，F(xiàn)RG)純化，并遵照生產商(Boehringer Mannheim，Mannheim，F(xiàn)RG)建議用帶S35的pUC測序試劑盒采用雙脫氧法測序。


圖1顯示用于測序的引物位置。除了在pUC19(pUC正向和pUC反向)的多克隆位點退火的兩個引物外，用于克隆的同樣兩個引物(Z205和Z212)也用于測序反應。對所有分枝桿菌種和星狀諾卡氏菌，還用另外兩個正向引物(Z256和Z243)和一個反向引物(Z244)。這一策略可使測序膠獲得完美的重疊閱讀而在任一反應中只有大約150bp被閱讀。專門用于來自剩余共棲細菌的SOD-擴增子的測序的引物位置也在圖1中表示出來(白喉棒狀桿菌用Z257和Z245，假白喉棒狀桿菌用Z258和Z247，粘性放線菌用Z246)。表3給出所有SOD基因中測序引物的序列。因為引物Z212含2個可變堿基，使確保來自13個種中每一個種的兩個獨立克隆的測序成為可能。
從來自9種分枝桿菌和4種非分枝桿菌種的26個克隆中，讀出全部29.1kb。表4-16顯示其一致序列。
實施例3比較SOD序列以確定分枝桿菌特異的PCR引物表4-16中所示的每一個SOD序列被排列起來以利于相互比較，目的是為了確定分枝桿菌屬成員中顯著同源性的區(qū)域以及與非分枝桿菌種相應區(qū)域比較時的顯著異源性。用GCG-程序(Genetics Computer Group Sequence Analysis software，Version 7.1，Dervereux等，NAR 12，387-395(1984);GAP-Alignment)進行排列。
以這種方式可得到分枝桿菌屬的所有27種特異的引物，這使通過引物與保留區(qū)域退火連接的SOD編碼序列片段得到擴增，這些在分枝桿菌屬中的保留區(qū)域當與那4個測出序列的非分枝桿菌種的相應區(qū)域比較時顯示出許多錯配。所以，由那些準則選擇出的引物很有可能會阻止非分枝桿菌種的擴增。
選出的引物序列(Z261和Z212)是測試它們擴增所有27種分枝桿菌(表1a)能力的幾個組合之一，而不是93個非分枝桿菌靶DNA(表2a)的引物序列組合。這兩個引物之一(Z212)用于擴增分枝桿菌和非分枝桿菌DNA。Z212的序列與結核分枝桿菌SOD基因中位置677-655對應。來自分枝桿菌和非分枝桿菌種的DNA擴增的差別對待取決于反引物Z261(在結核分枝桿菌SOD基因中位置是245-269)。表17顯示Z261序列與分枝桿菌屬的9個測序種和4個所選非分枝桿菌種中的錯配。隨著兩個可變堿基(位置249和264)的引人，9個測序的分枝桿菌種中最多存在2個錯配。引物3′-端的最后5個核苷在所有9個測序的分枝桿菌中是得到保留的。
實施例4用屬特異引物Z261和Z212擴增利用來自結核分枝桿菌的DNA，用引物對Z261/Z212獲得的擴增子長為434bp。用來自結核分枝桿菌、胞內分枝桿菌、白喉棒狀桿菌、星狀諾卡氏菌的DNA以及人DNA作為典型試驗DNA，并用實施例1中所描述的PCR標準條件，對屬特異擴增的退火溫度進行優(yōu)化。對于下列溫度進行了評估37℃、45℃、50℃、55℃、58℃、60℃、64℃、67℃和70℃。在非嚴格溫度(37℃和45℃)下用非分枝桿菌DNA可見的擴增子在較高的退火溫度(＞58℃)下開始消失。在64℃仍能用人DNA看到一系列片段，而在67℃便不存在了。引物對Z261和Z212采用60℃或67℃。在60℃時擴增子的可見量較高，盡管67℃顯然是差別更分明溫度。最適宜的鎂濃度是1.5mM。所以，屬特異引物(Z261和Z212)的最后循環(huán)程序是在98℃加熱5分鐘，冷至55℃，加入1μl Taq(5U)并擴增35個循環(huán)，其條件是在94℃、60℃或67℃、72℃各30秒，隨后72℃溫育10分鐘。
結果匯集在表1a和2a中，“+”表示得到了可見的擴增子，而“-”表示沒有或得到很少的擴增子。所有27種分枝桿菌種用屬特異引物Z261和Z212擴增，退火溫度是67℃(表1a)，同時通過凝膠電泳證實。然而，用鱈分枝桿菌、海分枝桿菌和嗜血分枝桿菌在凝膠上得到的信號比另外24個種的信號要弱。增加循環(huán)時間到1分鐘后，也可得到所討論的這3個種的可見信號。
根據(jù)在瓊脂糖凝膠上不存在可見信號，斷定引物Z261和Z212不擴增106個非分枝桿菌種中的102個(表2a)。為了保證PCR反應中加入可擴增物質的正確用量，用引物對Z205和Z212平行試驗所有DNA(并發(fā)現(xiàn)為陽性)。在所用PCR條件下，有四種細菌種在凝膠上給出弱信號，即遲鈍愛德華氏菌、Ewingella americana、肺炎克氏桿菌和豪頓沙門氏菌。然而，這四個種的擴增子沒有一個在大小和強度上完全與用分枝桿菌DNA獲得的擴增子對應。
實施例5屬特異探針的選擇將用屬特異引物Z261和Z212通過擴增9種分枝桿菌和4種非分枝桿菌的DNA獲得的序列進行排列(表4-16)，并分析分枝桿菌中具最大的同源性區(qū)域和非分枝桿菌種中最大異源性區(qū)域。最終選擇的屬特異探針包含結核分枝桿菌序列中位置382-421。表18所示共有序列以及在測序的非分枝桿菌種中存在的錯配。在星狀諾卡氏菌中只出現(xiàn)2個錯配，但此DNA在用屬特異引物Z261和Z212時，在所述的條件下不擴增，因為存在11個錯配。我們選擇分別合成每一個屬特異寡核苷酸，而不是引入全部14個可變堿基來覆蓋9種測序的分枝桿菌(表18)的所有錯配，得到8個寡核苷酸庫(胞內分枝桿菌和蟾分枝桿菌分在一組)，其中每種探針以等摩爾量存在。表19表示組成屬特異探針庫的寡核苷酸的序列。探針Z310檢測結核分枝桿菌，Z311檢測胞內分枝桿菌和蟾分枝桿菌，Z312檢測鳥分枝桿菌，Z313檢測戈氏分枝桿菌，Z314檢測偶發(fā)分枝桿菌，Z315檢測瘰疬分枝桿菌，Z316檢測猿分枝桿菌，Z317檢測堪薩斯分枝桿菌。
實施例6與屬特異探針雜交將屬特異探針庫(表19)標記如下遵循5′-標記試劑盒(Boehringer Mannheim，Mannheim，F(xiàn)RG)的提供者的建議，將80 pmol等摩爾混合的8種探針(Z310-Z317)在5′-端用100γCi的32P-γ ATP(10mCi/ml，5000 Ci/mmol)標記至比活性約為3×107/μg。未摻入的標記物用Biospin 6柱(BioRad，Richmond USA)去掉。由屬特異引物Z261和Z212從27種分枝桿菌種(表1a)和106種非分枝桿菌種(表2a)獲得的20μl堿-變性的PCR混合物用100μl TE-緩沖液稀釋，并用96孔點樣器(Schleicher ＆ Schuell，Dassel，F(xiàn)RG)點在預先濕潤的固相載體上(“Gene Screen plus”濾器;Du Pont de Nemours，Bad Homburg，F(xiàn)RG)。濾器交聯(lián)在Stratagene UV-linker(Statagene，La Jolla，USA)上，并在含5ml預雜交液(6XSSC，10mM磷酸鈉pH6.8，1mM EDTA pH8.0，1%SDS，變性的鮭精子DNA 100μg/ml)的50ml Falcon管中預雜交。在旋轉雜交烘箱中，在60℃預雜交60分鐘。傾去預雜交液，換用5ml雜交液(3M氯化四甲基銨，10mM磷酸鈉pH6.8，1mM EDTA pH7.6，0.5%SDS，變性的鮭精子DNA 100μg/ml以及5-8×106cpm標記的屬特異探針)。緩沖液制備的細節(jié)能在早些時候提到的“分子克隆”摘要中找到。雜交在65℃進行3-16小時。濾器在70℃在預熱(70℃)的2XSSC/0.2% SDS中洗4×15分鐘，然后在-70℃用增感屏進行1-2小時放射自顯影。
結果匯集于表1a和2a中，“+”表示得到了雜交信號，而“-”表示沒有得到雜交信號。屬特異探針庫(Z310-Z317)用于探測所有27種分枝桿菌(表1a)。探針庫識別9種測序的分枝桿菌(表4-12)結核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、戈氏分枝桿菌、猿分枝桿菌、蟾分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌。除此之外，下列13種未測序的分枝桿菌用屬特異探針庫識別非洲分枝桿菌、阿加普爾分枝桿菌、牛分枝桿菌、布蘭分枝桿菌、龜分枝桿菌、轉黃分枝桿菌、海分枝桿菌、胃分枝桿菌、地分枝桿菌、次要要枝桿菌、M.nonchromaticum、M.oboense和恥垢分枝桿菌(在表1a中用“+”表示)。在所述的雜交條件下，用嗜血分枝桿菌、鱈分枝桿菌、M.szlugai和草分枝桿菌得到弱信號(在表1a中用“(+)”表示)。紅皮桿菌未得到信號(在表1a中用“(-)”表示)。
用屬特異引物Z261和Z212由列于表2a(凝膠上不可見)的非分枝桿菌種，以及在凝膠上給出弱可見信號的4種(見實施例7)得到的擴增子沒有一個被屬特異探針庫(Z310-Z317)檢測出，結果總結在表2a中。
實施例7種特異探針的識別用屬特異引物Z261和Z212(表4-12)通過擴增9個分枝桿菌DNA獲得的擴增子序列如實施例3中敘述的那樣排列起來，并逐個分析每個分枝桿菌序列，確定與剩下的分枝桿菌序列相比顯著不均一性的區(qū)域。這樣，種特異序列能被識別并進行實驗分析。數(shù)字上顯示最大錯配數(shù)的區(qū)域(在所用排序程序上是最大不均一性)證明不總是導致最大差別雜交結果的區(qū)域。一個序列當與其它序列比較時的錯配數(shù)依賴于用來排列的準則，這也是值得注意的。所給出的種特異探針的位置與衍生出它們的序列有關(表4-12)，而與在不同排列程序中分配給它們的數(shù)目無關。
實施例7.1結核分枝桿菌特異探針由下列序列選出三個區(qū)域(表4)
Z302、Z336和Z337被標記并依實施例6中所述方式沿濾器進行雜交，濾器上固定有用Z261和Z212得到的28個分枝桿菌擴增子(26個不同種)。雜交溫度對Z302是70℃，對剩下的兩個探針是60℃。雜交進行1-16小時，洗滌溫度對Z302是80℃，對Z337是65℃，對Z336是60℃。膠片曝光1-3小時。
37個核苷酸長的探針Z302在所用條件下只識別結核分枝桿菌以及與牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG及非洲分枝桿菌以“大群集”的形式結合的相近物(Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，1974，8th Edition，Waverly Press Inc，Baltimore，R.E.Buchanon+N.E.Gibons(Eds.))。Z302不能識別列于表1b中剩下的23種分枝桿菌種以及列于表2b中的106種非分枝桿菌種中的任何一種。
探針Z336代表在原探針Z302 3′-端的最后26個核苷酸。截去頂端的探針Z336在所述改良條件下僅與結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG和非洲分枝桿菌雜交。同列于表1b中的剩余23種分枝桿菌種以及列于表2b的106種非分枝桿菌種中的任何一種沒有交叉反應。
定位于SOD基因測序部分末端的Z337(一個具有22個核苷酸的探針)對結核分枝桿菌-牛分枝桿菌-非洲分枝桿菌復合體是特異的，并不與列于表1b的剩余23種分枝桿菌種以及列于表2b的106種非分枝桿菌種中的任何一種發(fā)生交叉反應。
盡管三個探針Z302、Z336和Z337的專一性是類似的，但探針Z336和Z337是優(yōu)選的，因為它們有較低的洗滌溫度。
實施例7·2鳥分枝桿菌-布蘭分枝桿菌特異探針選擇的區(qū)域423-459(表5)，具有下列序列
Z301被標記并依實施例6所述方式沿濾器進行雜交，濾器上固定有用Z261和Z212得到的分枝桿菌擴增子。對于Z301，雜交在70℃進行1-16小時，對于Z301的洗滌溫度是80℃，膠片曝光3小時。用鳥分枝桿菌-布蘭分枝桿菌特異探針Z301，鳥分枝桿菌的擴增子與布蘭分枝桿菌的擴增子(n＝6，擴增子從同一貯備DNA樣品衍生得到)一起被識別。對布蘭分枝桿菌未得到測序數(shù)據(jù)，所以對該種合理的探針設計是不可能的。在這一點上，不能完全排除布蘭分枝桿菌貯備液事實上被鳥分枝桿菌擴增子污染。在新的布蘭分枝桿菌貯備液被培養(yǎng)出以前，擴增并測序的Z301當作識別鳥分枝桿菌和布蘭分枝桿菌兩者的探針。Z301不識別表1b所列的其它分枝桿菌種中的任一種。而且沒有一個列于表2b的實驗的非分枝桿菌DNA與鳥分枝桿菌-布蘭分枝桿菌特異探針發(fā)生交叉反應。
實施例7·3胞內分枝桿菌特異探針選擇的區(qū)域416-452(表6)具有下列序列
Z303被末端標記并依實施例6所述方式沿濾器進行雜交，濾器上固定有用Z261和Z212得到的28個分枝桿菌擴增子(26個不同種)。在60℃雜交16小時，洗滌溫度是70℃，并且膠片曝光3小時、6小時和16小時。圖2顯示(16小時曝光)所選擇的對于胞內分枝桿菌的種特異探針的專一性的一個例子，并且結果總結在表1b中。
濾器上的DNA排列如下A2 結核分枝桿菌(臨床分離得到1400)A3 結核分枝桿菌 27294A4 鳥分枝桿菌 25291A5 偶發(fā)分枝桿菌 6841A6 戈氏分枝桿菌 DSM610A7 堪薩斯分枝桿菌 DSM43224A8 瘰疬分枝桿菌 19981A9 猿分枝桿菌 25275
A10 蟾分枝桿菌 19250A11 胞內分枝桿菌 DSM43223B2 阿加普爾分枝桿菌 14473B3 非洲分枝桿菌 25420B4 牛分枝桿菌BCG 1401B5 牛分枝桿菌 19210B6 布蘭分枝桿菌 23434B7 龜分枝桿菌 35752B8 轉黃分枝桿菌 DSM43219B9 胃分枝桿菌 15754B10 恥垢分枝桿菌 14468B11 地分枝桿菌 15755C2 次要分枝桿菌 23292C3 海分枝桿菌 927C4 嗜血分枝桿菌 29548C5 無色分枝桿菌 19530C6 M.obuense 27023C7 草分枝桿菌 DSM750C8 紅皮桿菌 27024C9 M.szulgai 35799C10 鱈分枝桿菌 27726H2O
在與上述分枝桿菌各種的同樣條件下，非分枝桿菌生物體實驗的106個種中沒有一個發(fā)生反應。
實施例7·4瘰疬分枝桿菌特異探針選擇的區(qū)域501-537(表7)具有下列序列
Z306被標記并依實施例6所述方式沿濾器雜交。濾器上固定有用Z261和Z212得到的28個分枝桿菌擴增子(26個不同種)。在70℃雜交1-16小時，洗滌溫度是80℃，且膠片曝光3小時、6小時和16小時。Z306只與瘰疬分枝桿菌DNA雜交，而不與列于表1b中的任何其它分枝桿菌雜交。表2b所列的106個實驗的非分枝桿菌DNA中，沒有一個與瘰疬分枝桿菌探針雜交。
實施例7·5堪薩斯分枝桿菌特異探針選擇的區(qū)域546-567(表8)具有以下序列。
Z340: 5'-CCA GAC GAA CTT TCC ACT CGG A-3'(Seq.Id.No.19).
Z340被標記并依實施例6所述方式沿濾器雜交，濾器上固定有用Z261和Z212得到的28個分枝桿菌擴增子(26個不同種)。在60℃雜交1-16小時，洗滌溫度為65℃，并且將膠片曝光3小時、6小時和16小時。Z340只與堪薩斯分枝桿菌DNA雜交，而不與表1b所列的任何其它分枝桿菌雜交。列于表2b的106個實驗的非分枝桿菌DNA中，沒有一個與堪薩斯分枝桿菌特異探針發(fā)生交叉反應。
實施例7·6偶發(fā)分枝桿菌特異探針選擇的區(qū)域500-521(表9)具有下列序列。
Z369: 5'-ACG ACA GCC TGG GCG ATC GGC T-3'(Seq.Id.No.21).
Z369末端被標記并依實施例6所述方式沿濾器雜交。濾器上固定有用Z261和Z212得到的28個分枝桿菌擴增子(26個不同種)。在60℃雜交1-16小時，洗滌溫度是70℃且膠片曝光3小時、6小時和16小時。Z369僅與偶發(fā)分枝桿菌DNA雜交，而不與列于表1b中的任何其它分枝桿菌雜交。表2b所列的106個實驗的非分枝桿菌DNA中沒有一個與偶發(fā)分枝桿菌特異探針發(fā)生交叉反應。
實施例7·7猿分枝桿菌特異探針選擇的區(qū)域360-396(表10)，具有下列序列
Z304被標記并依實施例6所述方式沿濾器雜交，濾器上固定有用Z261和Z212得到的28個分枝桿菌擴增子(26個不同種)。在70℃雜交1-16小時。洗滌溫度為80℃，膠片曝光3小時、6小時和16小時。Z304僅與猿分枝桿菌DNA雜交，而不與列于表1b的任何其它分枝桿菌雜交。表2b所列的106個實驗的非分枝桿菌DNA中，沒有一個與猿分枝桿菌特異探針發(fā)生交叉反應。
實施例7·8戈氏分枝桿菌特異探針選擇的區(qū)域507-531(表11)具有下列序列Z366: 5'-TCT GGG CGG CCG GTT GCT CAC CTT T-3'(Seq.Id.No.15).
Z366被末端標記并依實施例6所述方式沿濾器雜交，濾器上固定有用Z261和Z212得到的28個分枝桿菌擴增子(26個不同種)。在60℃雜交1-16小時，洗滌溫度是70℃，膠片曝光3小時、6小時和16小時。Z366僅與戈氏分枝桿菌DNA雜交，而不與列于表1b的任何其它分枝桿菌雜交。表2b所列的106個實驗的非分枝桿菌DNA中，沒有一個與戈氏分枝桿菌特異探針發(fā)生交叉反應。
實施例7·9蟾分枝桿菌特異探針選擇的區(qū)域280-316(表12)具有下列序列
Z309被末端標記并依實施例6所述方式沿濾器雜交，濾器上固定有用Z261和Z212得到的28個分枝桿菌擴增子(26個不同種)。在70℃雜交1-16小時，洗滌溫度為80℃，膠片曝光3小時、6小時、16小時。Z309僅與蟾分枝桿菌DNA雜交，而不與列于表1b的任何其它分枝桿菌雜交。表2b所列的106個實驗的非分枝桿菌DNA中，沒有一個與蟾分枝桿菌特異探針發(fā)生交叉反應。
圖1在SOD-基因中測序引物的位置。
圖2用由屬特異探針Z261和Z212得到的，沿探針Z303雜交的定位的擴增子進行的斑點-印跡，這對于胞內分枝桿菌是特定的。
表1a分枝桿菌種，其起源，用通用引物Z205和Z212擴增，用屬特異引物Z261和Z212擴增以及與屬特異探針庫Z310-Z317雜交。
表1b分枝桿菌種，它們的起源以及與種特異探針Z301(鳥分枝桿菌/布蘭分枝桿菌);Z337、Z336和Z302(結核分枝桿菌);Z303(胞內分枝桿菌);Z304(猿分枝桿菌);Z340(堪薩斯分枝桿菌);Z306(瘰疬分枝桿菌);Z366(戈氏分枝桿菌);Z369(偶發(fā)分枝桿菌)和Z309(蟾分枝桿菌)雜交。
表2a非分枝桿菌種，它們的起源，用通用引物Z205和Z212擴增，用屬特異引物Z261和Z212擴增以及與屬特異探針庫(Z310-Z317)雜交。
表2b非分枝桿菌種，它們的起源和與上面表1b中提到的種特異探針雜交。
表3用于擴增子測序的引物序列，該擴增子在用pUC19克隆后，由引物Z205和Z212得到。
表4由作為結核分枝桿菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表5由作為鳥分枝桿菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表6由作為胞內分枝桿菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表7由作為瘰疬分枝桿菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表8由作為堪薩斯分枝桿菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表9由作為偶發(fā)分枝桿菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表10由作為猿分枝桿菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表11由作為戈氏分枝桿菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表12由作為蟾分枝桿菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表13由作為白喉棒狀桿菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表14由作為假白喉棒狀桿菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表15由作為星狀諾卡氏菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表16由作為粘性放線菌SOD基因片段的引物Z205和Z212得到的擴增子的DNA序列。
表17一致引物Z261的序列和9種測序的分枝桿菌屬中的錯配，4個測序的非分枝桿菌生物體以及由大腸桿菌和人SOD基因衍生的相應片段序列。
表18分枝桿菌的屬特異探針的一致序列，4種測序的非分枝桿菌生物體中的錯配以及由大腸桿菌和人SOD基因衍生的相應片段序列。也列出了組成屬特異探針庫的各寡核苷酸序列。
表1a分枝桿菌屬 ATCC Z205/Z2121)Z261/Z2122)Z310-Z3173)阿加普爾分枝桿菌 14473 + + +非洲分枝桿菌 25420 + + +鳥分枝桿菌 25291 + + +牛分枝桿菌 19210 + + +牛分枝桿菌BCG*** 1401 + + +布蘭分枝桿菌 23434 + + +龜分枝桿菌 35752 + + +轉黃分枝桿菌 DSM43219* + + +偶發(fā)分枝桿菌 6841 + + +鱈分枝桿菌 27726 + + (+)胃分枝桿菌 15754 + + +戈氏分枝桿菌 DSM610* + + +嗜血分枝桿菌 29548 + + (+)胞內分枝桿菌 DSM43223* + + +堪薩斯分枝桿菌 DSM43224* + + +海分枝桿菌 927 + + +無色分枝桿菌 19530 + + +M.obuense 27023 + + +草分枝桿菌 DSM750* + + (+)
表1a(續(xù))分枝桿菌屬 ATCC Z205/Z2121)Z261/Z2122)Z310-Z3173)紅皮桿菌 27024 + + -瘰疬分枝桿菌 19981 + + +猿分枝桿菌 25275 + + +恥垢分枝桿菌 14468 + + +M.szulgai 35799 + + (+)地分枝桿菌 15755 + + +次要分枝桿菌 23292 + + +結核分枝桿菌** 1400 + + +結核分枝桿菌 27294 + + +蟾分枝桿菌 19250 + + +1)用通用探針對Z205/Z212擴增2)用屬特異探針對Z261/Z212擴增3)用屬特異探針庫Z310/Z317雜交＊＊＊瑞士伯爾尼血清和疫苗研究所＊＊臨床分離得到＊DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen，G
ttingen，F(xiàn)RG)
表1b分枝桿菌屬 ATCC 與種特異探針的雜交A B C D E F G H I阿加普爾分枝桿菌 14473 - - - - - - - - -非洲分枝桿菌 25420 - + - - - - - - -鳥分枝桿菌 25291 + - - - - - - - -牛分枝桿菌 19210 - + - - - - - - -牛分枝桿菌BCG*** 1401 - + - - - - - - -布蘭分枝桿菌 23434 + - - - - - - - -龜分枝桿菌 35752 - - - - - - - - -轉黃分枝桿菌 DSM43219* - - - - - - - - -偶發(fā)分枝桿菌 6841 - - - - - - - + -鱈分枝桿菌 27726 - - - - - - - - -胃分枝桿菌 15754 - - - - - - - - -戈氏分枝桿菌 DSM610* - - - - - - + - -嗜血分枝桿菌 29548 - - - - - - - - -胞內分枝桿菌 DSM43223* - - + - - - - - -堪薩斯分枝桿菌 DSM43224* - - - - + - - - -海分枝桿菌 927 - - - - - - - - -無色分枝桿菌 19530 - - - - - - - - -M.obuense 27023 - - - - - - - - -草分枝桿菌 DSM750* - - - - - - - - -紅皮桿菌 27024 - - - - - - - - -瘰疬分枝桿菌 19981 - - - - - + - - -猿分枝桿菌 25275 - - - + - - - - -恥垢分枝桿菌 14468 - - - - - - - - -
表1b(續(xù))分枝桿菌屬 ATCC 與種特異探針的雜交A B C D E F G H IM.szulgai 35799 - - - - - - - - -地分枝桿菌 15755 - - - - - - - - -次要分枝桿菌 23292 - - - - - - - - -結核分枝桿菌** 1400 - + - - - - - - -結核分枝桿菌 27294 - + - - - - - - -蟾分枝桿菌 19250 - - - - - - - - +A鳥分枝桿菌探針Z301 F瘰疬分枝桿菌探針Z306BMTB探針Z337/Z336/Z302 G戈氏分枝桿菌探針Z336C胞內分枝桿菌探針Z303 H偶發(fā)分枝桿菌探針Z369D猿分枝桿菌探針Z304 I蟾分枝桿菌探針Z309E堪薩斯分枝桿菌探針Z340＊＊＊瑞士伯爾尼血清和疫苗研究所＊＊臨床分離得到＊DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen，G
ttingen，F(xiàn)RG)
表2a非分枝桿菌生物體 ATCC Z205/Z2121)Z261/Z2122)Z310-3173)乙酸鈣不動桿菌 17945 + - -乙酸鈣不動桿菌 23055 + - -魯氏不動桿菌 15309 + - -牛型放線菌 DSM43014** + - -衣氏放線菌 12102 + - -放線菌屬 35568 + - -齲齒放線菌 17929 + - -粘性放線菌 15987 + - -嗜水氣單孢菌 7966 + - -根癌土壤桿菌 23308 + - -糞產堿桿菌 8750 + - -球形節(jié)桿菌 DSM20124** + - -黃曲霉 RKI**** + - -薰煙色曲霉 RKI**** + - -蠟樣芽孢桿菌 27348 + - -蕈狀芽孢桿菌 RKI**** + - -枯草芽孢桿菌 6633 + - -Bacteroides hetaitaomicron RKI**** + - -齒雙歧桿菌 DSM20084** + - -副百日咳博德特氏菌 DSM4922** + - -粘膜布蘭漢氏球菌 8176 + - -表皮短桿菌 DSM20660** + - -空腸彎曲桿菌 33560 + - -幽門彎曲桿菌 * + - -
表2a(續(xù))非分枝桿菌生物體 ATCC Z205/Z2121)Z261/Z2122)Z310-3173)白色念珠菌 10231 + - -假絲酵母菌屬 RKI*** + - -檸檬酸桿菌屬 DSM4570** + - -弗氏檸檬酸菌 8090 + - -艱難桿菌 RKI**** + - -白喉棒狀桿菌 11913 + - -淺黃棒狀桿菌 10340 + - -最小棒狀桿菌 23348 + - -假白喉棒狀桿菌 RC181*** + - -棒狀桿菌屬 33035 + - -紋帶棒狀桿菌 6940 + - -陰道棒狀桿菌 15753 + - -結膜棒狀桿菌 373 + - -大腸桿菌 25922 + - -遲鈍愛德華氏菌 15947 + (+) -鳥腸球菌 14025 + - -屎腸球菌 19432 + - -糞產鏈球菌 19433 + - -陰溝腸桿菌 13047 + - -Ewingella americana DSM4580** + (+) -Flavobacterium odoratum 4651 + - -流感嗜血桿菌 9333 + - -肺炎克雷伯氏菌 13883 + (+) -嗜酸乳桿菌 DSM20079** + - -
表2a(續(xù))非分枝桿菌生物體 ATCC Z205/Z2121)Z261/Z2122)Z310-3173)軍團菌屬 RKI**** + - -藤黃微球菌 RC9346*** + - -乳屑奈瑟氏球屬 23970 + - -干燥奈瑟氏球菌 9913 + - -諾卡氏菌屬 31306 + - -星狀諾卡氏菌 43005 + - -短鏈諾卡氏菌 15333 + - -厭氧消化鏈球菌 RKI**** + - -不解糖消化鏈球菌 RKI**** + - -類志賀志菌 14029 + - -原質團3D7 RC*** + - -Prevotella livia RKI**** + - -Prevotella intermedia RKI**** + - -痤瘡丙酸桿菌 DSM1897** + - -奇異變形桿菌 12453 + - -普通變形桿菌 6380 + - -食酸假單孢菌 RC15858*** + - -綠肽桿菌 10145 + - -產堿假單孢菌 14909 + - -熒光假單孢菌 13525 + - -惡臭假單孢菌 12633 + - -腐敗假單孢菌 DSM50426** + - -馬假球菌 6939 + - -假球菌屬 29627 + - -
表2a(續(xù))非分枝桿菌生物體 ATCC Z205/Z2121)Z261/Z2122)Z310-3173)啤酒酵母 RKI**** + - -鮑氏沙門氏菌 RC5951*** + - -豪頓沙門氏菌 RC5507*** + (+) -薩拉姆沙門氏菌 RC5554*** + - -鼠傷寒沙門氏菌 13311 + - -粘質沙門氏菌 8100 + - -宋內志賀氏菌 11060 + - -金黃色葡萄球菌 29213 + - -頭葡萄球菌 27840 + - -柯氏葡萄球菌 29974 + - -表皮葡萄球菌 12228 + - -溶血葡萄球菌 29970 + - -人型葡萄球菌 27844 + - -腐生葡萄球菌 15305 + - -模擬葡萄球菌 27848 + - -瓦氏葡萄球菌 27838 + - -木糖葡萄球菌 29971 + - -無乳鏈球菌 13813 + - -星群鏈球菌 27823 + - -馬鏈球菌 33398 + - -Streptococcus group A RC17A4*** + - -輕型鏈球菌 33399 + - -鏈球菌屬 27824 + - -變異鏈球菌 25175 + - -
表2a(續(xù))非分枝桿菌生物體 ATCC Z205/Z2121)Z261/Z2122)Z310-3173)肺炎鏈球菌 6301 + - -肺炎鏈球菌 6303 + - -化濃性鏈球菌 19615 + - -唾液鏈球菌 7073 + - -血鏈球菌 10556 + - -脊螺旋體 RKI**** + - -韋榮氏菌屬 DSM20735** + - -副溶血弧菌 DSM2171** + - -小腸結腸炎耶氏菌 9610 + - -假結核耶氏菌 907 + - -1)用通用引物對Z205/Z212擴增2)用屬特異引物對Z261/Z212擴增3)與屬特異探針庫Z310-Z317雜交＊臨床分離得到＊＊DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen，G＊ttingen，F(xiàn)RG)＊＊＊RC(Roche collection)＊＊＊＊RKI(Robert Koch Institute，Berlin，F(xiàn)RG)
表2b非分枝桿菌生物體 ATCC 與種特異探針雜交A B C D E F G H I乙酸鈣不動桿菌 17945 - - - - - - - - -乙酸鈣不動桿菌 23055 - - - - - - - - -魯氏不動桿菌 15309 - - - - - - - - -牛型放線菌 DSM43014** - - - - - - - - -衣氏放線菌 12102 - - - - - - - - -放線菌屬 35568 - - - - - - - - -齲齒放線菌 17929 - - - - - - - - -粘性放線菌 15987 - - - - - - - - -嗜水氣單孢菌 7966 - - - - - - - - -根癌土壤桿菌 23308 - - - - - - - - -糞產堿桿菌 8750 - - - - - - - - -球形節(jié)桿菌 DSM20124** - - - - - - - - -黃曲霉 RKI**** - - - - - - - - -薰煙色曲霉 RKI**** - - - - - - - - -蠟祥芽孢桿菌 27348 - - - - - - - - -蕈狀芽孢桿菌 RKI**** - - - - - - - - -枯草芽孢桿菌 6633 - - - - - - - - -Bacteroides hetaitaomicron RKI**** - - - - - - - - -齒雙歧桿菌 DSM20084** - - - - - - - - -副百日咳博德特氏菌 DSM4922** - - - - - - - - -粘膜布蘭漢氏球菌 8176 - - - - - - - - -表皮短桿菌 DSM20660** - - - - - - - - -空腸彎曲桿菌 33560 - - - - - - - - -
表2b(續(xù))非分枝桿菌生物體 ATCC 與種特異探針雜交A B C D E F G H I幽門彎曲桿菌 * - - - - - - - - -白色念珠菌 10231 - - - - - - - - -假絲酵母菌屬 RKI*** - - - - - - - - -檸檬酸桿菌屬 DSM4570** - - - - - - - - -弗氏檸檬酸菌 8090 - - - - - - - - -艱難桿菌 RKI**** - - - - - - - - -白喉棒狀桿菌 11913 - - - - - - - - -淺黃棒狀桿菌 10340 - - - - - - - - -最小棒狀桿菌 23348 - - - - - - - - -假白喉棒狀桿菌 RC181*** - - - - - - - - -棒狀桿菌屬 33035 - - - - - - - - -紋帶棒狀桿菌 6940 - - - - - - - - -陰道棒狀桿菌 15753 - - - - - - - - -結膜棒狀桿菌 373 - - - - - - - - -大腸桿菌 25922 - - - - - - - - -遲鈍愛德華氏菌 15947 - - - - - - - - -鳥腸球菌 14025 - - - - - - - - -屎腸球菌 19432 - - - - - - - - -糞鏈球菌 19433 - - - - - - - - -陰溝腸桿菌 13047 - - - - - - - - -Ewingella americana DSM4580** - - - - - - - - -Flavobacterium odoratum 4651 - - - - - - - - -流感嗜血桿菌 9333 - - - - - - - - -
表2b(續(xù))非分枝桿菌生物體 ATCC 與種特異探針雜交A B C D E F G H I肺炎克雷伯氏菌 13883 - - - - - - - - -嗜酸乳桿菌 DSM20079** - - - - - - - - -軍團菌屬 RKI**** - - - - - - - - -藤黃微球菌 RC9346*** - - - - - - - - -乳屑奈瑟氏球菌 23970 - - - - - - - - -干燥奈瑟氏球菌 9913 - - - - - - - - -諾卡氏菌屬 31306 - - - - - - - - -星狀諾卡氏菌 43005 - - - - - - - - -短鏈諾卡氏菌 15333 - - - - - - - - -厭氧消化鏈球菌 RKI**** - - - - - - - - -不解糖消化鏈球菌 RKI**** - - - - - - - - -類志賀志菌 14029 - - - - - - - - -原質團3D7 RC*** - - - - - - - - -Prevotella livia RKI**** - - - - - - - - -Prevotella intermedia RKI**** - - - - - - - - -痤瘡丙酸桿菌 DSM1897** - - - - - - - - -奇異變形桿菌 12453 - - - - - - - - -普通變形桿菌 6380 - - - - - - - - -食酸假單孢菌 RC15858*** - - - - - - - - -綠膿桿菌 10145 - - - - - - - - -產堿假單孢菌 14909 - - - - - - - - -熒光假單孢菌 13525 - - - - - - - - -惡臭假單孢菌 12633 - - - - - - - - -
表2b(續(xù))非分枝桿菌生物體 ATCC 與種特異探針雜交A B C D E F G H I腐敗假單孢菌 DSM50426** - - - - - - - - -馬假球菌 6939 - - - - - - - - -假球菌屬 29627 - - - - - - - - -啤酒酵母 RKI**** - - - - - - - - -鮑氏沙門氏菌 RC5951*** - - - - - - - - -豪頓沙門氏菌 RC5507*** - - - - - - - - -薩拉姆沙門氏菌 RC5554*** - - - - - - - - -鼠傷寒沙門氏菌 13311 - - - - - - - - -粘質沙門氏菌 8100 - - - - - - - - -宋內志賀氏菌 11060 - - - - - - - - -金黃色葡萄球菌 29213 - - - - - - - - -頭葡萄球菌 27840 - - - - - - - - -柯氏葡萄球菌 29974 - - - - - - - - -表皮葡萄球菌 12228 - - - - - - - - -溶血葡萄球菌 29970 - - - - - - - - -人型葡萄球菌 27844 - - - - - - - - -腐生葡萄球菌 15305 - - - - - - - - -模擬葡萄球菌 27848 - - - - - - - - -瓦氏葡萄球菌 27838 - - - - - - - - -木糖葡萄球菌 29971 - - - - - - - - -無乳鏈球菌 13813 - - - - - - - - -星群鏈球菌 27823 - - - - - - - - -馬鏈球菌 33398 - - - - - - - - -
表2b(續(xù))非分枝桿菌生物體 ATCC 與種特異探針雜交A B C D E F G H IStreptococcus group A RC17A4*** - - - - - - - - -輕型鏈球菌 33399 - - - - - - - - -鏈球菌屬 27824 - - - - - - - - -變異鏈球菌 25175 - - - - - - - - -肺炎鏈球菌 6301 - - - - - - - - -肺炎鏈球菌 6303 - - - - - - - - -化濃性鏈球菌 19615 - - - - - - - - -唾液鏈球菌 7073 - - - - - - - - -血鏈球菌 10556 - - - - - - - - -脊螺旋體 RKI**** - - - - - - - - -韋榮氏菌屬 DSM20735** - - - - - - - - -副溶血弧菌 DSM2171** - - - - - - - - -小腸結腸炎耶氏菌 9610 - - - - - - - - -假結核耶氏菌 907 - - - - - - - - -A鳥分枝桿菌探針Z301 F瘰疬分枝桿菌探針Z306BMTB探針Z337/Z336/Z302 G戈氏分枝桿菌探針Z366C胞內分枝桿菌探針Z303 H偶發(fā)分枝桿菌探針Z369D猿分枝桿菌探針Z304 I蟾分枝桿菌探針Z309E堪薩斯分枝桿菌探針Z340＊臨床分離得到＊＊DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen，G
ttingen，F(xiàn)RG)＊＊＊RC(Roche collection)＊＊＊＊RKI(Robert Koch Institute，Berlin，F(xiàn)RG)
表3
表4超氧物歧化酶的結核分枝桿菌SOD基因
表5超氧物歧化酶的鳥分枝桿菌SOD基因
表6超氧物歧化酶的胞內分枝桿菌SOD基因
表7超氧物歧化酶的瘰疬分枝桿菌SOD基因
表8超氧物歧化酶的堪薩斯分枝桿菌SOD基因
表9超氧物歧化酶的偶發(fā)分枝桿菌SOD基因
表10超氧物歧化酶的猿分枝桿菌SOD基因
表11超氧物歧化酶的戈氏分枝桿菌SOD基因
表12超氧物歧化酶的蟾分枝桿菌SOD基因
表13超氧物歧化酶的白喉棒狀桿菌SOD基因
表14超氧物歧化酶的假白喉棒狀桿菌SOD基因
表15超氧物歧化酶的星狀諾卡氏菌SOD基因
表16超氧物歧化酶的粘性放線菌SOD基因
表17PCR引物Z261的錯配分析(X＝錯配數(shù))
＊取自序列AC M123267/＊＊取自序列AC X03951 EMBL Data Bank，Heidelberg，F(xiàn)RG和GenBank，Los Alamos，USA
表18
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名F.Hoffmann-La Roche AG(B)街道Grenzacherstr.124(C)城市巴塞爾(D)州巴塞爾市(E)國家瑞士(F)郵政編碼(ZIP)4002(G)電話061 688 27 08(H)傳真061 688 13 95(ⅱ)發(fā)明題目由SOD基因族衍生的寡核苷酸類(ⅲ)序列數(shù)目44(ⅳ)計算機可讀形式(A)工具類型軟磁盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release＃1.0，Version＃1.25(EPO)(ⅵ)在先申請信息(A)申請?zhí)朎P 92810780.4(B)提交日1992年10月13日(2)SEQ ID No1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No1AGCTTCACCA CAGCAAGCAC CA(2)SEQ ID No2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No2TCGKCCCAGT TCACGACRTT CCA(2)SEQ ID No3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No3CCAARCTCGA AGAGGCGCGS GCCAA(2)SEQ ID No4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No4GACAAGCCSA CSGGHGANYT SGCCGCVGCS ATCGMYG(2)SEQ ID No5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No5GACAAGCCCA CCGGCGAACT CGCCGCAGCC ATCGCCG(2)SEQ ID No6的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No6GACAAGCCGA CCGGCGAATT GGCCGCCGCS ATCGACG(2)SEQ ID No7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No7GACAAGCCCA CCGGTGAGCT GGCCGCCGCG ATCGACG(2)SEQ ID No8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈
(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No8GACAAGCCGA CCGGTGACCT GGCCGCCGCG ATCGACG(2)SEQ ID No9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No9GACAAGCCGA CCGGAGATCT GGCCGCGGCG ATCGACG(2)SEQ ID No10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No10GACAAGCCGA CCGGAGAACT GGCCGCCGCG ATCGATG
(2)SEQ ID No11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No11GACAAGCCGA CCGGAGATCT CGCCGCCGCC ATCGACG(2)SEQ ID No12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No12GACAAGCCGA CCGGCGAACT CGCCGCGGCC ATCGACG(2)SEQ ID No13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No13CCTTCGGATC CTTCGACCGG TTCCGCGCGC AGTTCAG(2)SEQ ID No14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No14GTCCTTCGAC AAGTTCCGAG CGCAATTCAG CGCCGCC(2)SEQ ID No15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No15
TCTGGGCGGC CGGTTGCTCA CCTTT(2)SEQ ID No16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No16GTCCCCGAAC GGCGGAGACA AGCCGACCGG AGATCTC(2)SEQ ID No17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No17GCTAGGCATT GTTCCGCTGC TGCTGC(2)SEQ ID No18的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No18TCCGCGATCG TCGGGCATGA GAAGGCCCTC GCGTTCA(2)SEQ ID No19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No19CCAGACGAAC TTTCCACTCG GA(2)SEQ ID No20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No20TGACACACTC GGCAGCAGGC TGCTCACCTT CCAGCTT(2)SEQ ID No21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No21ACGACAGCCT GGGCGATCGG CT(2)SEQ ID No21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No21ACGACAGCCT GGGCGATCGG CT(2)SEQ ID No22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No22ACGAACTTCC CGCTAGGCAT TGTTCCGCTG CTGCTGC
(2)SEQ ID No23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No23AGTCGACTTT GCCAAGGCGT TT(2)SEQ ID No24的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No24CACWCSATCT GGTGGAAGAA CCT(2)SEQ ID No25的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No25ACGGYGGYGA CAAGCCGACC GG(2)SEQ ID No26的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No26GTCTGSTGGT CGTARASCTG GA(2)SEQ ID No27的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No27
GGATTTGGCT TTCAACTTGG G(2)SEQ ID No28的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No28GGCGAGCCAA CCGGCGCTTT GG(2)SEQ ID No29的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No29GAAGAACCTG AGCCTTAACG GT(2)SEQ ID No30的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No30GAGCCAACCG GTGAGCTAGC C(2)SEQ ID No31的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型不同的核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No31GAAGAACCTC TCCCCCAACG GC(2)SEQ ID No32的信息(ⅰ)序列特征(A)長度491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體結核分枝桿菌/SOD基因(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No32
(2)SEQ ID No33的信息(ⅰ)序列特征(A)長度491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體鳥分枝桿菌/SOD基因
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No33
(2)SEQ ID No34的信息(ⅰ)序列特征(A)長度491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體胞內分枝桿菌/SOD基因(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No34
(2)SEQ ID No35的信息(ⅰ)序列特征(A)長度491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(B)菌株瘰疬分枝桿菌/SOD基因(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No35
(2)SEQ ID No36的信息(ⅰ)序列特征(A)長度491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體堪薩斯分枝桿菌/SOD基因(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No36
(2)SEQ ID No37的信息(ⅰ)序列特征(A)長度491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體偶發(fā)分枝桿菌/SOD基因(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No37
(2)SEQ ID No38的信息(ⅰ)序列特征(A)長度491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體猿分枝桿菌/SOD基因(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No38
(2)SEQ ID No39的信息(ⅰ)序列特征(A)長度491個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體戈氏分枝桿菌/SOD基因(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No39
(2)SEQ ID No40的信息(ⅰ)序列特征(A)長度491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體蟾分枝桿菌/SOD基因(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No40
(2)SEQ ID No41的信息(ⅰ)序列特征(A)長度495個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體白喉棒狀桿菌/SOD基因
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No41
(2)SEQ ID No42的信息(ⅰ)序列特征(A)長度491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體假白喉棒狀桿菌/SOD基因(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No42
(2)SEQ ID No43的信息(ⅰ)序列特征(A)長度490個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體星狀諾卡氏菌/SOD基因(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No43
(2)SEQ ID No44的信息(ⅰ)序列特征(A)長度491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)最初的來源(A)生物體粘性放線菌/SOD基因(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No4權利要求
1.超氧物歧化酶(SOD)基因體系作為靶在分化病原及非病原生物體(包括細菌、真菌和原生動物)方面的應用。
2.SOD基因體系作為靶在檢測和分化分枝桿菌種方面的應用。
3.能與單鏈核酸序列(靶序列)雜交的一種寡核苷酸，該靶序列可以使用聚合酶鏈反應(PCR)和一對引物，通過擴增和變性編碼超氧物歧化酶(SOD)的基因片段獲得，第一個引物含有序列Seq.Id.No.1(Z205)作為引物序列，第二個引物含有序列Seq.Id.No.2(Z212)作為引物序列。
4.根據(jù)權利要求3的一種寡核苷酸，它能與由病原生物體(包括細菌、真菌和原生動物)的SOD基因衍生的靶序列雜交。
5.根據(jù)權利要求3或4的一種寡核苷酸，它能與靶序列的一個區(qū)域雜交，該靶序列在屬于一個特殊屬的不同種的SOD基因中基本上得到保留。
6.根據(jù)權利要求3或4的一種寡核苷酸，它能與靶序列的一個區(qū)域雜交，該靶序列可在一定程度上變化，即允許屬于一個特殊屬的不同種的SOD基因中的分化。
7.根據(jù)權利要求3的一種寡核苷酸，它能與一單鏈核酸序列(靶序列)雜交，此靶序列可以使用聚合酶鏈反應(PCR)和一對引物通過擴增和變性編碼分枝桿菌種的超氧物歧化酶(SOD)的基因片段獲得，第一個引物含有序列Seq.Id.No.3(Z261)作為引物序列，第二個引物含有序列Seq.Id.No.2(Z212)作為引物序列。
8.根據(jù)權利要求7的一種寡核苷酸，它能與靶序列的一個區(qū)域雜交，此靶序列在屬于分枝桿菌屬的不同種的SOD基因中基本上得到保留。
9.根據(jù)權利要求8的一種寡核苷酸，它具有序列5′-GACAAGCCSA CSGGHGANYT SGCCGCVGCS ATCGMY-3′(Seq.Id.No.4)，其中符號H表示T、C或A，符號M表示A或C，符號N表示A、C、G或T，符號S表示C或G，符號V表示A、C或G，符號Y表示C或T，或一個與其互補的序列。
10.根據(jù)權利要求9的一個寡核苷酸，它選自下列一組序列Seq.Id.No.5(Z310)，Seq.Id.No.6(Z311)，Seq.Id.No.7(Z312)，Seq.Id.No.8(Z313)，Seq.Id.No.9(Z314)，Seq.Id.No.10(Z315)，Seq.Id.No.11(Z316)and Seq.Id.No.12(Z317)以及一個與其互補的序列。
11.根據(jù)權利要求7的一個寡核苷酸，它能與靶序列的一個區(qū)域雜交，此靶序列可在一定程度上變化，即允許在屬于一個分枝桿菌屬的不同種的SOD基因中的分化。
12.根據(jù)權利要求11的一種寡核苷酸，它能與胞內分枝桿菌種的SOD基因的一個種特異區(qū)域雜交。
13.根據(jù)權利要求11的一個寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.13(Z303)或一個與其互補的序列。
14.根據(jù)權利要求11的一個寡核苷酸，它能與鳥分枝桿菌種和布蘭分枝桿菌種的SOD基因的一個種特異區(qū)域雜交。
15.根據(jù)權利要求14的一個寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.14(Z301)或一個與其互補的序列。
16.根據(jù)權利要求11的一種寡核苷酸，它能與戈氏分枝桿菌種的SOD基因的一個種特異區(qū)域雜交。
17.根據(jù)權利要求16的一個寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.15(Z366)或一個與其互補的序列。
18.根據(jù)權利要求11的一個寡核苷酸，它能與猿分枝桿菌種的SOD基因的一個種特異區(qū)域雜交。
19.根據(jù)權利要求18的一個寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.16(Z304)或一個與其互補的序列。
20.根據(jù)權利要求11的一個寡核苷酸，它能與結核分枝桿菌種的SOD基因的一個種特異區(qū)域雜交。
21.根據(jù)權利要求20的一個寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.17(Z336)，Seq.Id.No.23(Z337)或Seq.Id.No.22(Z302)或一個與其互補的序列。
22.根據(jù)權利要求11的一個寡核苷酸，它能與蟾分枝桿菌種的SOD基因的一個種特異區(qū)域雜交。
23.根據(jù)權利要求22的一個寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.18(Z309)或一個與其互補的序列。
24.根據(jù)權利要求11的一個寡核苷酸，它能與堪薩斯分枝桿菌種的SOD基因的一個種特異區(qū)域雜交。
25.根據(jù)權利要求24的一個寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.19(Z340)或一個與其互補的序列。
26.根據(jù)權利要求11的一個寡核苷酸，它能與瘰疬分枝桿菌種的SOD基因的一個種特異區(qū)域雜交。
27.根據(jù)權利要求26的一個寡核苷酸，它含有序列Seq.ID.No.20(Z306)或一個與其互補的序列。
28.根據(jù)權利要求11的一個寡核苷酸，它能與偶發(fā)分枝桿菌種的SOD基因的一個種特異區(qū)域雜交。
29.根據(jù)權利要求28的一個寡核苷酸，它含有序列Seq.Id.No.21(Z369)或一個與其互補的序列。
30.一種探針，它包含作為雜交序列的權利要求7-10中任何一項的一種寡核苷酸。
31.一種探針，它包含作為雜交序列的權利要求10的寡核苷酸類。
32.一種探針，它包含作為雜交序列的權利要求11-29中任何一項的一種寡核苷酸。
33.一個引物，它包含作為引物序列的一個序列，該序列基本上與序列Z205同源。
34.一個引物，它包含作為引物序列的一個序列，該序列基本上與序列Z212同源。
35.一對引物，第一個引物包含序列Z205作為引物序列，而第二個引物含有序列Z212作為引物序列。
36.一個引物，它包含作為引物序列的一個序列，該序列基本上與序列Z261同源。
37.一對引物，第一個引物包含序列Z261作為引物序列，而第二個引物含有序列Z212作為引物序列。
38.一套試劑，它用于擴增編碼超氧物歧化酶(SOD)的基因片段，它包含權利要求33和/或36的一個引物和權利要求34的一個引物。
39.一套試劑，它用于檢測分枝桿菌種，它包含權利要求30或31的一個探針。
40.一套試劑，它用于屬于分桿菌屬的不同種間的分化，它包含權利要求32的一個探針。
41.權利要求39或40的一套試劑，它進一步包含權利要求33和/或36的一個引物，以及權利要求34的一個引物。
全文摘要
本發(fā)明描述了用超氧物歧化酶(SOD；EC1.15.1.1)基因體系作為靶來檢測和分化病原及非病原生物體(包括細菌、真菌和原生動物)。更具體地講，描述了由SOD基因族衍生的寡核苷酸類，它們能與單鏈核酸序列(靶序列)雜交，此靶序列可以使用聚合酶鏈反應(PCR)和一對引物，通過擴增和變性一段編碼超氧物歧化酶(SOD)基因片段獲得。這些寡核苷酸類可以引物和探針的形式使用，來擴增和檢測由SOD基因衍生的靶序列。
文檔編號C12Q1/68GK1085957SQ9311892
公開日1994年4月27日 申請日期1993年10月12日 優(yōu)先權日1992年10月13日
發(fā)明者W·佐爾格 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司