專利名稱：：玉米赤霉烯酮的液體發(fā)酵及提煉的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種能夠促進(jìn)牛羊生長的物質(zhì)-玉米赤霉烯酮(zearale-none)的生物合成及其提煉工藝，它是由鐮刀菌屬的玉米赤霉菌(Gibberellazeae)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)生成的。以前在利用藥物增加牛羊的體重方面，只是將抗生素及激素?fù)饺腼暳现校蜃⑷雱游矬w內(nèi)，使之增重，但并沒有注意到所增加的蛋白質(zhì)與脂肪的比例，以及人畜共用抗生素易造成大量抗藥性病源微生物的富集，同時由于激素類藥物的毒性及其在食物鏈中造成的副作用太大，所以這類促進(jìn)生長的物質(zhì)已逐漸被淘汰，禁用。1962年，美國在發(fā)霉的玉米上分離得到了能夠合成玉米赤霉烯酮的玉米赤霉菌，并且通過發(fā)酵培養(yǎng)得到了玉米赤霉烯酮的結(jié)晶品，證明它是由玉米赤霉菌合成的一種次生代謝物質(zhì)，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為由此結(jié)構(gòu)可以看出，它沒有性激素的典型類固醇核結(jié)構(gòu)，聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織(WHO)把它分類為非類固醇的代謝同化物質(zhì)。它可以顯著促進(jìn)牛羊的蛋白質(zhì)同化作用，使之增重，而且增加的是蛋白質(zhì)而不是脂肪，同時，還可提高飼料轉(zhuǎn)化率。之后，他們對原始菌株進(jìn)行了誘變，得到了幾株能夠在固體或液體培養(yǎng)基中大量合成玉米赤霉烯酮的菌株，并對其生物合成條件及提煉工藝申請了美國專利，很快進(jìn)入了工業(yè)化生產(chǎn)階段，六十年代末推出玉米赤霉醇(zearalanol商品名稱為Ralgro)-一種玉米赤霉烯酮的還原產(chǎn)物，經(jīng)美國藥物食品管理局(FDA)認(rèn)可，用作牛羊增重藥物，通過許多歐美國家大面積的推廣使用，證明它是一種新型的、無副作用的、效果顯著的促進(jìn)牛羊生長增重的物質(zhì)。本發(fā)明是通過對國內(nèi)分離到的玉米赤霉菌野生菌株進(jìn)行誘變、選育，獲得一株能夠在液體培養(yǎng)基中合成玉米赤霉烯酮的菌株，菌株編號D4-21。本發(fā)明填補(bǔ)了我國在生產(chǎn)及提煉玉米赤霉烯酮方面的空白。本發(fā)明特點D4-21菌株在改良察氏(Czapek)培養(yǎng)基(配方見表Ⅰ)上生長迅速，22°～25℃培養(yǎng)五天，菌落直徑可達(dá)9厘米。菌落白色，呈絨毛狀，產(chǎn)生紫紅色可溶性色素，在此固體培養(yǎng)基上不產(chǎn)生孢子，在此液體培養(yǎng)基中(不加瓊脂)可產(chǎn)生少量鐮刀形孢子。表Ⅰ改良察氏(Czapek)培養(yǎng)基配方<tablesid="table1"num="001"><tablealign="center">種類百分含量(%)蔗糖3硝酸鈉0.3磷酸氫二鉀0.1硫酸鎂0.05氯化鉀0.05酵母浸出膏0.1瓊脂1.5</table></tables>將D4-21菌株從冷藏斜面轉(zhuǎn)接到改良察氏培養(yǎng)基斜面上活化，22°～25℃培養(yǎng)4-5天，挑取少量菌絲接種到液體改良察氏培養(yǎng)基中，上搖床培養(yǎng)2-3天(培養(yǎng)溫度同上)，制成種子液。再將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(配方見表Ⅱ)在三角瓶或發(fā)酵罐中，22°-25℃培養(yǎng)基15-18天，即可合成大量的玉米赤霉烯酮。表Ⅱ發(fā)酵培養(yǎng)基配方<tablesid="table2"num="002"><tablealign="center">種類百分含量(%)葡萄糖18尿素0.27酵母浸出膏0.1磷酸氫二鉀0.05硫酸鎂0.025氯化鉀0.25</table></tables>將經(jīng)15-18天發(fā)酵所得的發(fā)酵液過濾，取其菌絲濾餅，加0.25%NaOH溶液浸泡1-2小時，再過濾，取其濾液，濾液用稀鹽酸調(diào)PH到2-3，再加入乙酸乙酯萃取，萃取后的乙酸乙酯經(jīng)濃縮得到玉米赤霉烯酮粗結(jié)晶，將此粗結(jié)晶脫色，再反復(fù)重結(jié)晶，即可得到玉米赤霉烯酮純結(jié)晶。玉米赤霉烯酮為純白色結(jié)晶，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有機(jī)溶劑和堿性水溶液中，微溶于己烷、石油醚等溶劑，不溶于中性或偏酸性水溶液。溶點為164°-165℃。紫外吸收光譜中，最高吸收峰在236、274和313納米處，此外，在253納米的紫外光照射下，呈現(xiàn)蘭綠色的熒光。玉米赤霉烯酮再經(jīng)過加氫還原，將其還原產(chǎn)物α-玉米赤霉醇(Zearalanol)制成高3毫米直徑2.5毫米的彈丸(每彈丸含量12mg)放入注射槍，即可埋植使用。牛的使用量為36毫克，毛重增重比對照高15%-20%;羊的使用量為12毫克，毛重增重比對照高5%-10%。并在牛羊的飼養(yǎng)過程中，使飼料轉(zhuǎn)化率提高10%。本發(fā)明的生產(chǎn)實例從玉米赤霉菌D4-21菌株的冷藏斜面上取少量菌絲，接種于改良察氏培養(yǎng)基斜面上活化，22°-25℃培養(yǎng)4-5天，再取活化斜面上的少量菌絲接種于裝有液體改良察氏培養(yǎng)基的三角瓶中，裝量為三角瓶容積的五分之一，上搖床培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)溫度同上，至此，制得種子液。將種子液接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量1%-5%，放于轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分的搖床上培養(yǎng)15-18天(培養(yǎng)溫度同上)，發(fā)酵過程結(jié)束。如將種子液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度同上，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分，通氣量在發(fā)酵過程中在1∶0.3(vvm)和1∶0.8(vvm)之間調(diào)節(jié)，培養(yǎng)15-18天，終止發(fā)酵。玉米赤霉烯酮的提煉過程取1升發(fā)酵液過濾，所得菌絲濾餅用1000毫升0.25%NaOH溶液浸泡1-2小時后再過濾，所得濾液用稀鹽酸調(diào)酸，終止PH為2-3，玉米赤霉烯酮即可沉淀下來，然后加入等體積的乙酸乙酯萃取;也可將發(fā)酵液過濾后的濾餅直接用乙酸乙酯或無水乙醇浸泡萃取。將萃取所得乙酸乙酯濃縮，可得到1.8克玉米赤霉烯酮粗結(jié)晶，將此粗結(jié)晶再溶于乙酸乙酯或無水乙醇中，脫色后重結(jié)晶2-3次，可得到1.6克玉米赤霉烯酮純結(jié)晶。權(quán)利要求1.一種利用玉米赤霉菌(Gibberellazeae)D4--21菌株進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)玉米赤霉烯酮的工藝，該工藝包括D4--21菌株的種子培養(yǎng)工藝、發(fā)酵培養(yǎng)工藝以及玉米赤霉烯酮的提煉工藝。2.按權(quán)利要求1所述的種子培養(yǎng)工藝，其特點是D4-21菌株經(jīng)活化，接種于含有3%蔗糖、0.3%硝酸鈉、0.1%酵母浸出膏、0.1%磷酸氫二鉀、0.05%硫酸鎂、0.05%氯化鉀的種子培養(yǎng)基內(nèi)，22°-25℃，搖床培養(yǎng)2-3天。3.按權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特點是將種子液接種于含有18%葡萄糖、0.27%尿素、0.1%酵母浸出膏、0.05%磷酸氫二鉀，0.025%硫酸鎂、0.025%氯化鉀的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，22°-25℃，搖瓶或發(fā)酵罐培養(yǎng)15-18天。4.按權(quán)利要求1所述的提煉工藝，其特點是將發(fā)酵培養(yǎng)所得的菌絲用0.25%氫氧化鈉溶液浸泡，將過濾所得的濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH到2-3，再用乙酸乙酯萃取，將萃取所得的乙酸乙酯濃縮，得粗結(jié)晶。5.按權(quán)利要求1和4所述的提煉工藝，其特點是將菌絲濾餅用乙酸乙酯或無水乙醇直接浸泡，將過濾所得溶媒濃縮，得粗結(jié)晶。全文摘要本發(fā)明提供了玉米赤霉烯酮的液體發(fā)酵及其提蟓生產(chǎn)工藝。玉米赤霉菌D4-21經(jīng)活化、種子制備、發(fā)酵培養(yǎng)等過程，可產(chǎn)生大量的玉米赤霉烯酮。然后將發(fā)酵所得菌絲經(jīng)堿溶解、酸沉淀、溶媒萃取或直接浸泡、濃縮、結(jié)晶等過程，最終可得到純品。該物質(zhì)具有促進(jìn)牛羊蛋白質(zhì)合成，并有提高飼料轉(zhuǎn)化率的能力。文檔編號C12P17/08GK1057860SQ90103159公開日1992年1月15日申請日期1990年7月4日優(yōu)先權(quán)日1990年7月4日發(fā)明者李季倫,王秋旗,許春蘭,王學(xué)燕,王濱申請人:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物學(xué)院