一種調(diào)控植物白粉病抗性的r基因tn2的克隆及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種調(diào)控植物白粉病抗性的R基因TN2的克隆及應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種調(diào)控植物對(duì)白粉菌抗性的方法。所述TN2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2，其中7個(gè)位點(diǎn)發(fā)生單個(gè)氨基酸的改變和2個(gè)位點(diǎn)突變?cè)斐煞g提前終止，都能抑制exo70B1突變體對(duì)白粉菌的抗性以及白粉菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。但是對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育不產(chǎn)生明顯影響。TN2可以應(yīng)用到基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，調(diào)控植物對(duì)白粉菌的抗性反應(yīng)。
【專利說明】一種調(diào)控植物白粉病抗性的R基因 TN2的克隆及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種調(diào)控植物白粉病抗性的R基因 TN2的克 隆及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 在自然環(huán)境中，植物不斷受到各種病原菌的侵染，包括細(xì)菌、真菌以及病毒等。 為了抵御病原菌的入侵，植物進(jìn)化出復(fù)雜的防御系統(tǒng)，分為兩個(gè)層次：病原菌相關(guān)分子模 式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)引發(fā)的免疫反應(yīng) PTI 和效應(yīng)子 (effector)引發(fā)的免疫反應(yīng)ETI。首先，病原菌通過氣孔，表皮間隙甚至是受傷部位進(jìn)入植 物體內(nèi)，病原菌相關(guān)分子模式，例如鞭毛蛋白、延伸因子和幾丁質(zhì)等，被位于細(xì)胞膜上的模 式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR)識(shí)別，觸發(fā)PTI免疫反應(yīng)；但是，病原菌 在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，進(jìn)化出新的機(jī)制來抑制PTI。如細(xì)菌通過三型分泌系統(tǒng)，向植物體內(nèi)釋 放效應(yīng)子，抑制植物的基礎(chǔ)抗性。同時(shí)，植物又進(jìn)化出R蛋白，能識(shí)別病原菌分泌的效應(yīng)子， 引發(fā)植物的ETI免疫反應(yīng)。
[0003] 植物體中，最大的一類R蛋白是NBS-LRR類，根據(jù)N端的結(jié)構(gòu)不同，又分為 CC-NB-LRR和TIR-NB-LRR。R蛋白在植物體內(nèi)起著十分重要的作用，它可以直接與病原菌 的效應(yīng)子相互作用，或通過監(jiān)視目標(biāo)蛋白的修飾或變化來激活R蛋白而引發(fā)ETI。ETI導(dǎo)致 的抗病反應(yīng)是植物入侵部位的超敏反應(yīng)（Hypersensitive Response,·)，造成植物在病原 菌入侵部位發(fā)生活性氧的積累（oxidative burst)，胼胝質(zhì)的沉積和細(xì)胞程序性死亡（POT) 等。PCD切斷了病原菌的營(yíng)養(yǎng)來源，同時(shí)釋放抗菌物質(zhì)，從而限制病原菌的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。研 宄表明，在植物體內(nèi)導(dǎo)入外源抗病基因能夠提高植物對(duì)病原菌的抗性。例如：RPW8是在擬 南芥上克隆的一個(gè)非典型的R基因，在煙草中過表達(dá)RPW8基因能提高煙草對(duì)白粉病菌的抗 性。Xa21是水稻中第一個(gè)被克隆的抗白葉枯病的R基因，將Xa21基因轉(zhuǎn)入水稻主栽品種表 現(xiàn)對(duì)白葉枯病的高度抗性和廣譜抗性。因此，尋找更多的抗病基因，通過基因工程改良植物 的抗病性變得十分重要。
[0004] 白粉菌是一種活體營(yíng)養(yǎng)型真菌，能侵染大麥、小麥、葡萄、番茄等多個(gè)植物種的葉 片、莖部、花朵和果實(shí)等部位。在全世界范圍內(nèi)，大概有500多種白粉菌小種侵染10, 000多 種植物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0005] 在研宄植物對(duì)白粉菌的抗病機(jī)制中，發(fā)現(xiàn)，擬南芥胞吐復(fù)合體的亞基成員EX070B1 突變后，對(duì)白粉菌表現(xiàn)增強(qiáng)的抗性，而且與野生型相比，PRl基因的表達(dá)增強(qiáng)，水楊酸的含量 升高，胼胝質(zhì)和過氧化氫的積累增加。以上說明，EX070B1是調(diào)控植物對(duì)白粉菌抗性的重要 因子。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種抑制植物過度激活抗性的方法。
[0007] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：突變植物中的TN2蛋白編碼基因，實(shí)現(xiàn)抑制植 物抗性的過度激活；
[0008] 所述TN2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0009] 上述方法中，所述抑制植物抗性的過度激活體現(xiàn)在促進(jìn)植物葉片表面白粉菌的菌 絲生長(zhǎng)、增加植物葉片表面白粉菌分生孢子梗數(shù)的產(chǎn)生、抑制植物中PRl基因的表達(dá)和/或 抑制植物中游離水楊酸的積累。
[0010] 上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述植物具體為擬南芥突變 體 exo70Bl ;
[0011] 所述ex〇70Bltn2突變植物中的TN2蛋白編碼基因?yàn)橥蛔兊腡N2基因。利用擬南 芥 eX〇70Bl突變體與擬南芥tn2突變體雜交，獲得雜交后代ex〇70Bltn2。
[0012] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種TN2突變蛋白。
[0013] 本發(fā)明提供的TN2突變蛋白，其為如下1)-9):
[0014] 1)TN2突變蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2第1-43位氨基酸殘基組成的序 列；
[0015] 2) TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第27位精氨酸突變?yōu)榻M氨酸， 序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；
[0016] 3)TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第82位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸， 序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；
[0017] 4)TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第82位丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸， 序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；
[0018] 5) TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第1-218位氨基酸殘基組成的 序列；
[0019] 6) TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第222位甘氨酸突變?yōu)榫彼幔?序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；
[0020] 7) TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第310位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；
[0021] 8) TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第318位甘氨酸突變?yōu)榫彼幔?序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；
[0022] 9) TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第333位丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸， 序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列。
[0023] 上述蛋白的編碼DNA分子，為如下1)-9):
[0024] 1)上述蛋白中的1)的編碼DNA分子為序列A第1-132位核苷酸，所述序列A為將 序列表中序列1自第130位C突變?yōu)門，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序 列；
[0025] 2)上述蛋白中的2)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第80位G突變?yōu)锳，序 列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列；
[0026] 3)上述蛋白中的3)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第244位G突變?yōu)锳，序 列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列；
[0027] 4)上述蛋白中的4)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第245位C突變?yōu)門，序 列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列；
[0028] 5)上述蛋白中的5)的編碼DNA分子為序列B第1-657位核苷酸，所述序列B為將 序列表中序列1第656位G突變?yōu)锳，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序 列；
[0029] 6)上述蛋白中的6)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第664位G突變?yōu)锳，序 列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列；
[0030] 7)上述蛋白中的7)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第928位G突變?yōu)锳，序 列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列；
[0031] 8)上述蛋白中的8)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第952位G突變?yōu)锳，序 列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列；
[0032] 9)上述蛋白中的9)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第998位C突變?yōu)門，序 列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列。
[0033] 上述蛋白或上述的編碼DNA分子或含有其編碼基因的重組載體在調(diào)控植物對(duì)白 粉病抗性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0034] 所述調(diào)控植物對(duì)白粉病抗性具體為抑制植物對(duì)白粉病抗性；
[0035] 所述植物具體為單子葉植物或雙子葉植物，所述植物進(jìn)一步具體為擬南芥。
[0036] R蛋白TN2或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體在調(diào)控植物對(duì)白粉病抗性 中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述R蛋白TN2的氨基酸序列為序列表中序列2 ;
[0037] 所述調(diào)控植物對(duì)白粉病抗性具體為提高植物對(duì)白粉病抗性；
[0038] 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述植物具體為擬南芥。
[0039] ex〇70Bl突變體植物對(duì)白粉菌的抗性依賴于TN2。TN2基因表達(dá)的蛋白在植物抗白 粉病中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述TN2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0040] 上述應(yīng)用中，exo70Bl植物抗白粉病依賴于TN2。TN2缺失后促進(jìn)植物葉片表面白 粉菌的菌絲生長(zhǎng)、增加植物葉片表面白粉菌分生孢子梗數(shù)的產(chǎn)生、抑制植物中PRl基因的 表達(dá)和/或抑制植物中游離水楊酸的積累，表明TN2在抗白粉病中發(fā)揮重要作用。
[0041] 上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南 芥，上述擬南芥具體為擬南芥突變體ex 〇70Bl。
[0042] 上述植物中TN2蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為突變的喪失功能的TN2蛋白。
[0043] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，突變了 TN2編碼基因，能抑制ex〇70Bl突變體對(duì)白粉菌的抗性 以及白粉菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，但是對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育不產(chǎn)生明顯影響。TN2可以應(yīng)用到基因 工程【技術(shù)領(lǐng)域】，調(diào)控植物對(duì)白粉菌的抗病反應(yīng)。TN2的突變不僅抑制了 eX〇70Bl介導(dǎo)的所有 抗病表型，而且受白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)，暗示R基因 TN2在調(diào)控植物抗病反應(yīng)中的重要作用。這 為將來通過基因工程技術(shù)，把TN2基因應(yīng)用到作物中，改良作物的不良性狀，提供寶貴的基 因資源。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 圖1為TN2基因的突變抑制了 ex〇70Bl突變體對(duì)白粉菌的抗性和白粉菌誘導(dǎo)的細(xì) 胞死亡
[0045] 圖2為TN2基因的突變抑制了 exo70Bl突變體中PRl基因的表達(dá)
[0046] 圖3為TN2基因的突變抑制了 ex〇70Bl突變體中游離水楊酸的積累
[0047] 圖4為TN2基因的克隆
[0048] 圖5為TN2基因受白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)

【具體實(shí)施方式】
[0049] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0050] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0051] 實(shí)施例1、TN2突變抑制eX〇70Bl突變體白粉菌抗性
[0052] 1、突變體exo70Bltn2的獲得
[0053] 通過EMS誘變，獲得exo70Bl的突變體庫。在M2代，篩選到能抑制exo70Bl介導(dǎo) 的白粉菌抗性的突變體ex 〇70Bltn2。
[0054] 突變體exo70Bltn2也可以按照如下方法制備：將突變體exo70Bl (N717829)與突 變體tn2雜交，得到雜交Fl代，F(xiàn)l代自交獲得的F2代中通過篩選可獲得純合的雙突變體 exo70Bltn2〇
[0055] 野生型擬南芥Col-O (下文中簡(jiǎn)稱野生型擬南芥），記載在如下文獻(xiàn)中：Catherine A. Frye, Dingzhong Tang, and Roger ff. Innes (2001). Negative regulation of defense responses in plants by a conserved MAPKK kinase. PNAS 98(1) :373-378;公眾可從中 國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研宄所獲得。
[0056] 突變體exo70Bl(N717829，EX070Bl的等位突變體，均為T-DNA插入突變）購自The European Arabidopsis Stock Centre, NASC)，與野生型擬南芥 Col-O 相比，僅 EX070B1 基 因（核苷酸序列為序列3,其編碼的蛋白氨基酸序列為序列4)有突變，其余核苷酸序列均與 野生型擬南芥相同；
[0057] 突變體tn2,購自ABRC，SALK_204239 ;與野生型擬南芥Col-O相比，僅tn2基因（核 苷酸序列為序列1，其編碼的蛋白氨基酸序列為序列2)有突變，其余核苷酸序列均與野生 型擬南芥相同。
[0058] 經(jīng)過基因組學(xué)檢測(cè)和測(cè)序，雙突變體exo70Bltn2與野生型擬南芥Col-O相比， 僅EX070B1基因和TN2基因有突變，其余核苷酸序列均與野生型擬南芥相同；雙突變 體ex 〇70Bltn2與突變體ex〇70Bl相比，僅TN2基因有突變，其余核苷酸序列均與突變體 exo70Bl 相同。
[0059] 2、TN2突變抑制exo70Bl突變體白粉菌抗性
[0060] 1)表型觀察
[0061] 將擬南芥野生型植株Col-O (WT)、突變體exo70Bl和雙突變體exo70Bltn2 種植在22 °C，9小時(shí)光照的溫室中，生長(zhǎng)4周后，大量接種白粉病菌Golovinomyces Cichoracearum(Yiping Wang1Marc T. Nishimura, Ting Zhao and Dingzhong Tang (2011) ATG2, an autophagy-related protein, negatively affects powdery mildew resistance and mildew-induced cell death in Arabidopsis. The Plant Journal 68, 74 - 87,100個(gè) 孢子/mm2)。接菌7天后，進(jìn)行抗病表型鑒定。對(duì)有代表性的整株和單個(gè)葉片進(jìn)行照相，并 進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)（sigma)染色（Trypan Blue Staining)。
[0062] 結(jié)果如圖1A-1C所示，IA和IB為接種白粉病菌7天后的有代表性的整株和葉片 的表型圖片，IC為接種白粉病菌后進(jìn)行臺(tái)盼蘭染色的圖片?？梢钥闯觯追劬泳?天 后，野生型擬南芥的葉片表面有大量的白粉菌；ex〇70Bl突變體的葉片只有少量白粉菌 的生長(zhǎng)，并且出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡，說明其與野生型擬南芥相比，具有抗白粉病抗性；而 ex〇70Bltn2雙突變體與野生型相似，葉片表面有大量的菌絲和孢子，沒有產(chǎn)生細(xì)胞死亡 (1A，1B)，表明其與ex 〇70Bl突變體相比，白粉病抗性降低。臺(tái)盼蘭能把白粉病菌的菌絲結(jié) 構(gòu)和死亡的細(xì)胞染成藍(lán)色，臺(tái)盼蘭染色的結(jié)果（1C)也證明了 TN2突變抑制ex〇70Bl介導(dǎo)的 植物白粉病抗性。
[0063] 2)過氧化氫的積累檢測(cè)
[0064] 為進(jìn)一步分析exo70Bltn2對(duì)白粉菌的反應(yīng)，將擬南芥野生型植株Col-O(WT)、突 變體exo70Bl和雙突變體exo70Bltn2種植在22°C，9小時(shí)光照的溫室中，生長(zhǎng)4周后，每個(gè) 株系均小量接種白粉病菌Golovinomyces Cichoracearum(l個(gè)孢子/mm2)。接菌2天后，對(duì) 葉片進(jìn)行DAB染色，檢測(cè)過氧化氫的積累。DAB染劑能與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過氧化氫結(jié)合，形成 不可溶、肉眼可辨認(rèn)的紅棕色物質(zhì)。
[0065] 結(jié)果如圖ID所示，可以看出，突變體exo70Bl產(chǎn)生了大量的過氧化氫，exo70Bltn2 雙突變體與野生型相似，只有少量的過氧化氫的積累。
[0066] 在接菌后5天，對(duì)各個(gè)株系單個(gè)葉片進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色后鏡檢，對(duì)單孢子分生孢子 梗進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0067] 結(jié)果如圖IE所示，exo70Bl突變體顯著低于野生型，exo70Bltn2雙突變體恢復(fù)到 野生型的水平。
[0068] 上述結(jié)果表明，抑制植物中tn2基因的表達(dá)使其突變，導(dǎo)致該植物的白粉病抗性 降低。
[0069] 實(shí)施例2、TN2突變抑制exo70Bl突變體中PRl基因（AY064023,2001年11月19 日提交）的表達(dá)
[0070] 為了驗(yàn)證TN2基因是否參與植物的抗病反應(yīng)，用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，檢測(cè)Col-ο、 突變體ex 〇70Bl和雙突變體ex〇70Bltn2在接種白粉菌前后PRl基因的表達(dá)模式。所用儀 器為德國(guó) Eppendorf Mastercyclereprealplex 4S，具體如下：
[0071] 將生長(zhǎng)4周的擬南芥野生型植株Col-O (WT)、突變體exo70Bl和雙突變體 ex〇70Bltn2大量接種白粉菌3天后，分別取未接菌和接菌3天的植株葉片，放入液氮中速 凍，然后在-70 °C儲(chǔ)存，提RNA備用。
[0072] 用 Trizol (Invitrogen)試劑提取葉片的總 RNA，用 DNase I (Promega)消化污染 的DNA半小時(shí)，再用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (Invitrogen)，在20 μ L反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)2 μ g總RNA獲 得第一鏈cDNA ;稀釋5倍留作PCR模板備用。PCR反應(yīng)體系包括：SYBR Green supermix reagent (Takara) :10 μ L，cDNA 模板：2 μ L，10 μ M 引物：1 μ L，用重蒸水把體系補(bǔ)至 20 μ L0 PCR反應(yīng)程序：95 °C預(yù)變性2min，進(jìn)入循環(huán)后，95 °C變性15s，55 °C退火15s，72 °C延伸 20s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。引物序列：PR1F:5-CGGAGCTACGCAGAACAACT_3 ; R:5-CTCGCTAACCCACATGTTCA-3 ；
[0073] ACT2 作為內(nèi)標(biāo)，ACT2 F :5-TCTCCCGCTATGTATGTCGCC-3, ACT2 R :5-GTCACGT CCAGCAAGGTCAAGA--3〇
[0074] 結(jié)果如圖2所示，接種白粉菌前后，exo70Bl突變體中PRl基因的表達(dá)顯著高于野 生型，TN2基因突變后，exo70Bltn2雙突變體中PRl基因的表達(dá)恢復(fù)到野生型的水平，表明 TN2基因參與了植株對(duì)白粉病菌的抗性反應(yīng)。
[0075] 實(shí)施例3、TN2突變抑制了 ex〇70Bl突變體中游離水楊酸的積累
[0076] 水楊酸是調(diào)控植物抗病反應(yīng)的中心分子。依賴水楊酸的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)植物建立局部 和系統(tǒng)性抗性至關(guān)重要。檢測(cè)了 Col-Ο、突變體exo70Bl和雙突變體exo70Bltn2在接種白 粉菌前后的游離水楊酸的含量。
[0077] 將擬南芥野生型植株Col-O(WT)、突變體exo70Bl和雙突變體exo70Bltn2的幼苗 大量接種白粉菌，在22°C，9小時(shí)光照/15小時(shí)黑暗條件下正常生長(zhǎng)4周后，分別取每個(gè)材 料的葉片，液氮中速凍，然后在-70 °C儲(chǔ)存，提水楊酸備用。
[0078] 用高效液相色譜測(cè)定水楊酸的含量，參考文獻(xiàn)所述方法Xin Li, Yuelin Zhang, Joseph D Clarke, Yan Li, Xinnian Dong(1999)Identification and cloning of a negative regulator of systemic acquired resistance，SNI1，through a screen for suppressors of nprl-l. Cell 98:329_339〇
[0079] 結(jié)果如圖3所示，接種白粉菌前后，exo70Bl突變體中游離水揚(yáng)酸的含量顯著高于 野生型，TN2基因突變后，ex 〇70Bltn2雙突變體中游離水揚(yáng)酸的含量下降到野生型的水平。 表明TN2基因調(diào)控了植株對(duì)白粉病菌的抗性反應(yīng)。
[0080] 實(shí)施例4、TN2基因的獲得
[0081] 為了克隆TN2基因，將exo70Bltn2突變體與擬南芥野生型Landsberg生態(tài)型植 株進(jìn)行雜交，獲得的Fl代自交產(chǎn)生F2代。從F2代植株中選擇含有ex 〇70Bl突變但與 tn2eX〇70Bl突變體表型相似的40個(gè)單株，從5條染色體上分別選5個(gè)均勻分布在染色體的 定位標(biāo)記（http://signal. salk. edu/genome/SSLP_info/SSLPsordered.html)進(jìn)行基因 型鑒定。粗定位的結(jié)果將TN2定位在1號(hào)染色體。TN2基因的核苷酸序列為序列表中序列 1，其編碼的蛋白的氣基酸序列為序列表中序列2。
[0082] 隨后，利用精細(xì)定位的標(biāo)記，對(duì)2000株左右的F2植株進(jìn)彳丁基因型鑒定，把TN2定 位到BAC克隆F1L3。對(duì)該區(qū)域內(nèi)所有基因進(jìn)行測(cè)序，尋找有意義的突變基因。同時(shí)，對(duì) ex〇70Bltn2基因組進(jìn)行重測(cè)序，與野生型基因組進(jìn)行比較，尋找定位區(qū)域內(nèi)的基因突變。
[0083] 經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，有9個(gè)等位突變體的突變位點(diǎn)發(fā)生在TN2(AT1G17615)基因的⑶S， 重測(cè)序結(jié)果與之相同。TN2基因包括TIR和NBS兩個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖4A)，是一個(gè)非典型的R基 因。這9個(gè)TN2基因的等位突變體，有3個(gè)在TIR結(jié)構(gòu)域發(fā)生錯(cuò)義突變，4個(gè)發(fā)生在NBS結(jié) 構(gòu)域，有2個(gè)突變導(dǎo)致翻譯提前終止（圖4B)。
[0084] 9個(gè)tn2突變體具體如下：
[0085] tn2突變體1為序列表中序列2第1-43位氨基酸殘基組成的序列；其編碼基因核 苷酸序列為序列A第1-132位核苷酸，序列A為將序列表中序列1自第130位C突變?yōu)門， 序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列；與TN2相比，將序列表中序列1第 130位C突變?yōu)門，提前終止蛋白表達(dá)；
[0086] tn2突變體2氨基酸序列為將序列表中序列2第27位R (精氨酸）突變?yōu)镠 (組氨 酸），序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；tn2突變體2編碼基因核 苷酸序列為將序列表中序列1第80位G突變?yōu)锳，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到 的核苷酸序列；
[0087] tn2突變體3氨基酸序列為將序列表中序列2第82位A (丙氨酸）突變?yōu)門 (蘇氨 酸），序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；tn2突變體3編碼基因核 苷酸序列為將序列表中序列1第244位G突變?yōu)锳，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到 的核苷酸序列；
[0088] tn2突變體4氨基酸序列為將序列表中序列2第82位A (丙氨酸）突變?yōu)閂 (纈氨 酸），序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；tn2突變體4編碼基因核 苷酸序列為將序列表中序列1第245位C突變?yōu)門，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到 的核苷酸序列；
[0089] tn2突變體5氨基酸序列為將序列表中序列2第1-218位氨基酸殘基組成的序列； tn2突變體5編碼基因核苷酸序列為序列B第1-657位核苷酸，序列B為將序列表中序列1 第656位G突變?yōu)锳，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列；
[0090] tn2突變體6氨基酸序列為將序列表中序列2第222位G (甘氨酸）突變?yōu)镽(精 氨酸），序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；tn2突變體6編碼基因 核苷酸序列為將序列表中序列1第664位G突變?yōu)锳，序列表中序列1的其它核苷酸不變得 到的核苷酸序列；
[0091] tn2突變體7氨基酸序列為將序列表中序列2第310位E (谷氨酸）突變?yōu)镵 (賴 氨酸），序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；tn2突變體7編碼基因 核苷酸序列為將序列表中序列1第928位G突變?yōu)锳，序列表中序列1的其它核苷酸不變得 到的核苷酸序列；
[0092] tn2突變體8氨基酸序列為將序列表中序列2第318位G (甘氨酸）突變?yōu)镽(精 氨酸），序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；tn2突變體8編碼基因 核苷酸序列為將序列表中序列1第952位G突變?yōu)锳，序列表中序列1的其它核苷酸不變得 到的核苷酸序列；
[0093] tn2突變體9氨基酸序列為將序列表中序列2第333位A (丙氨酸）突變?yōu)閂 (纈 氨酸），序列表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列；tn2突變體9編碼基因 核苷酸序列為將序列表中序列1第998位C突變?yōu)門，序列表中序列1的其它核苷酸不變得 到的核苷酸序列。
[0094] 實(shí)施例5、TN2基因受白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)
[0095] 作為一個(gè)植物R基因，TN2的突變抑制ex〇70Bl介導(dǎo)的白粉菌的抗性和白粉菌誘 導(dǎo)的細(xì)胞死亡。為了查明TN2基因是否直接受白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)，用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，檢 測(cè)野生型Col-O在接種白粉菌1天、3天和5天后TN2基因的表達(dá)。
[0096] 將生長(zhǎng)4周的野生型Col-O植株大量接種白粉菌，分別在接菌前、接菌1天、3天和 5天后剪取植株葉片，放入液氮中速凍，然后在_70°C儲(chǔ)存，提RNA備用。RNA提取方法、PCR 反應(yīng)液和PCR反應(yīng)程序如前所述。引物序列：TN2 F :5GGCTCATGAGTCAGAAAG3 ；TN2 R ： 5GAAGATTCAGTCCCGGAT-3。
[0097] 結(jié)果如圖5所示，接種白粉菌3天和5天后，TN2基因的表達(dá)大約是未接菌的9倍 和25倍，表明TN2基因受白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)。
[0098] 實(shí)施例6、擬南芥白粉菌抗性相關(guān)基因 TN2在作物抗病改良中的應(yīng)用
[0099] 擬南芥中Col-O生態(tài)型共有21個(gè)TIR-NBS類基因，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)其中一些TN基因在 植物免疫中起作用。AtTNlO, AtTNll, AtTN2和AtTN3在感染白粉菌（Blumeriagraminis, Er ysiphecichoracearum)和丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae)后大量誘導(dǎo)表達(dá)。在 煙草中瞬時(shí)過表達(dá)一些TN基因，能發(fā)生超敏反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
[0100] TN2基因，作為其中一個(gè)TIR-NBS類R基因，不僅受白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)，而且抑制胞吐 復(fù)合體亞基突變體ex〇70Bl的所有白粉菌的抗病表型，說明它在調(diào)控植物對(duì)白粉菌抗性中 的重要作用。利用基因工程技術(shù)，通過在植物中過表達(dá)TN2,有希望獲得具有優(yōu)良抗病性狀 的種質(zhì)材料。
【權(quán)利要求】
1. 一種抑制植物過度激活抗性的方法，包括如下步驟：突變植物中的TN2基因，實(shí)現(xiàn)抑 制植物抗性的過度激活； 所述TN2基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制植物過度激活抗性體現(xiàn)在促進(jìn) 植物葉片表面白粉菌的菌絲生長(zhǎng)、增加植物葉片表面白粉菌分生孢子梗數(shù)的產(chǎn)生、抑制植 物中PR1基因的表達(dá)和/或抑制植物中游離水楊酸的積累。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述植物具體為擬南芥突變體ex〇70Bl ; 所述ex〇70Bltn2突變植物中的TN2蛋白編碼基因?yàn)橥蛔兊腡N2基因； 所述eX〇70Bltn2突變植物為用擬南芥突變體eX〇70Bl與擬南芥tn2突變體雜交，獲得 雜交后代exo70Bltn2。
4. 一種TN2突變蛋白，其為如下1)-9): 1. TN2突變蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2第1-43位氨基酸殘基組成的序列； 2. TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第27位精氨酸突變?yōu)榻M氨酸，序列 表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列； 3. TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第82位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，序列 表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列； 4. TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第82位丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，序列 表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列； 5. TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第1-218位氨基酸殘基組成的序 列； 6. TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第222位甘氨酸突變?yōu)榫彼?，序?表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列； 7. TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第310位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，序?表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列； 8. TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第318位甘氨酸突變?yōu)榫彼?，序?表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列； 9. TN2突變蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第333位丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，序列 表中序列2的其它氨基酸殘基不變得到的氨基酸序列。
5. 權(quán)利要求4所述蛋白的編碼DNA分子，為如下1) -9): 1) 權(quán)利要求4所述蛋白中的1)的編碼DNA分子為序列A第1-132位核苷酸，所述序列 A為將序列表中序列1自第130位C突變?yōu)門，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核 苷酸序列； 2) 權(quán)利要求4所述蛋白中的2)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第80位G突變?yōu)?A，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列； 3) 權(quán)利要求4所述蛋白中的3)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第244位G突變 為A，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列； 4) 權(quán)利要求4所述蛋白中的4)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第245位C突變 為T，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列； 5) 權(quán)利要求4所述蛋白中的5)的編碼DNA分子為序列B第1-657位核苷酸，所述序列 B為將序列表中序列1第656位G突變?yōu)锳，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷 酸序列； 6) 權(quán)利要求4所述蛋白中的6)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第664位G突變 為A，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列； 7) 權(quán)利要求4所述蛋白中的7)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第928位G突變 為A，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列； 8) 權(quán)利要求4所述蛋白中的8)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第952位G突變 為A，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列； 9) 權(quán)利要求4所述蛋白中的9)的編碼DNA分子為將序列表中序列1第998位C突變 為T，序列表中序列1的其它核苷酸不變得到的核苷酸序列。
6. 權(quán)利要求4所述蛋白或權(quán)利要求5所述的編碼DNA分子或含有其編碼基因的重組載 體在調(diào)控植物對(duì)白粉病抗性中的應(yīng)用； 所述調(diào)控植物對(duì)白粉病抗性具體為抑制植物抗性的過度激活； 所述植物具體為單子葉植物或雙子葉植物，所述植物進(jìn)一步具體為擬南芥ex〇70Bl。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抑制植物過度激活的抗性體現(xiàn)在促 進(jìn)植物葉片表面白粉菌的菌絲生長(zhǎng)、增加植物葉片表面白粉菌分生孢子梗數(shù)的產(chǎn)生、抑制 植物中PR1基因的表達(dá)和/或抑制植物中游離水楊酸的積累。 8. R蛋白TN2或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體在調(diào)控植物對(duì)白粉病抗性中 的應(yīng)用；所述R蛋白TN2的氣基酸序列為序列表中序列2 ; 所述TN2蛋白調(diào)控植物對(duì)白粉病抗性具體為提高植物對(duì)白粉病抗性； 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述植物具體為擬南芥。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104497115SQ201510008986
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月8日
【發(fā)明者】芮璐, 趙婷, 唐定中 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所