一種人外周血單個核細(xì)胞的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人外周血單個核細(xì)胞的分離方法，結(jié)合了羥乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度離心法兩種方法的優(yōu)點，針對大容量血液樣本的分離特點，先用羥乙基淀粉沉淀法去除大部分的紅細(xì)胞，然后在空氣中自然沉降，再用Ficoll密度梯度離心法對單個核細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步純化，從而得到純度超過95％，活力超過85％的PBMC。相比沒有在空氣中自然沉降的方法，獲得的細(xì)胞活力和純度更高。
【專利說明】一種人外周血單個核細(xì)胞的分離方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞分離方法，具體地涉及一種人外周血單個核細(xì)胞的分離方法。

【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞治療是近幾年興起的疾病治療新技術(shù)，是指利用某些具有特定功能的細(xì)胞的特性，采用生物工程方法獲取和/或通過體外擴(kuò)增、特殊培養(yǎng)等處理后，使這些細(xì)胞具有增強(qiáng)免疫、殺死病原體和腫瘤細(xì)胞、促進(jìn)組織器官再生和機(jī)體康復(fù)等治療功效，從而達(dá)到治療疾病的目的。
[0003]細(xì)胞治療以其良好的療效，副作用小，更個體化、個性化等獨特的優(yōu)勢，為一些難治性疾病的治療，提供了一種選擇，有時甚至是最后的選擇。在當(dāng)前和今后很長的歷史階段，細(xì)胞治療都將在臨床治療中擔(dān)當(dāng)重要的角色，二十一世紀(jì)將是細(xì)胞治療發(fā)揮重要作用的時代。
[0004]在免疫細(xì)胞治療中，一般采用輕乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)離心沉淀法或Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。采用羥乙基淀粉離心沉淀法雖然在操作上比較簡便，但是細(xì)胞分離的效果不佳，得到的細(xì)胞純度難以滿足要求，有較多的血小板、紅細(xì)胞及粒細(xì)胞等。而采用Ficoll密度梯度離心法，紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的白膜層細(xì)胞，就可從外周血中分離得到單個核細(xì)胞。這個方法所得到的細(xì)胞純度較好，但是對操作上的要求比較高，如果操作不夠謹(jǐn)慎，分離得到的細(xì)胞在數(shù)量和純度上都會有較大影響。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]現(xiàn)有技術(shù)中采用羥乙基淀粉離心沉淀法雖然在操作上比較簡便，但是細(xì)胞分離的效果不佳，得到的細(xì)胞純度難以滿足要求，有較多的血小板、粒細(xì)胞及紅細(xì)胞等。而Ficoll密度梯度離心法所得到的細(xì)胞純度較好，但是對樣本體積上的要求有一定的限制，如果樣本體積超過50ml，分離的效果會大大降低。此外，不同的離心力與離心時間對細(xì)胞分離的效果也有較大影響，采用不同的離心參數(shù)分離出來的細(xì)胞，純度和活力都有很大的差異。
[0006]本發(fā)明的目的是結(jié)合羥乙基淀粉沉淀以及Ficoll密度梯度離心法，對PBMC的分離方法進(jìn)行改進(jìn)，尤其對于大體積(>50ml)的血液樣本分離更具優(yōu)勢。
[0007]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0008]本發(fā)明的發(fā)明人通過研宄發(fā)現(xiàn):提高PBMC分離效果的關(guān)鍵之一是在保證分離得到的PBMC細(xì)胞的活力及數(shù)量的前提下，減少血小板、紅細(xì)胞及粒細(xì)胞等雜細(xì)胞的比例，提高PBMC細(xì)胞的純度。本發(fā)明通過不斷地摸索及驗證，首先使用羥乙基淀粉沉淀，在空氣中自然沉降后，再采用Ficoll密度梯度離心的分離方法，得到純度和活力都較高的PBMC。
[0009]現(xiàn)有技術(shù)中一般采用羥乙基淀粉沉淀法或者Ficoll密度梯度離心法。本發(fā)明結(jié)合了羥乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度離心法兩種方法的優(yōu)點，針對大容量血液樣本的分離特點，先用羥乙基淀粉沉淀法去除大部分的紅細(xì)胞，然后在空氣中自然沉降，再用Ficoll密度梯度離心法對單個核細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步純化，從而得到純度超過95%，活力超過85%的PBMC。相比沒有在空氣中自然沉降的方法，獲得的細(xì)胞活力和純度更高。
[0010]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0011]一種人外周血單個核細(xì)胞的分離方法，包括以下步驟:
[0012](I)將外周血離心后，上層為血漿，下層為血細(xì)胞沉淀；
[0013](2)在下層血細(xì)胞沉淀中加入等體積的羥乙基淀粉溶液，羥乙基淀粉溶液的濃度為4% -10% g/mL,混合均勾后在空氣中自然沉降15?35min ；
[0014](3)將上清液緩慢轉(zhuǎn)移至Ficoll淋巴細(xì)胞分離液表面，離心力為600g?800g，離心 20 ?30min ；
[0015](4)離心后從下到上分為4層，依次為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層、淋巴細(xì)胞分離液層、白膜層和血楽層；吸取白膜層，重懸，離心；
[0016](5)離心后棄上清液，用1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5X105?1X 105cells/mL,得到人外周血單個核細(xì)胞。
[0017]優(yōu)選，所述羥乙基淀粉溶液的濃度為6% g/mL。
[0018]步驟(4)所述重懸是加入生理鹽水。
[0019]步驟(4)和(5)所述離心的轉(zhuǎn)速為1000?2000rpm/min，離心5?1min0
[0020]步驟(I)所述離心的轉(zhuǎn)速為1500?3000rpm，離心時間為8?12min。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點及有益效果:
[0022](I)本發(fā)明技術(shù)結(jié)合了羥乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度離心法兩種方法的優(yōu)點，克服了目前技術(shù)在大容量血液樣本中的缺點，得到高純度的PBMC ；
[0023](2)分離得到的PBMC細(xì)胞的分化能力好，體外擴(kuò)增倍數(shù)高，能更快的達(dá)到臨床應(yīng)用所需的細(xì)胞數(shù)量。
[0024](3)先用羥乙基淀粉沉淀法去除大部分的紅細(xì)胞，然后在空氣中自然沉降，再用Ficoll密度梯度離心法對單個核細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步純化，從而得到純度超過95%，活力超過85%的PBMC。相比沒有在空氣中自然沉降的方法，獲得的細(xì)胞活力和純度更高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為PBMC的分離純度對比；
[0026]圖2為PBMC的分離活力對比；
[0027]圖3為NK細(xì)胞的生長曲線；
[0028]圖4為NK細(xì)胞的流式鑒定結(jié)果；
[0029]圖5為NKT細(xì)胞的生長曲線；
[0030]圖6為NKT細(xì)胞的流式鑒定結(jié)果；
[0031]圖7為CIK細(xì)胞的生長曲線；
[0032]圖8為CIK細(xì)胞的流式鑒定。

【具體實施方式】
[0033]實施例1
[0034]1、用75%乙醇擦試生物安全柜工作臺面消毒，將裝有外周血的抗凝管放入超凈臺中。
[0035]2、將抗凝管中的外周血轉(zhuǎn)移到離心管中，2000rpm離心lOmin，離心結(jié)束后共分為兩層，上層為血漿，下層為血細(xì)胞沉淀。將上層血漿收集于另一支離心管中，標(biāo)記后置于4°C冰箱，備用。
[0036]3、將下層血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加入等體積的6% g/mL羥乙基淀粉溶液，混合均勻后使其自然沉降20min。
[0037]4、另取一支新的50mL離心管，每管加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(品牌:Axis-shield ;供貨商:深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；貨號:AS1114546)，將自然沉降后的上清液緩慢轉(zhuǎn)移至淋巴細(xì)胞分離液的表面，使二者之間形成清晰的界面。
[0038]5、用封口膜將離心管封口后轉(zhuǎn)移至離心機(jī)，700g離心30min，離心升降速率改為O ；
[0039]6、離心后從管底到液面分為4層，依次為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層、淋巴細(xì)胞分離液層、白膜層(即PBMC層)、血漿層。用巴氏吸管將中間的白膜層PBMC直接吸取出來，轉(zhuǎn)移至另一支50mL離心管中。
[0040]7、加生理鹽水至 40mL，重懸 PBMC，1500rpm/min 離心 5min。
[0041]8、離心結(jié)束后棄上清，加入40mL生理鹽水充分重懸細(xì)胞后，取20 μ L細(xì)胞懸液于EP管中，用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及活力檢測，其余細(xì)胞懸液1500rpm/min離心5min。
[0042]9、離心結(jié)束后棄上清，用1640培養(yǎng)基(含10% FBS)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5X 15ceIlsAiL后置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)。定期進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并繪制細(xì)胞生長曲線。生長曲線圖見實例中NK，NKT, CIK誘導(dǎo)分化結(jié)果。
[0043]實施例2
[0044]1、用75%乙醇擦試生物安全柜工作臺面消毒，將裝有外周血的抗凝管放入超凈臺中。
[0045]2、將抗凝管中的外周血轉(zhuǎn)移到離心管中，1500rpm離心8min，離心結(jié)束后共分為兩層，上層為血漿，下層為血細(xì)胞沉淀。將上層血漿收集于另一支離心管中，標(biāo)記后置于4°C冰箱，備用。
[0046]3、將下層血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加入等體積的4% g/mL羥乙基淀粉溶液，混合均勾后使其自然沉降15min。
[0047]4、另取一支新的50mL離心管，每管加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(品牌:Axis-shield ;供貨商:深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；貨號:AS1114546)，將自然沉降后的上清液緩慢轉(zhuǎn)移至淋巴細(xì)胞分離液的表面，使二者之間形成清晰的界面。
[0048]5、用封口膜將離心管封口后轉(zhuǎn)移至離心機(jī)，600g離心20min，離心升降速率改為O ；
[0049]6、離心后從管底到液面分為4層，依次為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層、淋巴細(xì)胞分離液層、白膜層(即PBMC層)、血漿層。用巴氏吸管將中間的白膜層PBMC直接吸取出來，轉(zhuǎn)移至另一支50mL離心管中。
[0050]7、加生理鹽水至 40mL，重懸 PBMC，1000rpm/min 離心 5min。
[0051]8、離心結(jié)束后棄上清，加入40mL生理鹽水充分重懸細(xì)胞后，取20 μ L細(xì)胞懸液于EP管中，用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及活力檢測，其余細(xì)胞懸液1000rpm/min離心5min。
[0052]9、離心結(jié)束后棄上清，用1640培養(yǎng)基(含10% FBS)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1X 15后置于37°C、5% CO 2培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0053]實施例3
[0054]1、用75%乙醇擦試生物安全柜工作臺面消毒，將裝有外周血的抗凝管放入超凈臺中。
[0055]2、將抗凝管中的外周血轉(zhuǎn)移到離心管中，3000rpm離心12min，離心結(jié)束后共分為兩層，上層為血漿，下層為血細(xì)胞沉淀。將上層血漿收集于另一支離心管中，標(biāo)記后置于4°C冰箱，備用。
[0056]3、將下層血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加入等體積的10% g/mL羥乙基淀粉溶液，混合均勾后使其自然沉降35min。
[0057]4、另取一支新的50mL離心管，每管加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(品牌:Axis-shield ;供貨商:深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；貨號:AS1114546)，將自然沉降后的上清液緩慢轉(zhuǎn)移至淋巴細(xì)胞分離液的表面，使二者之間形成清晰的界面。
[0058]5、用封口膜將離心管封口后轉(zhuǎn)移至離心機(jī)，800g離心30min，離心升降速率改為O ；
[0059]6、離心后從管底到液面分為4層，依次為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層、淋巴細(xì)胞分離液層、白膜層(即PBMC層)、血漿層。用巴氏吸管將中間的白膜層PBMC直接吸取出來，轉(zhuǎn)移至另一支50mL離心管中。
[0060]7、加生理鹽水至 40mL，重懸 PBMC，2000rpm/min 離心 1min。
[0061]8、離心結(jié)束后棄上清，加入40mL生理鹽水充分重懸細(xì)胞后，取20 μ L細(xì)胞懸液于EP管中，用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及活力檢測，其余細(xì)胞懸液2000rpm/min離心lOmin。
[0062]9、離心結(jié)束后棄上清，用1640培養(yǎng)基(含10% FBS)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為8X 15后置于37°C、5% CO 2培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0063]分離大容量血液樣本PBMC的純度對比試驗:
[0064]根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的Ficoll密度梯度離心法跟本發(fā)明技術(shù)的方法進(jìn)行PBMC分離后的純度對比實驗。如圖1所示，采用單一的羥乙基淀粉沉淀法得到的PBMC存在大量的紅細(xì)胞，純度僅為43% ;采用單一的Ficoll密度梯度離心法有少量的紅細(xì)胞及血小板，純度為87% ;而采用本發(fā)明方法得到的PBMC的純度高達(dá)96%。結(jié)果顯示，采用本發(fā)明實施例1方法，即結(jié)合羥乙基淀粉沉淀法跟Ficoll密度梯度離心法兩種方法分離所得到的PBMC，在純度上明顯優(yōu)于其他兩種單一的處理方法。
[0065]對比例2:PBMC的活力鑒定
[0066]將采用三種方法分離所得到的PBMC進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，并用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞的計數(shù)及活力鑒定。鑒定結(jié)果如圖2所示，I為羥乙基淀粉沉淀法；2為Ficoll密度梯度離心法；3為本發(fā)明實施例1的方法，本發(fā)明技術(shù)分離的PBMC的活力為95%。而采用羥乙基淀粉沉淀法PBMC活力為85%，F(xiàn)icoll密度梯度離心法則為83%?？梢姡景l(fā)明得到的PBMC活力均高于其他兩種方法。
[0067]對比例3:PBMC的NK分化擴(kuò)增試驗
[0068]利用本發(fā)明實施例1分離得到了純度及活力都較高的PBMC后，利用NK細(xì)胞分選試劑盒將其進(jìn)行NK細(xì)胞的分選及誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)兩周后繪制NK細(xì)胞的生長曲線，并取一部分細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(主要檢測CD3_CD56+亞群，即NK細(xì)胞)。其生長曲線及流式檢測結(jié)果分別見下圖3和圖4。
[0069]由圖3可見，利用本技術(shù)分離得到的PBMC進(jìn)一步分選NK細(xì)胞，細(xì)胞的增殖能力很強(qiáng)，在第6天之后進(jìn)入對數(shù)生長期，第13天增殖速度開始變慢，到第15天收集細(xì)胞時，細(xì)胞增殖倍數(shù)高達(dá)825倍。
[0070]由圖4可見，⑶3TD56+亞群細(xì)胞，即右圖第四象限中的細(xì)胞，流式檢測結(jié)果顯示NK細(xì)胞的比例為95.4 %，細(xì)胞純度較高。
[0071 ] 對比例4:PBMC的NKT分化擴(kuò)增試驗
[0072]利用本發(fā)明實施例2分離得到了純度及活力都較高的PBMC后，將其進(jìn)行NKT細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)兩周后繪制MT細(xì)胞的生長曲線，并取一部分細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(主要檢測CD3+CD56+及CD161 +兩個亞群的細(xì)胞，即NKT細(xì)胞)。其生長曲線及流式檢測結(jié)果分別見下圖5和圖6。
[0073]由圖5可見，利用本技術(shù)分離得到的PBMC進(jìn)一步誘導(dǎo)培養(yǎng)NKT細(xì)胞，細(xì)胞的增殖能力較好，在第5天之后細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯增殖，第14天增殖速度開始變慢，收集細(xì)胞時，細(xì)胞增殖倍數(shù)高達(dá)200倍以上。
[0074]由圖6可見，⑶3+⑶56+及⑶161 +兩個亞群的細(xì)胞，即NKT細(xì)胞，流式檢測結(jié)果顯示NKT細(xì)胞兩個亞群的比例合計為61.9%，細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)效果很好。
[0075]對比例5:PBMC的CIK分化擴(kuò)增試驗
[0076]利用本發(fā)明實施例3方法分離得到了純度及活力都較高的PBMC后，將其進(jìn)行CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)兩周后繪制CIK細(xì)胞的生長曲線，并取一部分細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(主要檢測CD3+CD56+效應(yīng)細(xì)胞，即CIK細(xì)胞)。其生長曲線及流式檢測結(jié)果分別見下圖7和圖8。
[0077]由圖7可見，利用本技術(shù)分離得到的PBMC進(jìn)一步誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，細(xì)胞的增殖能力較好，在第5天之后細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯增殖，第12天增殖速度開始變慢，第14天收集細(xì)胞時，細(xì)胞增殖倍數(shù)高達(dá)200倍以上。
[0078]由圖8可見，⑶3+CD56+亞群的細(xì)胞，即CIK細(xì)胞，流式檢測結(jié)果顯示CIK細(xì)胞比例為24.9%，細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)效果較好。
【權(quán)利要求】
1.一種人外周血單個核細(xì)胞的分離方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將外周血離心后，上層為血漿，下層為血細(xì)胞沉淀； (2)在下層血細(xì)胞沉淀中加入等體積的羥乙基淀粉溶液，羥乙基淀粉溶液的濃度為4% -10% ^/^1,混合均勾后在空氣中自然沉降15?35111111 ； (3)將上清液緩慢轉(zhuǎn)移至？化011淋巴細(xì)胞分離液表面，離心力為6008?8008，離心20 ?30111111 ； (4)離心后從下到上分為4層，依次為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層、淋巴細(xì)胞分離液層、白膜層和血楽層；吸取白膜層，重懸，離心； (5)離心后棄上清液，用1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為〖X105?10X 10^06118/1111,得到人外周血單個核細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述羥乙基淀粉溶液的濃度為6%⑴匕
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，步驟(4)所述重懸是加入生理鹽水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，步驟⑷和(5)所述離心的轉(zhuǎn)速為1000 ?200011)111/111111，離心 5 ?101111110
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，步驟(1)所述離心的轉(zhuǎn)速為1500?300011)111，離心時間為 8 ?12111111。
【文檔編號】C12N5/078GK104480070SQ201410718871
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 陳潔鴻, 王小燕, 羅二梅 申請人:廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司