一種普通小麥低分子量谷蛋白Glu-A3a基因的分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種普通小麥低分子量谷蛋白Glu-A3a基因的分子標(biāo)記及應(yīng)用。所述分子標(biāo)記由SEQ ID No.1所示和SEQ ID No.2所示的DNA分子組成。實(shí)驗(yàn)證明：通過(guò)該分子標(biāo)記能快速篩選出具有Glu-A3a基因的小麥品種，相應(yīng)的面粉品質(zhì)也會(huì)提高，從而加速含有優(yōu)質(zhì)基因的小麥新品種的育成步伐。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種普通小麥低分子量谷蛋白Gl u-A3a基因的分子標(biāo)記及 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種普通小麥低分子量谷蛋白Glu-A3a基因 的分子標(biāo)記及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)鞘澜缟先笾匾Z食作物之一，是全世界約20%人口的主食。小麥面粉中 含有其它作物所沒(méi)有的蛋白質(zhì)面筋成分，讓小麥面團(tuán)具有粘彈性和延展性，適合制作成面 包、饅頭、面條、餅干、糕點(diǎn)等多種食品。小麥也是人們?nèi)粘ｏ嬍持兄匾牡鞍踪|(zhì)來(lái)源之一， 小麥面粉中約含10% -15%的蛋白質(zhì)。小麥種子蛋白按其功能的不同分為兩大類(lèi)：一類(lèi)為 代謝蛋白，另一類(lèi)為貯藏蛋白。代謝蛋白分為水溶性的清蛋白（albumins)和鹽溶性的球蛋 白（globulins)兩種，主要與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)有關(guān)；IC藏蛋白也分為醇溶蛋白（gliadins)和谷蛋 白（glutenins)兩種，主要影響小麥的加工品質(zhì)。谷蛋白和醇溶蛋白約占種子蛋白的85% 左右。
[0003] 麥谷蛋白包括高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基（LMW-GS)兩 種，分別占胚乳總蛋白含量的10%和40%左右。LMW-GS基因不含有內(nèi)含子，且基因較小。 一個(gè)LMW-GS基因的長(zhǎng)度在900-1200bp之間，多數(shù)LMW-GS基因含有250-300個(gè)氨基酸殘基。 其中谷氨酰胺和脯氨酸占氨基酸總數(shù)的50%左右，大約分別為30%和15%。此外LMW-GS 基因拷貝數(shù)較多，大概有10-15個(gè)到35-40個(gè)。這些LMW-GS基因大部分位于第1部分同源 染色體短臂上的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點(diǎn)上，這些位點(diǎn)與編碼醇溶蛋白的Gli-I位點(diǎn) 緊密連鎖。Glu-3位點(diǎn)存在大量的等位變異，最近的研宄顯示，在小偃54小麥品種中，鑒定 到了 14個(gè)唯一的低分子量谷蛋白亞基。有4個(gè)在Glu-A3位點(diǎn)，3個(gè)在Glu-B3位點(diǎn)，7個(gè)在 Glu-D3 位點(diǎn)。
[0004] 低分子量谷蛋白約占種子貯藏總蛋白的三分之一左右，占麥谷蛋白的60%左右， 是組成麥谷蛋白大聚體的重要成分，因而有理由認(rèn)為，低分子量谷蛋白的數(shù)量和組成對(duì)小 麥品質(zhì)具有顯著影響。在對(duì)澳大利亞小麥品種的鑒定中，得知LMW-GS對(duì)Rmax的作用大于 HMW-GS。根據(jù)最近的研宄，Glu-3位點(diǎn)對(duì)Rmax的貢獻(xiàn)率排序如下：Glu-A3b>Glu-A3d>Glu-A 3e>Glu-A3c，Glu-B3i>Glu-B3b = Glu-B3a>Glu-B3e = Glu-B3f = Glu-B3g = Glu-B3h>Glu -B3c, Glu-D3e>Glu-D3b>Glu-D3a>Glu-D3c>Glu-D3d。研宄表明，對(duì)于不同 Glu-3 亞基，組合 為Glu-A3b、Glu-B3b和Glu-D3b的品種具有最好的延伸性，亞基組合為Glu-A3b、Glu-B3b 和Glu-D3c的品種的延伸性也較好，亞基組合為Glu-A3b、Glu-B3b和Glu-D3b，Glu-A3b、 Glu-B3b和Glu-D3c以及Glu-A3c、Glu-B3b和Glu-D3c的品種，其面包品質(zhì)最好。一些研 宄認(rèn)為有些LMW-GS對(duì)某些小麥加工品質(zhì)參數(shù)的影響效應(yīng)比HMW-GS大。由此可見(jiàn)，LMW-GS 與小麥品質(zhì)之間具有密切的關(guān)系，不同亞基的影響也不盡相同。
[0005] HMW-GS主要決定小麥面粉的粘彈性，而LMW-GS則主要決定小麥的面筋強(qiáng)度。對(duì) 于HMW-GS來(lái)說(shuō)，由于其基因拷貝數(shù)較少，易于用SDS-PAGE區(qū)分，等位基因變異及其與小麥 品質(zhì)的關(guān)系已得到了廣泛深入的研宄，針對(duì)其重要亞基的功能標(biāo)記也已經(jīng)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。然 而，因?yàn)長(zhǎng)MW-GS數(shù)目較多、分子量小且在電泳圖譜上與大量的醇溶蛋白相互重疊，因此對(duì) LMW-GS及其編碼基因與品質(zhì)參數(shù)之間關(guān)系的研宄相對(duì)較少。隨著研宄分析方法的不斷改 進(jìn)，大量的LMW-GS亞基和基因得到鑒定和克隆，其對(duì)加工品質(zhì)的重要性以及研宄的必要性 逐步得到認(rèn)識(shí)，有關(guān)LMW-GS對(duì)品質(zhì)的研宄越來(lái)越受到重視。現(xiàn)代社會(huì)，隨著人民生活水平 的提高，對(duì)小麥品質(zhì)的要求越來(lái)越高，培育出優(yōu)質(zhì)的小麥新品種對(duì)于育種工作者也是迫在 眉睫。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于鑒定小麥品種是否含有Glu-A3a基因的引物 對(duì)。
[0007] 本發(fā)明提供的引物對(duì)由SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子組成。
[0008] 上述引物對(duì)中，所述編碼Glu-A3a基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所 不O
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述所述的引物對(duì)在鑒定或輔助鑒定小麥品種是否 含有Glu-A3a基因中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定小麥品種是否含有Glu-A3a基 因的試劑盒。
[0011] 本發(fā)明提供的試劑盒包含上述所述的引物對(duì)。
[0012] 上述所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定小麥品種是否含有Glu-A3a基因中的應(yīng)用 也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定小麥品種是否含有Glu-A3a 基因的方法，包括如下步驟：
[0014] (1)提取待測(cè)小麥品種的基因組DNA ;
[0015] (2)以所述基因組DNA為模板，采用上述所述的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物；若擴(kuò)增產(chǎn)物大小為507bp，則待檢測(cè)的小麥品種含有或候選含有Glu-A3a基因。
[0016] 上述方法中，以所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的退火溫度為58°C。
[0017] 本發(fā)明通過(guò)在普通小麥中國(guó)春中克隆得到低分子量谷蛋白亞基Glu_A3a的基因 序列，并根據(jù)Glu-A3a基因單核苷酸突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物Glu-A3F/Glu-A3R，提供 了鑒定小麥Glu-A3a基因等位變異的分子標(biāo)記，用于該基因的篩選，對(duì)利用分子標(biāo)記輔助 選擇高產(chǎn)小麥品種具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為在48個(gè)含有不同的低分子量谷蛋白亞基的品種中分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果。
[0019] 圖2為在含有不同的Glu-A3位點(diǎn)的Aroona近等基因系以及CS-IS1(IB)代換系 和CS+1S 11S1附加系中分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果。
[0020] 圖3為分子標(biāo)記在重組自交系和Aroona近等基因系中的檢測(cè)結(jié)果。其中，圖3a 為重組自交系的SDS-PAGE圖；圖3b為分子標(biāo)記在重組自交系（1-15)和Aroona近等基因 系（17-23)中的擴(kuò)增結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0022] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0023] 實(shí)驗(yàn)材料 CS，CS-n 和 CB037A 在文獻(xiàn)"Zitong Yu，Caixia Han，Xing Yan,Xiaohui Li,Guoliang Jiang,and Yueming Yan*,Rapid Characterization of Wheat Low Molecular Weight Glutenin Subunits by Ultraperformance Liquid Chromatography (UPLC) , Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61，4026-4034. "中公開(kāi)過(guò)，公眾可從首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獲得。
[0024] 實(shí)驗(yàn)材料 CS-ISl(IB)代換系在文獻(xiàn) "Wang Shunli, Yu Zitong, Cao Min,Shen Xxi, Li Ning, Li Xiaohui, Ma Wujun, Wei β gerber H,Zeller F, Hsam S, Yan Yueming, Molecular mechanisms of HMff glutenin subunits from ISl genome of Aegilops longissima positively affecting wheat breadmaking quality. PloS 0ne2013, 8(4) :e58947. "中公開(kāi)過(guò)，公眾可從首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獲得。
[0025] 實(shí)施例里表2中編號(hào)為4-57的材料在"Wang L，Li G，Pefia RJ，Xia X，He Z, Development of STS markers and establishment of multiplex PCR for Glu_A3 alleles in common wheat(Triticum aestivum L.). J Cereal Sci2010,51 (3):305-312. " 中公開(kāi)過(guò)，公眾可從首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獲得。
[0026] 實(shí)施例1、鑒定普通小麥品種中是否含有Glu_A3a基因的方法
[0027] UDNA 提取
[0028] 用CTAB法提取小麥葉片的DNA，提取所得DNA拿CldH2O溶解，DNA經(jīng)1 %瓊脂糖凝 膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，提取的DNA要求無(wú)明顯雜質(zhì)、條帶清晰、無(wú)降解。
[0029] 2、PCR 擴(kuò)增
[0030] 以上述步驟1獲得的小麥基因組DNA為模板，采用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0031] 表1、用于鑒定普通小麥Glu_A3a基因等位變異的引物序列
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于鑒定小麥品種是否含有Glu-A3a基因的引物對(duì)； 所述引物對(duì)由SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，其特征在于，所述編碼Glu-A3a基因的核苷酸序列如 序列表中SEQ ID No. 3所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)在鑒定或輔助鑒定小麥品種是否含有Glu-A3a基因中 的應(yīng)用。
4. 一種鑒定或輔助鑒定小麥品種是否含有Glu-A3a基因的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利 要求1所述的引物對(duì)。
5. 權(quán)利要求4所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定小麥品種是否含有Glu-A3a基因中的應(yīng) 用。
6. -種鑒定或輔助鑒定小麥品種是否含有Glu-A3a基因的方法，包括如下步驟： (1) 提取待測(cè)小麥品種的基因組DNA; (2) 以所述基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；若擴(kuò)增產(chǎn)物大小為507bp，則待檢測(cè)的小麥品種含有或候選含有Glu-A3a基因。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，以所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的退火溫度為 58。。。
8. 權(quán)利要求1所述引物對(duì)或權(quán)利要求6所述方法在鑒定含有低分子量谷蛋白亞基的小 麥中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，含有Glu-A3a基因的小麥為含有低分子量 谷蛋白亞基的小麥。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104480198SQ201410670432
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】晏月明, 甄守民, 馬超穎, 李小輝 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)