專利名稱：一種基于基因組rapd分析的紫山藥品種分子鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于基因組RAPD (隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記，random amplifiedpolymorphic DNA)分析的紫山藥品種分子鑒定方法,屬于植物品種分子鑒定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紫山藥薯蕷科薯蕷屬植物，作為菜用的植物在我國主要為山藥和大薯，大薯原產(chǎn)于亞洲熱帶地區(qū)，我國也是其原產(chǎn)地之一。最早記載有薯蕷的我國最早的一部藥物學(xué)著作“神農(nóng)本草經(jīng)”中對山藥就有記載，被列為上品，可藥食兼用的材料。在此部書中，并未區(qū)分山藥和大薯，將它們統(tǒng)稱為薯蕷。后來因經(jīng)歷唐和宋兩朝避諱帝王的諱而改成山藥。到明李時(shí)珍的“本草綱目”中仍然沒有明確的將兩種植物分開，仍然統(tǒng)稱山藥。目前，世界上大薯的種植地主要在西非、東南亞等地。是西非等國的主要糧菜兼用的植物。在我國南方多省，沒有大規(guī)模的種植基地，因其外形差，市場銷量低，以一家一戶，自產(chǎn)自銷為主。大薯中有白肉和紫肉品種，紫肉品種是近幾年因花青素的功效為大家所熟知而逐漸增加。紫山藥(紫肉大薯)作為一種新興的蔬菜資源，對其研究還很有限。先期進(jìn)行的一些研究表明，紫山藥同懷山藥在營養(yǎng)成分及部分功能成分上接近甚至高于懷山藥。表明紫山藥有潛在的開發(fā)價(jià)值，既可作為蔬菜來食用，又可以像懷山藥作為一種溫和的藥材。紫山藥品種大都是地方品種，雖然南方部分地區(qū)少量種植，但栽培歷史悠久。種植地區(qū)大都丘陵山坡地帶，種植土壤土層深厚，質(zhì)地疏松，有機(jī)質(zhì)含量高，保水、保肥能力強(qiáng)，pH值為4.5-6.5，呈微酸性。紫山藥因其肉質(zhì)紅中帶紫而得名。紫山藥塊莖肥大，單個(gè)塊莖重500克左右，最大達(dá)到2500多克，肉質(zhì)柔滑，風(fēng)味獨(dú)特，色澤亮麗鮮美，營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)、色澤、味道、黏度、氣味、口感、營養(yǎng)成份分析等商品化指標(biāo)在全省、全國的山藥中首屈一指。紫山藥的藥用價(jià)值很高，既可作餐桌上的佳肴，又可作保健藥材，據(jù)《本草綱目》記載，經(jīng)常食用紫山藥，可以降低血壓、血糖、抗衰益壽、健腦補(bǔ)智、增強(qiáng)人體免疫力和改善性功能，是益于脾、肺、腎功能的珍貴藥食兼用資源。隨著人們對紫山藥的日益關(guān)注，同時(shí)也激起了農(nóng)民對紫山藥的種植熱情，南方種植紫山藥的品種也有多種，都統(tǒng)稱為紫山藥，從形態(tài)上很難準(zhǔn)確鑒別，因此快速準(zhǔn)確地鑒別紫山藥品種是急需解決的問題。研究表明紫山藥品種之間在分子水平上存在著顯著差異，從DNA水平上直接檢測其差異，并用于無性系品種的鑒別最為可靠。因此，對紫山藥進(jìn)行遺傳分析具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于基因組RAPD分析的紫山藥常規(guī)品種分子鑒定方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù) 方案:一種基于基因組RAro分析的紫山藥品種分子鑒定的方法，包括以下步驟:
I)取樣及樣品處理；采用正常生長的紫山藥品種，每個(gè)品種10株，每株10片新鮮幼葉放入冰盒，置于_40°C超低溫冰箱中儲(chǔ)存24h后冷凍干燥成粉末狀，將其充分混勻；2 ) DNA提取及其純度和濃度監(jiān)測:以幼葉干粉為材料，取0.2g,采用2 X CTAB提取總DNA，使用0.8w%瓊脂糖對所獲基因組DNA的純度進(jìn)行檢測，利用蛋白核酸定量測定儀檢測DNA濃度；3 )引物篩選和RAPD分析:在對紫山藥進(jìn)行RAPD分析的PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化后，選取8個(gè)以上在形態(tài)上差異比較大的紫山藥品種進(jìn)行RAro引物篩選，篩選出I個(gè)擴(kuò)增帶清晰、多態(tài)性明顯、重復(fù)性好的引物 S1255，其核苷酸序列·為 TGACGCACGG，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，在 Gene Amp PCR System 9700PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行DNA擴(kuò)增；4)擴(kuò)增產(chǎn)物用含lv%Golden view的1.6w%瓊脂糖凝膠電泳分離2_3h,電壓為6V/cm;在UV光下檢測擴(kuò)增結(jié)果并通過凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+)照相，得到8個(gè)以上紫山藥品種的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA標(biāo)準(zhǔn)圖譜(S1255引物擴(kuò)增出的特有DNA指紋)；5)將待鑒定的紫山藥品種按照上述步驟進(jìn)行分析，得到待鑒定紫山藥品種的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA圖譜，將此隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比較判定，判斷其是否為某種紫山藥品種。上述方法中，所述DNA提取的方法為:(I)取6ml預(yù)熱到60°C的2XCTAB溶液于裝有葉片粉末的離心管中，60°C水浴30分鐘，間或輕搖幾次，使粉末和溶液混勻；(2)取出離心管，待冷卻后加入6ml氯仿-異戊醇(體積比24:1)，置于搖床上30分鐘充分混勻；(3) 12000rpm 離心 10 分鐘；(4)將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入2倍體積預(yù)冷(_20°C)無水乙醇，混勻，在-20°C冰箱中放30分鐘，使核酸沉淀成絮狀；(5)室溫下12000rpm離心10分鐘；(6)棄上清，DNA沉淀風(fēng)干后，溶解于800iil去離子水中，作為PCR模板DNA，_20°C
保存?zhèn)溆谩? X CTAB的配制方法:Tris-HCl (pH8.0) 100mmol/L，EDTA-Na2 (EDTA 二鈉)(pH8.0) 20mmol/L，NaCl
1.4mol/L, CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)2w% (20g/L) ；DNA提取前加入0.2v% P -巰基乙醇。使用0.8w%瓊脂糖對所獲基因組DNA的純度進(jìn)行檢測，利用蛋白核酸定量測定儀檢測DNA濃度。測得DNA濃度大于10mg/ml，0D260/280的比值在1.8-2.0之間，0D260/230的比值在2.0-2.5之間。步驟3 )中，對紫山藥進(jìn)行RAPD分析的PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化是指對DNA模板量進(jìn)行優(yōu)化；如對DNA模板量從5ng, IOng, 20ng, 40ng, 60ng, 80ng, IOOng進(jìn)行優(yōu)化,最終選擇20ng。所述的PCR擴(kuò)增的方法為:采用20 ii L反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為20 ii L，含 IOii L2 X EasyTag PCR SuperMix (+dye)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)+2 ii L1OmM 引物 +20ng DNA。所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min 30s ;接著94°C變性Imin 30s，40°C復(fù)性lmin，72°C延伸2min，40個(gè)循環(huán)；最后72°C后延伸lOmin。本發(fā)明基于基因組RAPD分析的8種以上紫山藥常規(guī)品種分子鑒定方法，通過I)取樣及樣品處理；2) DNA提取及其純度和濃度檢測；3)引物篩選和RAPD分析；4)使用引物S1255 (上海生工生物工程有限公司)得到8種紫山藥常規(guī)品系的標(biāo)準(zhǔn)圖譜；5)將待鑒定的紫山藥新品種按照上述步驟進(jìn)行分析，得到所需要鑒定紫山藥新品種的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA圖譜，將此隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較鑒定，可以判斷不同的紫山藥品種，具有快速、穩(wěn)定、費(fèi)用低的特點(diǎn)。本發(fā)明對紫山藥栽培品種，特別是新選育紫山藥品種進(jìn)行DNA指紋分析，建立品種DNA指紋圖譜，尋找特異DNA片段序列，以探索利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行品種快速鑒定的方法，為紫山藥栽培品種的快速準(zhǔn)確鑒定及紫山藥雜交優(yōu)良親本的預(yù)選提供理論依據(jù)。


圖1是8個(gè)紫山藥品種采用引物S1255 (TGACGCACGG)擴(kuò)增的RAPD標(biāo)準(zhǔn)圖譜。圖2是8個(gè)紫山藥品種及待鑒定紫山藥采用引物S1255(TGACGCACGG)擴(kuò)增的RAPD圖譜。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。一、材料與方法1、材料供試材料共8個(gè)，2010年分別引種于浙江、江西、福建、廣東、云南、臺(tái)灣等地，請參見表I。隨機(jī)引物購自上海生工生物工程公司，2XEasyTaq PCR SuperMix和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans5K DNA Marker購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。表1紫山藥品種及其來源
權(quán)利要求
1.一種基于基因組RAro分析的紫山藥品種分子鑒定的方法，包括以下步驟: 1)取樣及樣品處理； 采用正常生長的紫山藥品種，每個(gè)品種10株，每株10片新鮮幼葉放入冰盒，置于-40°c超低溫冰箱中儲(chǔ)存24h后冷凍干燥成粉末狀，將其充分混勻； 2)DNA提取及其純度和濃度監(jiān)測: 以幼葉干粉為材料，取0.2g,采用2 X CTAB提取總DNA，使用0.8w%瓊脂糖對所獲基因組DNA的純度進(jìn)行檢測，利用蛋白核酸定量測定儀檢測DNA濃度； 3)引物篩選和RAPD分析: 在對紫山藥進(jìn)行RAPD分析的PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化后，選取8個(gè)以上在形態(tài)上差異比較大的紫山藥品種進(jìn)行RAPD引物篩選，篩選出引物S1255，其核苷酸序列為TGACGCACGG，在GeneAmp PCR System9700PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行DNA擴(kuò)增； 4)擴(kuò)增產(chǎn)物用含lv%Goldenview的1.6w%瓊脂糖凝膠電泳分離2_3h,電壓為6V/cm ；在UV光下檢測擴(kuò)增結(jié)果并通過凝膠成像系統(tǒng)照相，得到8種以上紫山藥的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA標(biāo)準(zhǔn)圖譜； 5)將待鑒定的紫山藥品種按照上述步驟進(jìn)行分析，得到待鑒定紫山藥品種的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA圖譜，將此隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比較判定，判斷其是否為某種紫山藥品種。
2.權(quán)利要求1所述的基于基因組RAH)分析的紫山藥品種分子鑒定的方法，其特征在于:所述DNA提取的方法包括: (1)取6ml預(yù)熱到60°C的2X CTAB溶液于裝有葉片粉末的離心管中，60°C水浴30分鐘，間或輕搖幾次，使粉末和溶液混勻； (2)取出離心管，待冷卻后加入6ml氯仿-異戊醇，體積比24:1，置于搖床上30分鐘充分混勻；(3)12000rpm 離心 10 分鐘； (4)將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇，混勻，在_20°C冰箱中放30分鐘，使核酸沉淀成絮狀； (5)室溫下12000rpm離心10分鐘； (6)棄上清，DNA沉淀風(fēng)干后，溶解于SOOiU去離子水中，作為PCR模板DNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.權(quán)利要求1所述的基于基因組RAH)分析的紫山藥品種分子鑒定的方法，其特征在于:所述的DNA濃度大于10mg/ml，0D260/280的比值在1.8-2.0之間，0D260/230的比值在2.0-2.5 之間。
4.權(quán)利要求1所述的基于基因組RAH)分析的紫山藥品種分子鑒定的方法，其特征在于:對紫山藥進(jìn)行RAPD分析的PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化是指對DNA模板量進(jìn)行優(yōu)化。
5.權(quán)利要求4所述的基于基因組RAPD分析的紫山藥品種分子鑒定的方法，其特征在于:所述的DNA模板量為20ng。
6.權(quán)利要求1所述的基于基因組RAH)分析的紫山藥品種分子鑒定的方法，其特征在于:所述的PCR擴(kuò)增的方法為采用20 U L反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為20 u L，含 10 u L2 X EasyTag PCR SuperMix (+dye) +2 u L 5mM 引物+20ngDNA。
7.權(quán)利要求6所述的基于基因組RAPD分析的紫山藥品種分子鑒定的方法，其特征在于:所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min 30s ;接著94°C變性Imin 30s，40°C復(fù)性lmin，72°C延伸 2min,40個(gè)循環(huán)；最后72°C后延伸IOmin0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于基因組RAPD分析的紫山藥品種分子鑒定的方法，包括以下步驟1)取樣及樣品處理；2)DNA提取及其純度和濃度檢測；3)引物篩選和RAPD分析；4)使用引物S1255得到8種紫山藥常規(guī)品系的標(biāo)準(zhǔn)圖譜；5)將待鑒定的紫山藥新品種按照上述步驟進(jìn)行分析，得到所需要鑒定紫山藥新品種的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA圖譜，將此隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較鑒定，可以判斷不同的紫山藥品種，具有快速、穩(wěn)定、費(fèi)用低的特點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK103194541SQ20131013900
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者劉龐源, 宋曙輝, 趙泓, 王慧杰, 何偉明, 王文琪 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院