F52-2蛋白及其編碼基因及水解木聚糖的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了F52-2蛋白及其編碼基因及水解木聚糖的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)：1)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)新的β-木糖苷酶F52-2，在以對硝基苯酚木糖苷(pNPX)為底物，pH 5.0條件下，最適溫度為60℃，在50℃溫育2小時后，仍能保留85％的活力；在4℃下，不同pH緩沖液中孵育24小時后，在pH 3.5-5.5范圍內(nèi)均能保留超過60％的剩余活力。
【專利說明】F52-2蛋白及其編碼基因及水解木聚糖的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及F52-2蛋白及其編碼基因及水解木聚糖的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖（Xylan)是植物細胞壁中半纖維素的重要組分，約占細胞干重的35%，是 自然界中豐富的可再生資源，僅次于纖維素。木聚糖酶（Xylananse)是一類能將木聚糖水 解為低聚木糖及木糖的酶，很多自然界微生物均含有木聚糖酶。由于木聚糖酶可以廣泛應(yīng) 用于紡織、造紙、食品及生物燃料等工業(yè)，近年來吸引了越來越多學(xué)者的研宄興趣。然而，在 木聚糖酶水解的過程中，產(chǎn)生的大量木二糖及寡糖會強烈抑制木聚糖酶的活性，導(dǎo)致木聚 糖水解效率的急劇下降，整個生產(chǎn)效率的降低。0 -木糖苷酶可以高效催化木二糖及木寡糖 轉(zhuǎn)化為木糖，因此將該酶加至木聚糖酶中，會解除產(chǎn)物抑制，使木聚糖酶恢復(fù)高效力，從而 保證整個水解過程連續(xù)而穩(wěn)定。
[0003] 工業(yè)中，木聚糖的水解溫度一般為50°C，很少有酶在該溫度下保持比較長時間的 催化效力及穩(wěn)定性。這就限制了生物燃料工業(yè)的高效發(fā)展，也是制約生物燃料降低生產(chǎn)成 本的重要因素。為了使酶達到較高的耐熱性及熱穩(wěn)定性，很多學(xué)者從嗜熱微生物中篩選新 酶，但是它們很少可以適用在工業(yè)條件中。自然界中，不可培養(yǎng)微生物約占所有微生物的 99%。大部分篩選木糖苷酶的研宄仍然禁錮在可培養(yǎng)的1%的微生物中。近10年來， 隨著測序技術(shù)與高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸開始研宄不可培養(yǎng)微生物中蘊含的資 源，采用的是日臻成熟的宏基因組技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)了大量具有優(yōu)秀性質(zhì)的酶，說明了宏基因組 技術(shù)發(fā)掘新酶的廣闊前景。
[0004] 在宏基因組技術(shù)篩選新酶的研宄中，篩選效率從土壤等自然環(huán)境到動物消化道， 再到人工馴化的反應(yīng)器依次遞增。這與馴化的強度及選擇壓力是相關(guān)的。在自然環(huán)境中， 比如森林土壤，需要若干年，微生物才能將生物質(zhì)降解，在動物消化道中，這種反應(yīng)需要若 干天，但是水解效率依舊不高，這就是食草動物食量大的原因；而對于人工馴化的反應(yīng)器， 三天即可達到90%的轉(zhuǎn)化率。本研宄從人工馴化反應(yīng)器中篩選木糖苷酶，保證了其高 效性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白及其編碼基因。
[0006] 本發(fā)明提供的蛋白，F(xiàn)52-2,是如下1)或2)的蛋白質(zhì)：
[0007] 1)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；
[0008] 2)將1)所示的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 上述經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨 基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護的范圍。
[0011] 上述DNA分子為如下1)-5)中任一所述的DNA分子：
[0012] 1)編碼區(qū)為序列表中序列1 ;
[0013] 2)編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第11-2170位核苷酸；
[0014] 3)編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第14-2170位核苷酸；
[0015] 4)在嚴格條件下與1)或2)或3)雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子；
[0016] 5)與1)或2)或3)具有90%以上同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0017] 上述嚴格條件可為用0. 1XSSPE (或0. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實驗中65°C下雜交并洗膜。
[0018] 含有上述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā) 明保護的范圍。
[0019] 上述方法中，所述表達載體為pET_28a載體，所述重組載體在本發(fā)明的實施例為 將序列表中序列1自5'末端第14-2170位核苷酸插入pET-28a載體的NdeI與HindIII 酶切位點間得到的載體；
[0020] 上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體得到的重組載體。
[0021] 上述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入目的菌中得到的重組菌。
[0022] 所述目的菌為大腸桿菌，具體為BL21DE3。
[0023] 上述蛋白在作為木糖苷酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0024] 所述0 -木糖苷酶的酶學(xué)特征具體為：最適pH值為4. 5、最適溫度為60°C。
[0025] 上述的蛋白或上述DNA分子或上述的表達盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或 重組菌在制備木糖苷酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0026] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備0 _木糖苷酶的方法。
[0027] 本發(fā)明的方法，為發(fā)酵上述的重組菌，即得到木糖苷酶。
[0028] 上述方法中，所述發(fā)酵為在IPTG誘導(dǎo)下發(fā)酵培養(yǎng)。
[0029] 上述的蛋白在降解生物質(zhì)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍，所述生物質(zhì)為玉米 芯。
[0030] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)新的木糖苷酶F52-2,在以對硝基苯酚木糖苷 (PNPX)為底物，pH 5. 0條件下，最適溫度為60°C，在50°C溫育2小時后，仍能保留85%的 活力；在4°C下，不同pH緩沖液中孵育24小時后，在pH 3. 5-5. 5范圍內(nèi)均能保留超過60% 的剩余活力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031 ] 圖1為對F52-2三維結(jié)構(gòu)及活性位點的預(yù)測
[0032] 圖2為F52-2誘導(dǎo)表達SDS-PAGE圖譜
[0033] 圖3為溫度對F52-2活性的影響
[0034] 圖4為F52-2的溫度穩(wěn)定性
[0035] 圖5為F52-2的最適pH及pH穩(wěn)定性
[0036] 圖6為F52-6及F52-2對木聚糖的水解產(chǎn)物研宄
[0037] 圖7為F52-6及F52-2與F52-6對玉米芯的水解產(chǎn)物曲線。

【具體實施方式】
[0038] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 實施例l、F52-2基因的克隆
[0041] 前期研宄中，利用Fosmid載體構(gòu)建了干式發(fā)酵污泥系統(tǒng)的宏基因組文庫。經(jīng)測 序及softberry預(yù)測0RF，以及NCBI及Pfam數(shù)據(jù)庫注釋。得到F52-2基因，該基因的核苷 酸序列為序列表中序列1自5'末端第11-2170位核苷酸，其編碼的蛋白命名為F52-2,其 氨基酸序列為序列表中序列2自N'末端第1-719位氨基酸。經(jīng)過比對，F(xiàn)52-2蛋白與來自 Clostridium stercorarium的0-木糖苷酶有最高的63%相似性，預(yù)測其為0-木糖苷酶。
[0042] 實施例2、F52-2作為0 -木糖苷酶的應(yīng)用
[0043] 1、重組載體的構(gòu)建
[0044] 以人工合成的序列1為模板，用F52-2F與F52-2R為引物，采用TAKARA公司的 PrimeStar高保真酶進行PCR擴增，得到2179bp的PCR產(chǎn)物，其核苷酸序列為序列1。
[0045] F52-2F:5' -GGAATTCCATATGCTTTTCCAGCGAAGTGACCTGC-3' 包含 Nde I 酶切位點
[0046] F52-2R:5' -CCCAAGCTTTCAGCGGGGCAGCTCCAG-3' 包含 Hind III 酶切位點
[0047] 上述PCR擴增的體系如下：
[0048] 2 X PrimeStar 25 n L Buffer dNTP 4 uL F52-2 F 1 uL F52-2 R 1 uL DNA模板 0. 5 u L PrimeStar 0. 5 u L 去離子水 18 u L
[0049] PCR程序如下：
[0050] 94°Clmin預(yù)變性
[0051] 98〇C10s
[0052] 68〇C120s
[0053] 回到2, 24個循環(huán)
[0054] 72°C5min
[0055] End
[0056] 將上述PCR產(chǎn)物用Nde I與Hind III雙酶切，得到的酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切的 pET-28a 載體（Novagen pET-28a DNA Cat.No.69864-3)連接，得到重組載體。
[0057] 經(jīng)過測序，該重組載體為將序列表中序列1自5'末端第14-2170所述的DNA分子 插入pET-28a載體的Nde I與Hind III酶切位點間得到的載體，表達序列2所示的蛋白， 將該重組載體命名為pET-28a-F52-2。
[0058] 序列表中序列1所示的DNA分子中自5'末端第11-2170位核苷酸為F52-2基因；
[0059] 序列表中序列2所示的蛋白中自N'末端第1-719位氨基酸為F52-2蛋白。
[0060] 2、蛋白的表達與純化
[0061] 1)表達
[0062] 將上述重組載體pET-28a-F52-2轉(zhuǎn)化至BL21DE3感受態(tài)細胞中，在含有50 y g/mL 卡那霉素的LB平板中37 °C培養(yǎng)過夜，得到單菌落，菌落PCR鑒定，引物為F52-2F和F52-2R， 得到2203bp的為陽性重組菌，命名為DE3/pET-28a-F52-2。
[0063] 采用同樣的方法將空載體pET-28a轉(zhuǎn)入BL21DE3感受態(tài)細胞，得到DE3/pET-28a。
[0064] 將DE3/pET-28a-F52-2單菌落接種至100mL含有50yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基 中37°C培養(yǎng)過夜，當(dāng)0D600nm達到0? 4時，加入終濃度為ImM的IPTG(Isopropyl 0 -D-1-Th iogalactopyranoside)誘導(dǎo)四小時。取lmL菌液，離心后收集菌體，懸于200 yL 1XSDS凝 膠加樣緩沖液，煮沸l(wèi)〇min，25°C高速離心lmin，取上清液，上樣量20 y L。以DE3/pET-28a 為對照。
[0065] 10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍染色檢測蛋白表達，結(jié)果如圖2所示，1 為 DE3/pET-28a、2-3 均為 DE3/pET-28a-F52-2，從圖中可以看出，DE3/pET-28a-F52-2 經(jīng)過 四小時的誘導(dǎo)，F(xiàn)52-6成功誘導(dǎo)表達，目的蛋白大小約為78KD。
[0066] 2)、純化
[0067] 收集 DE3/pET-28a-F52-2 菌體，用 PBS 緩沖液（NaCl 137mM，KCl 2. 7mM，Na2HP0410mM，KH2P042mM，pH 7. 4)洗滌菌體三次，重懸，反復(fù)凍融三次破壁。離心， 收取上清，采用鎳柱填料純化蛋白。首先洗絳液（NaH2P0 450mM, NaCl 300mM, imidazo 1 e 20mM, pH 8.0)洗三次，然后洗脫液（NaH2P0450mM, NaCl 300mM, imidazole 250mM, pH 8.0) 洗脫三次，洗滌及洗脫條件均為500g，2min，收集三倍柱體積的洗脫液為目的蛋白F52-2。
[0068] 將目的蛋白F52-2進行SDS-PAGE檢測，得到大小為78KD，說明純化得到目的蛋白 F52-2。
[0069] 3、目的蛋白F52-2的功能驗證及酶特性檢測
[0070] 0 -木糖苷酶活性的測定：反應(yīng)體系：20 y L 25mM pNPX溶液+20 y L lOOmM醋酸鈉 緩沖液。5yL酶液加入50°C預(yù)熱的反應(yīng)體系中，溫育5min，隨后加入50yL 1M似20)3溶 液。于41 Onm處測定吸光值。
[0071] -個單位的酶活（U)定義為一個酶分子每分鐘水解pNPX釋放出對硝基苯（pNP) 的量Omol) 〇
[0072] 1)最適pH的測定條件：
[0073] 將緩沖液更換為不同pH，測定酶活。緩沖液的配制：磷酸氫二鈉-檸檬酸 (3. 5-8. 0)，Tris-HCl (8. 0-10. 0)，磷酸氫二鈉-氫氧化鈉（10. 0-12. 0)。
[0074] 結(jié)果如圖5所示，目的蛋白F52-2能夠降解pNPX，為0-木糖苷酶，且其最適pH值 為 4. 5。
[0075] 2)最適溫度的測定：
[0076] 將酶反應(yīng)體系預(yù)先在20-90°C預(yù)熱5min，再加入酶進行反應(yīng)。反應(yīng)為pH 4. 5。
[0077] 結(jié)果如圖3所示，目的蛋白F52-2能夠降解pNPX，為0 -木糖苷酶，且其最適溫度 為 6(TC〇
[0078] 3)溫度穩(wěn)定性測定條件：
[0079] 將酶在各個溫度下分別溫育20min，40min，60min，80min，lOOmin以及120min，隨 后在60°C，pH 4. 5測定剩余酶活；
[0080] 結(jié)果如圖4所示，目的蛋白F52-2能夠降解pNPX，為0 -木糖苷酶，且其在50°C溫 育2小時后，仍保留有85%的活性。
[0081] 4)pH穩(wěn)定性測定：
[0082]將酶加入對應(yīng)pH的緩沖液中，于4°C放置24h，最后在60°C，pH4. 5條件下測定剩 余活性。
[0083] 結(jié)果如圖5所示，目的蛋白F52-2能夠降解pNPX，為0-木糖苷酶，且其在4°C下， 不同pH緩沖液中孵育24小時后，在pH 3. 5-5. 5范圍內(nèi)均能保留超過60%的剩余活力。
[0084] 5)米氏常數(shù)的測定：
[0085]準備0_50mM的pNPX(對硝基苯酚木糖苷），pNPG(對硝基苯酚葡萄糖苷）以及 pNPA(對硝基苯酷阿拉伯糖苷）溶液，測定酶的反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)（Lineweaver-Burk plot)。
[0086] 酶解產(chǎn)物的研宄采用薄層層析的方法，酶在50°C與底物反應(yīng)4h后，取樣點在硅膠 板上，層析后染色觀察降解產(chǎn)物。
[0087] 結(jié)果如圖6所示，標品為木糖XI、木二糖X2及木三糖X3,泳道1 :陰性對照；泳道 2 :F52-2水解結(jié)果；泳道三：F52-6水解結(jié)果；泳道四：F52-2+F52-6水解結(jié)果，結(jié)果表明，當(dāng) F52-2單獨作用木聚糖時，水解產(chǎn)物僅為少量木糖；當(dāng)F52-6單獨作用時，產(chǎn)物為木糖、木二 糖以及大量寡糖；當(dāng)兩者合并使用時，木二糖的量明顯減少，木糖的量增多，說明兩種酶共 同作用時，F(xiàn)52-2可以解除F52-6的產(chǎn)物抑制，從而提高木糖的產(chǎn)量。
[0088] 4、F52-2促進F52-6對玉米芯降解實驗
[0089] 200U/g玉米芯的比例加入純化的F52-6(氨基酸序列為序列3)和F52-2,50°C溫 育72h，液相測定糖含量。
[0090] 分離條件：
[0091] 分析柱：Shim_pack ISA-07 (4. OmmX 25cm)
[0092] 流動相：A液0. 1M硼酸（用氫氧化鉀調(diào)節(jié)至pH= 8)
[0093] B液0? 4M硼酸（用氫氧化鉀調(diào)節(jié)至pH = 9)
[0094] 梯度：A液100 % -B液100 %，2 % /min直線梯度洗脫
[0095] 流量：0. 6mL/min
[0096] 溫度：65°C
[0097] 衍生條件：
[0098] 衍生液：1 % L-精氨酸，3%硼酸
[0099] 流速：0? 5mL/min
[0100] 反應(yīng)溫度：150°C
[0101] 結(jié)果見圖7,該酶的水解效率為23. 1%，加入50U/g生物質(zhì)上述2純化的F52-2后， 水解效率增加至79. 3%。說明F52-2對F52-6水解玉米芯有顯著的促進作用。
[0102] 5、三維結(jié)構(gòu)的模擬
[0103] 在swiss-model中搜尋最適模板，最后采用pymol軟件對圖像進行修飾。采用 Cluster W進行多序列比對，得到活性位點，見圖1。
[0104] 6、金屬離子（5mM)對酶活性的影響
[0105] 方法：20 y L 25mM的pNPX溶液+20 y L lOOmM醋酸鈉緩沖液（pH 4. 5)，其中加入 終濃度為5mM的各種金屬離子。5 y L上述2純化的F52-2加入60°C預(yù)熱的反應(yīng)體系中，溫 育5min，隨后加入50yL lMNa2C03溶液。于410nm處測定吸光值。
[0106] 表1為金屬離子（5mM)對酶活性的影響
[0107]
[0108]

【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)： 1) 由序列表中序列2所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； 2) 將1)或2)所示的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子為如下1)-5)中任一 所述的DNA分子： 1) 編碼區(qū)為序列表中序列1 ; 2) 編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第11-2170位核苷酸； 3) 編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第14-2170位核苷酸； 4) 在嚴格條件下與1)或2)或3)雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子； 5) 與1)或2)或3)具有90%以上同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或重 組菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所 述DNA分子插入表達載體得到的重組載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于：所述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入目 的菌中得到的重組菌。
7. 權(quán)利要求1所述的蛋白在作為0-木糖苷酶或a_阿拉伯糖苷酶或0-葡萄糖苷酶 的應(yīng)用； 所述0 -木糖苷酶的酶學(xué)特征具體為：最適pH值為4. 5、最適溫度為60°C。
8. 權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2或3所述DNA分子或權(quán)利要求4所述的表達 盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在制備e-木糖苷酶或a-阿拉伯糖苷酶或 0-葡萄糖苷酶中的應(yīng)用。
9. 一種制備0 _木糖苷酶或a -阿拉伯糖苷酶或0 -葡萄糖苷酶的方法，為發(fā)酵權(quán)利 要求6所述的重組菌，即得到0-木糖苷酶或a -阿拉伯糖苷酶或0-葡萄糖苷酶。
10. 權(quán)利要求1所述的蛋白在降解生物質(zhì)中的應(yīng)用，所述生物質(zhì)為玉米芯。
【文檔編號】C12N9/42GK104450648SQ201410654101
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】吳曉磊, 王蒙, 來國莉, 聶勇, 耿爽 申請人:北京大學(xué)