一種共固定化雙酶催化合成海藻糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種共固定化雙酶催化合成海藻糖的方法。發(fā)酵培養(yǎng)能大量合成耐高溫海藻糖合酶的重組大腸桿菌經(jīng)透性化處理后加入β-淀粉酶，并利用殼聚糖和海藻酸鈉共固定化形成微球。含量為25-30%重量的淀粉經(jīng)α-淀粉酶催化后與微球接觸反應(yīng)生成海藻糖，微球重復(fù)利用8-16次后淀粉的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到60%-65%。利用本發(fā)明提供的方法可以實現(xiàn)大規(guī)模、低成本、高效率生產(chǎn)高質(zhì)量的海藻糖。
【專利說明】一種共固定化雙酶催化合成海藻糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種共固定化雙酶催化合成海藻糖的方法，屬于功能糖醇合成【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及用淀粉作為原料催化合成海藻糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]海藻糖(Trehalose)是兩個葡萄糖分子以α，α _1，I糖苷鍵結(jié)合形成的非還原性二糖，海藻糖無半縮醒輕基，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。自1832年Wiggers首次從麥角菌中提取出海藻糖之后，海藻糖被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于自然界的動物、植物及微生物中，如細(xì)菌、古生菌、酵母、蘑菇及無脊椎動物。由于海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下能在細(xì)胞表面形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質(zhì)分子不變性失活，因此在科學(xué)界素有“生命之糖”的美譽。這一獨特的功能特性，使得海藻糖除了可以作為蛋白質(zhì)藥物、酶、疫苗和其他生物制品的活性保護劑以外，還是保持細(xì)胞活性、保濕類化妝品的重要成分，更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風(fēng)味、提升食品品質(zhì)的獨特食品配料，具有廣闊的市場前景和應(yīng)用價值。
[0003]現(xiàn)代的海藻糖的商品化制備方法主要包括化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法。其中酶轉(zhuǎn)化法是目前海藻糖生產(chǎn)的主要途徑，許多生物體內(nèi)都有合成海藻糖的酶系，可以利用基因工程手段高效表達(dá)出來，利用這些酶與底物進(jìn)行催化反應(yīng)，可以大規(guī)模的生產(chǎn)海藻糖。但是，海藻糖合酶屬于胞內(nèi)酶，酶法生產(chǎn)海藻糖過程中通常要破碎菌體，提取與純化海藻糖合成酶系，而在破碎及純化過程中容易造成酶的損失，這無疑加大了企業(yè)的生產(chǎn)成本。
[0004]南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司通過細(xì)胞破碎以及雙酶提取后以木薯淀粉為原料經(jīng)α -淀粉酶和普魯蘭酶水解，再通過利用麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)分步催化反應(yīng)合成海藻糖，但由于破碎過程中容易造成酶的損失以及麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)對麥芽糖并不產(chǎn)生轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致麥芽糖大量積累，最終使得海藻糖的得率不能達(dá)到較高水平，同時MTHase的酶活力也較低，也成為雙酶反應(yīng)的限制因素。
[0005]CN103146779A (一種利用全細(xì)胞催化合成海藻糖的方法)中介紹以生物表面活性劑為透性化試劑處理大腸桿菌細(xì)胞增加其細(xì)胞膜的通透性，從而可以利用全細(xì)胞催化麥芽糖底物生成海藻糖。利用全細(xì)胞催化合成海藻糖可以免去細(xì)胞破碎工序，海藻糖合成酶(Trehalose synthase,簡稱TreS)可以直接作用于麥芽糖底物,將α, α-1，4糖苷鍵連接的麥芽糖通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷一步轉(zhuǎn)化為α，α-1，I糖苷鍵連接的海藻糖。該途徑只需一步反應(yīng)，工藝簡單，但其底物麥芽糖相比較與淀粉價格仍舊比較高昂。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明以淀粉為最初的催化底物，利用雙酶共固定化催化淀粉水解液合成海藻糖。
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有雙酶催化體系中(麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase))酶的利用率低以及在單酶(海藻糖合成酶(TreS))催化原料底物價格較高的問題，利用價格低廉的淀粉為催化底物以及利用單酶催化體系，提供一種新的固定化催化底物合成海藻糖的方法，降低原料成本，從而進(jìn)一步降低海藻糖的生產(chǎn)成本。
[0008]為了克服所述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
一種共固定化制備用于合成海藻糖雙酶微球的方法，制備并透性化處理含海藻糖合成酶的工程菌，在透性化處理的體系中加入至少一種糖化酶，其特征在于:在加入糖化酶之前的透性化體系中加入了海藻酸鈉，并將該體系滴加入含殼聚糖的體系中，制得用于催化淀粉水解液的共固定化雙酶微球。
[0009]本發(fā)明所述的方法，其特征在于:所述透性化體系采用磷酸緩沖鹽溶液，pH值為6-7 ;所述含殼聚糖的體系為酸性體系，含0.1 -0.2 mol/L的氯化鈣與1-1.5重量％的醋酸。
[0010]一種共固定化雙酶催化合成海藻糖的方法，所述方法的步驟為:
(1)制備并透性化處理含海藻糖合成酶的工程菌；
(2)在透性化處理的體系中加入糖化酶；
(3)共固定化制備雙酶微球；
(4)將微球與經(jīng)α-淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液；
(5)分離純化所述步驟(4)的反應(yīng)液獲得海藻糖；
其特征在于，回收步驟(3)所述微球，與含經(jīng)α -淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液。
[0011]本發(fā)明所述的方法，其特征在于，反應(yīng)的具體步驟為:
(1)制備并透性化處理含海藻糖合成酶的工程菌；包括培養(yǎng)海藻糖合成酶的大腸桿菌，在OD6tltl值為0.6-0.8時加入誘導(dǎo)劑產(chǎn)酶6-8小時，獲得發(fā)酵液；離心分離獲得菌體；加入與發(fā)酵液體系相當(dāng)?shù)?.1-0.4 g/L的脂肽類生物表面活性劑溶液，于20-25°C，100-200 rpm下反應(yīng)30-60 min ;離心分離獲得菌體，并用與發(fā)酵液體系相當(dāng)?shù)牧姿猁}緩沖液重懸；獲得3份體積的菌體；
(2)在透性化處理的體系中加入糖化酶，包括加入I份體積含2-3重量％的海藻酸糖化酶溶液，混合均勻；
(3)共固定化制備雙酶微球，包括將步驟(I)所述溶液滴加至含有0.1 -0.2 mol/L的氯化鈣與1-1.5%重量的醋酸的1%_2%的殼聚糖溶液中，且保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)直至滴加結(jié)束30min，制得雙酶固定化微球；
(4)將微球與經(jīng)α-淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液，包括用α -淀粉酶水解含淀粉原料，控制反應(yīng)的終點DE值為19-22，獲得淀粉水解液，并在上述反應(yīng)液中加入雙酶固定化微球，反應(yīng)24-30小時，反應(yīng)條件為45-60 °C，pH 4.8-5.3，攪拌轉(zhuǎn)速 100-200 rpm ；
(5)分離純化所述步驟(4)的反應(yīng)液獲得海藻糖。
[0012](6)回收步驟(4)所述微球與含經(jīng)α -淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液。
[0013]本發(fā)明所述的方法，回收步驟(4)所述微球，進(jìn)行水洗并用于與淀粉水解液接觸反應(yīng)，和/或分離回流步驟(4)所述反應(yīng)液與微球進(jìn)行接觸反應(yīng)。
[0014]本發(fā)明所述的方法，步驟(I)所述工程菌為含有鹽堿地宏基因組(Saline-AlkaliSoil Metagenomes)的海藻糖合成酶基因，并能表達(dá)合成海藻糖合成酶。
[0015]本發(fā)明所述的方法，步驟(I)所述的制備并透性化處理步驟包含菌種活化、培養(yǎng)、誘導(dǎo)、產(chǎn)酶、離心分離、脂肽類生物表面活性劑處理、二次、重懸細(xì)胞的步驟，其重懸體系所用磷酸鹽磷酸根濃度為0.01-0.04 mol/L。
[0016]本發(fā)明所述的方法，步驟(5)中所述方法為固液分離方法，優(yōu)選壓濾機，篩孔小于14目。
[0017]本發(fā)明所述的方法，淀粉水解液的DE值為19-22，制備水解液的淀粉的干物質(zhì)濃度為25-30%，α -淀粉酶的用量為5-10 U/g淀粉，糖化酶的用量為30-35 U/g淀粉。
[0018]本發(fā)明所述的方法，包括葛根淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉及紅薯淀粉。
[0019]本發(fā)明所帶來的有益效果為:
(I)本發(fā)明通過對雙酶共固定化形成了機械強度高的雙酶固定化微球，從而提高了酶的使用效率進(jìn)而提高了海藻糖的生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本，縮短了生產(chǎn)周期。
[0020]( 2 )本發(fā)明通過采用淀粉作為生產(chǎn)海藻糖的最初底物，經(jīng)液化后，通過一步雙酶共催化淀粉水解液生成海藻糖，降低了原料成本。
[0021](3)由于本發(fā)明制得的固定化酶機械強度高，因此可以直接采用過濾法分離海藻糖，方法簡單，大大降低了分離成本，并且固定化酶可以重復(fù)使用8-16次，具有顯著的經(jīng)濟效益和廣闊的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為電鏡下放大40倍后的微球。
[0023]圖2為電鏡下放大10000倍后的微球表面。

【具體實施方式】
[0024]實施例1
本實施例說明菌種的來源。
[0025]本專利所用的菌種為來源于Thermus thermophilus ATCC 33923 (Gene Bank:AQOSO1000003)鹽喊地宏基因組(Saline-Alkali Soil Metagenomes)的海藻糖合成酶基因的大腸桿菌，其中出發(fā)菌株來源、菌種構(gòu)建方式等均采用本申請的發(fā)明人在先公開的文獻(xiàn)“Ling Jiang, Ming Lin, Yang Zhang et al.1dentificat1n and Characterizat1n ofa Novel Trehalose Synthase Gene Derived from Saline-Alkali Soil Metagenomes.Pols One 8(10): e77437.do1: 10.1371/journal, pone.0077437.” 中所述的方法，構(gòu)件得到的菌株編號為BL21-treS。
[0026]同時， 申請人:在此聲明，從專利申請之日起20年內(nèi)，免費向社會公眾無償提供本發(fā)明所述的出發(fā)菌株。
[0027]實施例2
本實施例說明催化合成海藻糖的具體合成步驟以及合成效果。
[0028]取實施例1中所獲得BL21_treS菌株用于海藻糖合成催化。
[0029]本實施例所用耐高溫α-淀粉酶、淀粉酶以及均購自于阿拉丁公司，純度為93%-96%。
[0030]首先采用劃線法于加氨芐的固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌基因工程菌獲得大腸桿菌單菌落。其中加氨芐的固體培養(yǎng)基的配方為:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10g/L，氨芐抗生素0.1 g/L，瓊脂20 g/L。具體的操作過程為，按要求配制培養(yǎng)基，將配置好的培養(yǎng)基于121°C下滅菌30min，待冷卻后倒平板，采用劃線法接種，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)獲取大腸桿菌單菌落。
[0031]第二，挑取上述單菌落接種于加氨芐的LB液體培養(yǎng)基活化菌種，活化培養(yǎng)條件為37 °C, 200 rpm，培養(yǎng)時間12 h。其中加氨芐的LB液體培養(yǎng)配方為:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，氨芐抗生素0.1 g/L。按照上述要求配制好培養(yǎng)基后，分裝于250ml搖瓶中，裝液量為50ml，將配置好的培養(yǎng)基于121°C下滅菌30min，冷卻至室溫，于無菌條件挑取單菌落接種于搖瓶中活化菌種。
[0032]第三，按照實際生產(chǎn)的需求量配制加氨芐的LB液體培養(yǎng)基，具體方法參照第二步中所述的方法。本實施例中，采取3LNBS發(fā)酵罐來培養(yǎng)菌體。
[0033]待滅菌結(jié)束冷卻至室溫后，取活化的BL21_treS菌種按接種量1.5% (V/V)接種到新的加氨芐的LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐中。保持培養(yǎng)條件為37 0C，攪拌轉(zhuǎn)速200 rpm,通氣量為lvvm。在發(fā)酵過程中定時測定細(xì)胞密度，在細(xì)胞密度達(dá)到OD6tltl為0.6-0.8時加入IPTG，保持IPTG終濃度為0.5-1.5mmol/l，誘導(dǎo)產(chǎn)酶7_9h。
[0034]第四，采用無菌手段轉(zhuǎn)移第三步所得到的部分發(fā)酵液，離心分離獲得濕菌體，離心條件為4 °C ,離心轉(zhuǎn)速為6000 rpm,離心時間為lOmin。
[0035]第五，獲取第四步離心所得到的菌體，將其懸浮于與第四步發(fā)酵液等體積的
0.1-0.4 g/L的生物表面活性劑溶液中。在于20°C，150 rpm下反應(yīng)45 min，將細(xì)胞進(jìn)行透性化處理。
[0036]磷酸緩沖液配制的具體步驟為，首先配制0.2mol/L Na2HPO4和0.2mol/L NaH2PO4的母液；按照體積比為0.2mol/L Na2HPO4和0.2mol/L NaH2PO4為4:1混合制得0.2mol/l的緩沖液。將0.2mol/l的緩沖液稀釋得到0.04 mol/L的待用PBS緩沖液。
[0037]第六，經(jīng)透性化處理的細(xì)胞在6000 rpm,離心10 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次后，用1/3體積2%-3%的海藻酸鈉重懸并加入30-35 (U/g淀粉)的β -淀粉酶，充分混合；
第七，用針管抽取一定量混合液，滴加到以持續(xù)攪拌的含有0.1MCaCl2以及1%_1.5%醋酸的1%殼聚糖溶液中，攪拌30min，制得雙酶固定化微球；(附圖)
第八、配制質(zhì)量濃度為30%玉米淀粉溶液，調(diào)制pH6.9，水浴加熱至90-95 1:后，并加入5-10 (U/g淀粉)的耐高溫α -淀粉酶并持續(xù)攪拌一定時間使得DE值為19-22 ；
第九、將步驟(8)中玉米淀粉水解液冷卻至60°C，調(diào)至ΡΗ4.8-5.3，加入步驟(7)中雙酶固定化微球催化淀粉水解液經(jīng)轉(zhuǎn)化分離得海藻糖，反應(yīng)條件為45-60 °C，攪拌轉(zhuǎn)速為100-200 rpm，24-30 h ；
第十，將步驟(9)中的催化液用14目濾網(wǎng)過濾分離，濾液為海藻糖混合液，濾渣為雙酶固定化微球，經(jīng)清水浸泡3h后，重復(fù)利用。
[0038]用高效液相色譜法測定體系中的海藻糖濃度，并計算海藻糖的轉(zhuǎn)化率，以此來評價細(xì)胞的催化活性。其中，色譜柱為Alltima Amino 10A 5u柱(4.6mmX250mm);流動相為 75% 乙腈 /25% H2O。
[0039]經(jīng)檢測，初次轉(zhuǎn)化率為65%，雙酶固定化微球重復(fù)利用8次后轉(zhuǎn)化率為63.8%，雙酶固定化微球重復(fù)利用16次后轉(zhuǎn)化率為61%，平均每次轉(zhuǎn)化時間為24h，且重復(fù)生產(chǎn)16次過程中未染雜菌。
[0040]實施例3
本實施例說明用普魯蘭酶替換β-淀粉酶用于雙酶固定化后催化淀粉水解液合成海藻糖的效果。
[0041]本實施例所用的普魯蘭酶購于阿拉丁，純度為93%_96%。
[0042]按照實施例2所述的種利用雙酶共固定化催化淀粉水解液合成海藻糖的方法，其不同之處在于:
其步驟(6)用普魯蘭酶替換β -淀粉酶用于雙酶固定化后催化淀粉水解液合成海藻糖經(jīng)檢測，初次轉(zhuǎn)化率為64.9%，雙酶固定化微球重復(fù)利用8次后轉(zhuǎn)化率為63.2%，雙酶固定化微球重復(fù)利用16次后轉(zhuǎn)化率為60%，平均每次轉(zhuǎn)化時間為23h，且重復(fù)生產(chǎn)16次過程中未染雜菌。
[0043]實施例4
如實施例2所述的種利用雙酶共固定化催化淀粉水解液合成海藻糖的方法，其不同之處在于:
步驟(8)配制質(zhì)量濃度為30%葛根淀粉溶液，調(diào)制pH6.9，水浴加熱至90-95 1:后，并加入5-10 (U/g淀粉)的耐高溫α -淀粉酶并持續(xù)攪拌一定時間使得DE值為19-22 ；
經(jīng)檢測，初次轉(zhuǎn)化率為64.2%，雙酶固定化微球重復(fù)利用8次后轉(zhuǎn)化率為62.8%，雙酶固定化微球重復(fù)利用16次后轉(zhuǎn)化率為60%，平均每次轉(zhuǎn)化時間為25h，且重復(fù)生產(chǎn)16次過程中未染雜菌。
[0044]實施例5
本實施例說明不經(jīng)過固定化處理直接催化淀粉水解液合成海藻糖的效果。
[0045]取實施例1中所獲得BL21_treS菌株用于海藻糖合成催化。
[0046]本實施例所用耐高溫α-淀粉酶、β_淀粉酶以及均購自于阿拉丁公司，純度為93%-96%。
[0047]首先采用劃線法于加氨芐的固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌基因工程菌獲得大腸桿菌單菌落。其中加氨芐的固體培養(yǎng)基的配方為:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10g/L，氨芐抗生素0.1 g/L，瓊脂20 g/L。具體的操作過程為，按要求配制培養(yǎng)基，將配置好的培養(yǎng)基于121°C下滅菌30min，待冷卻后倒平板，采用劃線法接種，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)獲取大腸桿菌單菌落。
[0048]第二，挑取上述單菌落接種于加氨芐的LB液體培養(yǎng)基活化菌種，活化培養(yǎng)條件為37 °C, 200 rpm，培養(yǎng)時間12 h。其中加氨芐的LB液體培養(yǎng)配方為:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，氨芐抗生素0.1 g/L。按照上述要求配制好培養(yǎng)基后，分裝于250ml搖瓶中，裝液量為50ml，將配置好的培養(yǎng)基于121°C下滅菌30min，冷卻至室溫，于無菌條件挑取單菌落接種于搖瓶中活化菌種。
[0049]第三，按照實際生產(chǎn)的需求量配制加氨芐的LB液體培養(yǎng)基，具體方法參照第二步中所述的方法。本實施例中，采取3LNBS發(fā)酵罐來培養(yǎng)菌體。
[0050]待滅菌結(jié)束冷卻至室溫后，取活化的BL21_treS菌種按接種量1.5% (V/V)接種到新的加氨芐的LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐中。保持培養(yǎng)條件為37 0C，攪拌轉(zhuǎn)速200 rpm,通氣量為lvvm。在發(fā)酵過程中定時測定細(xì)胞密度，在細(xì)胞密度達(dá)到OD6tltl為0.6-0.8時加入IPTG，保持IPTG終濃度為0.5-1.5mmol/l，誘導(dǎo)產(chǎn)酶7_9h。
[0051]第四，采用無菌手段轉(zhuǎn)移第三步所得到的部分發(fā)酵液，離心分離獲得濕菌體，離心條件為4 °C ,離心轉(zhuǎn)速為6000 rpm,離心時間為lOmin。
[0052]第五，獲取第四步離心所得到的菌體，將其懸浮于與第四步發(fā)酵液等體積的
0.1-0.4 g/L的生物表面活性劑溶液中。在于20°C，150 rpm下反應(yīng)45 min，將細(xì)胞進(jìn)行透性化處理。
[0053]磷酸緩沖液配制的具體步驟為，首先配制0.2mol/L Na2HPO4和0.2mol/L NaH2PO4的母液；按照體積比為0.2mol/L Na2HPO4和0.2mol/L NaH2PO4為4:1混合制得0.2mol/l的緩沖液。將0.2mol/l的緩沖液稀釋得到0.04 mol/L的待用PBS緩沖液。
[0054]第六、配制質(zhì)量濃度為30%玉米淀粉溶液，調(diào)制pH6.9，水浴加熱至90-95 1:后，并加入5-10 (U/g淀粉)的耐高溫α -淀粉酶并持續(xù)攪拌一定時間使得DE值為19-22 ；
第七、將步驟(6)中玉米淀粉水解液冷卻至60°C，調(diào)至ΡΗ4.8-5.3，加入步驟(5)中透性化細(xì)胞催化淀粉水解液經(jīng)轉(zhuǎn)化分離得海藻糖，反應(yīng)條件為45-60 V，攪拌轉(zhuǎn)速為100-200rpm,24-30 h ；
用高效液相色譜法測定體系中的海藻糖濃度，并計算海藻糖的轉(zhuǎn)化率，以此來評價細(xì)胞的催化活性。其中，色譜柱為Alltima Amino 100A 5u柱(4.6mmX250mm);流動相為75%乙腈 /25% H2O。
[0055]經(jīng)檢測，初次轉(zhuǎn)化率為10%，平均每次轉(zhuǎn)化時間為24h。
【權(quán)利要求】
1.一種共固定化制備用于合成海藻糖雙酶微球的方法，制備并透性化處理含海藻糖合成酶的工程菌，在透性化處理的體系中加入至少一種糖化酶，其特征在于:在加入糖化酶之前的透性化體系中加入了海藻酸鈉，并將該體系滴加入含殼聚糖的體系中，制得用于催化淀粉水解液的共固定化雙酶微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述透性化體系采用磷酸緩沖鹽溶液，PH值為6-7 ;所述含殼聚糖的體系為酸性體系，含0.1 -0.2 mo I/L的氯化鈣與1-1.5%重量的醋酸。
3.一種共固定化雙酶催化合成海藻糖的方法，所述方法的步驟為: (1)制備并透性化處理含海藻糖合成酶的工程菌； (2)在透性化處理的體系中加入糖化酶； (3)共固定化制備雙酶微球； (4)將微球與經(jīng)α-淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液； (5)分離純化所述步驟(4)的反應(yīng)液獲得海藻糖； 其特征在于，回收步驟(3)所述微球，與含經(jīng)α -淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，反應(yīng)的具體步驟為: (1)制備并透性化處理含海藻糖合成酶的工程菌；包括培養(yǎng)海藻糖合成酶的大腸桿菌，在OD6tltl值為0.6-0.8時加入誘導(dǎo)劑產(chǎn)酶6-8小時，獲得發(fā)酵液；離心分離獲得菌體；加入與發(fā)酵液體系相當(dāng)?shù)?.1-0.4 g/L的脂肽類生物表面活性劑溶液，于20-25°C，100-200 rpm下反應(yīng)30-60 min ;離心分離獲得菌體，并用與發(fā)酵液體系相當(dāng)?shù)牧姿猁}緩沖液重懸；獲得3份體積的菌體； (2)在透性化處理的體系中加入糖化酶，包括加入I份體積含2-3重量％的海藻酸糖化酶溶液，混合均勻； (3)共固定化制備雙酶微球，包括將步驟(I)所述溶液滴加至含有0.1 -0.2 mol/L的氯化鈣與1-1.5%重量的醋酸的1%_2%的殼聚糖溶液中，且保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)直至滴加結(jié)束30min，制得雙酶固定化微球； (4)將微球與經(jīng)α-淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液，包括用α -淀粉酶水解含淀粉原料，控制反應(yīng)的終點DE值為19-22，獲得淀粉水解液，并在上述反應(yīng)液中加入雙酶固定化微球，反應(yīng)24-30小時，反應(yīng)條件為45-60 °C，pH 4.8-5.3，攪拌轉(zhuǎn)速 100-200 rpm ； (5)分離純化所述步驟(4)的反應(yīng)液獲得海藻糖； (6)回收步驟(4)所述微球與含經(jīng)α-淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述工程菌為含有鹽堿地宏基因組(Saline-Alkali Soil Metagenomes)的海藻糖合成酶基因，并能表達(dá)合成海藻糖合成酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述的制備并透性化處理步驟包含菌種活化、培養(yǎng)、誘導(dǎo)、產(chǎn)酶、離心分離、脂肽類生物表面活性劑處理、二次、重懸細(xì)胞的步驟，其重懸體系所用磷酸鹽磷酸根濃度為0.01-0.04 mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(5)中所述方法為固液分離方法，優(yōu)選壓濾機，篩孔小于14目。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，淀粉水解液的DE值為19-22，制備水解液的淀粉的干物質(zhì)濃度為25-30%，α -淀粉酶的用量為5-10 U/g淀粉，糖化酶的用量為30-35U/g淀粉。
9.上述任一權(quán)利要求所述的淀粉，包括葛根淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉及紅薯淀粉。
【文檔編號】C12N11/04GK104328107SQ201410638714
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】黃和, 江凌, 崔懷言, 晏曉琴, 李霜 申請人:南京海和生物科技有限公司