合成海藻糖的專(zhuān)用菌株及其用于合成海藻糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株用于合成海藻糖的解脂亞羅威酵母 菌株（Yarrowialipoidica)CGMCCNO. 11367,及其用于合成海藻糖的方法。
【背景技術(shù)】
[000引海藻糖（Trehalose)由兩分子a-葡萄糖通過(guò)a-1，1糖巧鍵連接，屬于非還原 性二糖（non-re化Cingdisaccharide)，最早在十九世紀(jì)早期從黑麥麥角中發(fā)現(xiàn)的，后來(lái) 在各種動(dòng)植物，微生物細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)海藻糖的存在，尤其是在低含水量或者脫水的細(xì)胞中 含量豐富。比如，在干燥的復(fù)活草（如鱗片卷柏Selaginella16口1(10地如1曰)、休眠的線 蟲(chóng)（nematodes)、脫水面包酵母化aker'Syeast)、干燥的地衣植物中含量豐富巧化ein etal.Newinsightsontrehalose：amultifunctionalmolecule.Glycobiology，13 : 17-27)，運(yùn)些生物細(xì)胞中失去99 %的水分仍能生存若干年，而當(dāng)有水存在時(shí)能迅速恢復(fù)細(xì) 胞活力。在脫水面包酵母中，海藻糖的含量占據(jù)細(xì)胞干重的10~15%左右。
[0003] 海藻糖在細(xì)胞中的存在，除了作為能源儲(chǔ)存外，更多的作為抵御外界不良環(huán)境的 保護(hù)劑（protectant),使得細(xì)胞中的大分子（如酶）在極端條件下（如高溫、低抑、干燥、 冷凍等）仍然具有活性，能維持細(xì)胞質(zhì)中大分子的結(jié)構(gòu)W及維持細(xì)胞膜的完整性（化tani andUsui. 1994.Productionoftrehalosebyfermentationanditsapplication.Food Chem，2 :91-95;SingerandNas-Lindquist. 1998.Multipleeffectsoftrehaloseon proteinfoldinginvitroandinvivo.MolCell,I:639-648)0 由于沒(méi)有還原基團(tuán)， 海藻糖與富含氨基酸的食品配料混合后在高溫下不會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，能良好的保持食品 的風(fēng)味。海藻糖還具有良好的持水性，能與失水細(xì)胞中殘余的水牢固結(jié)合保護(hù)生物大分子 的結(jié)構(gòu)完整性度eltonandGil. 1994.IRandRamanspectroscopiesSadiesofthe interactionoftrehalosewithheneggwhitelysozyme.Biopolymers，34 :957-961)。
[0004] 由于海藻糖具有上述優(yōu)良的生理生化特性，其在醫(yī)藥領(lǐng)域、食品領(lǐng)域W及化妝品 領(lǐng)域都得到十分廣泛的應(yīng)用。
[0005] 在醫(yī)藥領(lǐng)域常用于疫苗、血液制品、抗體的穩(wěn)定劑，使疫苗在常溫下W及冷 凍的條件下同樣具有穩(wěn)定性，增加血液制品W及抗體在冷凍條件下的穩(wěn)定性（Patent W01996/022107)。海藻糖還可W和透明質(zhì)酸配伍用于制備眼部用藥傳遞系統(tǒng)W及潤(rùn)滑劑 (中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利200410036422. 0, 200410075549. 3)，還可W制成關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥劑，起到 抗氧化和抗自由基的作用，改善炎癥癥狀，為軟骨修復(fù)提供所需要的糖分，加速軟骨的修復(fù) (中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利200610103472. 5)。同時(shí)海藻糖還可W進(jìn)行衍生化合成其它的藥物，在防止 腫瘤的侵襲W及轉(zhuǎn)移具有顯著的效果（中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利201010246792. 2,201110150999. 4)。 海藻糖的衍生物還可W用于制備皮膚外用劑，具有促進(jìn)血液循環(huán)，保濕，吸收紫外線W及抗 氧化的功效（PatentW02004/071472,JP2004/001401)。
[0006] 海藻糖由于具有低甜度、非還原性、抗干燥等作用，在食品領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前 景。海藻糖的甜度相當(dāng)于薦糖的45%，口感柔和，能在小腸內(nèi)被消化吸收，可作營(yíng)養(yǎng)源。此 外還具有抗腐蝕性，不生成引起離齒的不溶性葡聚糖，不被口腔病原菌所利用，因此可W作 為新型甜味劑，添加于奶粉、口香糖、巧克力、冰洪淋、糖果等食品中。由于海藻糖對(duì)酸、熱都 非常穩(wěn)定，不具有還原性，在食品加工過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，因此在食品加工過(guò)程中 添加一定量德海藻糖，對(duì)于淀粉類(lèi)食品可抑制淀粉的老化，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期；可抑制蛋白 質(zhì)的變性；對(duì)于肉類(lèi)、油炸類(lèi)等含脂肪多的食品。添加海藻糖可有效的抑制脂肪酸化，保持 食品原有風(fēng)味。
[0007] 海藻糖由于具有優(yōu)良的保濕性使其成為化妝品原料之一。用于皮膚化妝品如洗面 奶中，可抑制皮膚干燥；用于唇膏、口腔清涼劑、口腔芳香劑中，可作為甜味劑、呈味改良劑 及品質(zhì)改良劑。無(wú)水海藻糖可用于護(hù)膚霜等中，作為憐脂及酶的脫水劑。
[0008]由于海藻糖在醫(yī)藥、食品、化妝品領(lǐng)域均具有十分重要的功效，而且新的功效正在 不斷的被開(kāi)發(fā)應(yīng)用，因此，如何更加經(jīng)濟(jì)的規(guī)?；苽渚途哂惺种匾膬r(jià)值。
[0009] 最開(kāi)始的海藻糖制備方法是從釀酒酵母細(xì)胞中提取得到（己西發(fā)明專(zhuān)利 Patent9303490,，日本發(fā)明專(zhuān)利JP7000190,JP7099988)。由于提取得率低，需要破 細(xì)胞壁，步驟多，難W實(shí)際規(guī)?；苽洹：髞?lái)發(fā)現(xiàn)有些微生物能夠W淀粉或麥芽糊精 為原料合成海藻糖，但合成效率較低化atoetal. 1996.Reactionmechanismofa newglycosyItrehalose-producingenzymeisolatedfromthehyperthermopholic archaeumSulfolobussolfataricusKMLBiosciBiotechnolBiochem，60 :921-924)。經(jīng) 過(guò)研究，W麥芽糊精為原料合成海藻糖是在低聚麥芽糖基海藻糖合成酶（MTSase)W及低 聚麥芽糖基海藻糖水解酶（MTOase)的協(xié)同催化下合成的。后來(lái)人們將運(yùn)兩種酶分別克隆 并在大腸桿菌中異源表達(dá)，純化運(yùn)兩種酶后能夠W低聚麥芽糖（或麥芽糊精）為底物合成 海藻糖?；谶\(yùn)種雙酶協(xié)同催化合成海藻糖的原理，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者申請(qǐng)了合成海藻糖的 發(fā)明專(zhuān)利。
[0010] 中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN201310128939. 1(新型麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖 基海藻糖水解酶在海藻糖生產(chǎn)中的應(yīng)用）描述了一種采用分別表達(dá)該雙酶體系（MTSase 與MTOase)W液化淀粉為底物協(xié)同催化合成海藻糖的方法。另外Seo等人采用將麥芽寡 糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶進(jìn)行融合，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，再轉(zhuǎn) 化液化淀粉合成海藻糖的報(bào)道（Seoetal. 2008.Biofunctionalrecombinantfusion enzymebetweenmaltooIigosyItrehalosesynthaseandmaltooIigosyItrehalose treh曰Iohydrol曰Seofthermophilicmicroorg曰nismMet曰Ilosph曰er曰h曰konensis.J MicrobiolBiotechnol，18 :1544-1549)。但不管是分別表達(dá)還是融合表達(dá)，使用的兩種酶 (MTSase與MWase)均采用大腸桿菌表達(dá)。表達(dá)的過(guò)程較為復(fù)雜，需要使用抗生素（如卡 那霉素或者氨節(jié)青霉素等）保持篩選壓力，還需要使用誘導(dǎo)劑（如IPTG等），另外還需要 破壁大腸桿菌W釋放運(yùn)兩種酶，在破壁的同時(shí)大腸桿菌的內(nèi)毒素等有害物質(zhì)也釋放出來(lái)， 同時(shí)大腸桿菌是致病微生物，不適合用于食品制備。雖然從大腸桿菌中分別純化運(yùn)兩種酶， 然后W純酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化液化淀粉合成海藻糖，也可W進(jìn)行，但是純化得到純酶的成本太高。另 夕F，該雙酶體系不能W麥芽糖為底物合成海藻糖，而淀粉液化液里面還有較多的麥芽糖，而 麥芽糖難W與海藻糖分離。因此，采用該方法難W規(guī)?；a(chǎn)海藻糖，或成本很高。
[0011] 還有采用單酶體系轉(zhuǎn)化麥芽糖或者麥芽糖漿合成海藻糖的報(bào)道。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利 (申請(qǐng)?zhí)?01310112536. 8, 一種利用全細(xì)胞催化合成海藻糖的方法）描述了在大腸桿菌中 表達(dá)海藻糖合成酶基因，并用經(jīng)過(guò)表面活性劑滲透處理的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化麥芽糖合成海藻糖。 該方法步驟與使用的試劑較多，比如需要采用抗生素篩選，使用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，使用表面活性 劑進(jìn)行處理細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率也較低。運(yùn)些限制條件使得該方法難W規(guī)?；捎谩Ｖ袊?guó)發(fā)明專(zhuān) 利（申請(qǐng)?zhí)?01310182033. 8, 一種利用固定化海藻糖合成酶生產(chǎn)海藻糖的方法）描述了一 種采用來(lái)自惡臭假單胞菌、熱帶假絲酵母、玫瑰鏈霉菌或大腸桿菌的海藻糖合成酶，并將該 酶固定來(lái)轉(zhuǎn)化麥芽糖合成海藻糖。該方法同樣存在步驟繁多的缺點(diǎn)（培養(yǎng)細(xì)胞，破壁，純化 酶，固定化酶等）。另外，采用麥芽糖為底物轉(zhuǎn)化合成海藻糖，由于麥芽糖與海藻糖均屬于二 糖，反應(yīng)液中存在較多的未反應(yīng)完的麥芽糖（一般仍有20%W上的麥芽糖殘留），存在難W 將二者分離或者分離困難。
[0012]因此，研究開(kāi)發(fā)一種能夠?qū)⒌矸鄹咝мD(zhuǎn)化為海藻糖的新的合成途徑對(duì)于提高生產(chǎn) 效率，降低生產(chǎn)成本具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的酶合成或細(xì)胞合成海藻糖的不足之處，提供一種能 合成海藻糖的解脂亞羅威酵母菌株（Yarrowialipol^ica)CGMCCNO. 11367及其用于合 成海藻糖的方法。本發(fā)明通過(guò)遺傳工程將解脂亞羅威酵母進(jìn)行改良，使得該酵母能夠合成 麥芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase)、麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MWase)W及海藻糖合成 酶（Trehalosesynthase,化eS)，能高效將淀粉液化液或者麥芽糖合成海藻糖。該酵母菌 株除了具備出發(fā)菌株的性能之外（合成赤薛糖醇），還具有出發(fā)菌株所沒(méi)有的功能，即：能 由淀粉液化液或麥芽糖合成海藻糖。因此不但可W直接培養(yǎng)該酵母細(xì)胞發(fā)酵淀粉液化液或 麥芽糖合成海藻糖，還可W用合成赤薛糖醇后的酵母泥作為細(xì)胞催化劑，再轉(zhuǎn)化淀粉液化 液或麥芽糖生成海藻糖。
[0014] 本發(fā)明中使用的合成海藻糖的酵母菌株是解脂亞羅威酵母燈arrowia lipolytica)，已經(jīng)于2015年9月14日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中屯、（北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究