技術(shù)領(lǐng)域:

本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域,涉及基于氟硼吡咯結(jié)構(gòu)的硫化氫熒光探針及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：
:

據(jù)報道，1996年,abe和kimura研究發(fā)現(xiàn)硫化氫(h2s)在機(jī)體內(nèi)的神經(jīng)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著非常重要的作用,這一研究引起各國的研究者對硫化氫的廣泛關(guān)注,自此人們對硫化氫的各方面的生理功能展開了研究，使人們對于硫化氫的認(rèn)識不再局限于其為具有臭雞蛋氣味的有毒氣體。目前的研究表明硫化氫廣泛存在于機(jī)體的各組織器官中,內(nèi)源性的硫化氫主要來源于以l型半胱氨酸或高半胱氨酸為底物的酶催化反應(yīng)過程,所涉及的酶包括cystathionineβ-synthase(cbs,ec4.2.1.22)、cystathionineγ-lyase(cse,ec4.4.1.1)、3-mercaptopyruvatesulphurtransferase(3-mst,ec2.8.1.2)以及catcysteinelyase(cl,ec4.4.1.10)。研究表明，在生理濃度范圍內(nèi),硫化氫對心血管,神經(jīng),消化等系統(tǒng)都具有一定的保護(hù)及調(diào)控作用,此外它還可以調(diào)節(jié)胰島素的釋放,并具有一定的抗炎和抗癌的功能；因此,硫化氫目前已被公認(rèn)為是繼一氧化氮和一氧化碳之后被發(fā)現(xiàn)的第三個氣體信號分子。

近年來,有關(guān)硫化氫生理功能,作用機(jī)制以及相關(guān)藥物的研究引起了生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛關(guān)注；然而,缺乏快速準(zhǔn)確的硫化氫檢測方法一直是阻礙硫化氫相關(guān)研究的瓶頸之一。雖然目前文獻(xiàn)上報道了多種硫化氫的檢測方法,其中包括比色法,電化學(xué)方法,氣相色譜法以及硫化物沉淀法等,但這些方法均具有比較復(fù)雜的樣品前處理過程,難以實現(xiàn)對活細(xì)胞及活體內(nèi)硫化氫的實時監(jiān)控及示蹤,而且其靈敏度及選擇性仍有待進(jìn)一步考證。因此,研究和發(fā)展具有高靈敏度,好的選擇性和生物兼容性,并且對機(jī)體內(nèi)的硫化氫具有動態(tài)示蹤作用的檢測技術(shù)及分析方法是硫化氫相關(guān)研究領(lǐng)域中的前沿課題之一,也是闡明硫化氫生理功能及相關(guān)藥物研究的前提基礎(chǔ)。

基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請的發(fā)明人擬依據(jù)熒光檢測技術(shù)具有靈敏度高, 方便快捷等優(yōu)點，以及可作為理想的檢測方法用于硫化氫分子的示蹤及檢測的基礎(chǔ)，提供基于氟硼吡咯結(jié)構(gòu)的硫化氫熒光探針及其制備方法和用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的一個目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種可通過比值法檢測硫化氫的熒光探針,該探針是一種基于新的反應(yīng)機(jī)理檢測硫化氫的亞砜類熒光探針；其本身的發(fā)射波長在540nm,在檢測硫化氫過程中,硫化氫可引起探針在713nm的熒光增強(qiáng),同時514nm的熒光減弱,從而實現(xiàn)通過比值法對硫化氫的檢測。

本發(fā)明所述的探針由基于下述結(jié)構(gòu)通式(1)的氟硼吡咯衍生物制成，

其中r1,r2,r4,及r6選自氫,甲基,乙基,r3,r5選自甲基,乙基；

本發(fā)明的又一個目的是提供一中可通過熒光淬滅機(jī)制檢測硫化氫的熒光探針,該熒光探針是一種基于新的反應(yīng)機(jī)理檢測硫化氫的亞砜熒光探針；該探針本身的發(fā)射波長在568nm,在檢測硫化氫過程中,硫化氫可引起探針568nm的熒光減弱,從而實現(xiàn)通過熒光淬滅機(jī)制對硫化氫的檢測；

所述的通過熒光淬滅機(jī)制檢測硫化氫的熒光探針由基于通式(2)結(jié)構(gòu)的氟硼吡咯衍生物制成，

其中r1,r4,及r6選自氫,甲基,乙基,r3,r5及r7選自甲基,乙基。

本發(fā)明提供了所述通式(1)和(2)化合物的制備方法,其合成方程式是：

所述制備方法包括以下步驟:

1)在干燥的三氯氧磷逐滴緩慢滴加入干燥的dmf，加入化合物a,室溫反應(yīng)4h。向其中緩慢滴加過量的飽和碳酸鈉溶液，所得混合溶液加適量去離子水洗滌3次，合并的有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾,減壓蒸餾旋干溶劑，得到紅色固體混合物；粗產(chǎn)品用硅膠柱色譜分離，得產(chǎn)物b；

2)將化合物b中加入3-氯過氧苯甲酸，零攝氏度下反應(yīng)6h，加入過量飽和碳酸氫鈉溶液中和未參加反應(yīng)的3-氯過氧苯甲酸，并將體系溫度升至室溫，繼續(xù)攪拌1h，所得混合溶液加適量去離子水洗滌3次，合并的有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾,減壓蒸餾旋干溶劑，得到紅色固體混合物；粗產(chǎn)品利用硅膠柱色譜分離，得到產(chǎn)物c；

3)將化合物c、1-r3-2-r2-1h-咪唑-5(4h)-酮溶于經(jīng)過重蒸處理的無水乙醇中，回流過夜，減壓蒸去溶劑，粗產(chǎn)物直接過硅膠柱色譜分離，得到黃色固體產(chǎn)物bsop；

4)將化合物c、n-r7-2,3,3-三甲基吲哚溶于經(jīng)過重蒸處理的無水乙醇中，回流過夜。減壓蒸去溶劑，粗產(chǎn)物直接過硅膠柱色譜分離，得到黃色固體產(chǎn)物bsohs。

本發(fā)明提供了基于通式(1)和(2)的化合物在制備檢測生物硫化氫熒光探針中的應(yīng)用，尤其是用于制備通過比值法檢測硫化氫的熒光探針(1)，或用于制 備通過熒光淬滅機(jī)制檢測硫化氫的熒光探針(2)；

本發(fā)明中，所述的熒光探針通過以下步驟實現(xiàn)檢測生物硫化氫：

將細(xì)胞與探針(1)或(2)在dmem中孵育30分鐘,除去培養(yǎng)液,并用pbs緩沖液清洗三遍,再加入含有nahs的dmem溶液,孵育30分鐘,然后在激光共聚焦顯微鏡上進(jìn)行細(xì)胞成像。

附圖說明：

圖1、探針bsop的hrms譜圖。

圖2、bosp對于硫化氫的響應(yīng)，其中，(a)紫外吸收變化,(b)比值關(guān)系熒光強(qiáng)度變化,以及(c)熒光增強(qiáng)響應(yīng),條件:bsop(10μm)inthepresenceofnahs(50μm)undermodelconditions(pbsbuffer,20mm,ph7.4,37℃).(b)λex＝460nm,(c)λex＝620nm.

圖3、探針bosp在細(xì)胞內(nèi)對硫化氫的響應(yīng)，其中(a)cellsincubatedwithbospfor30min；(b)cellstreatedwithbospfor30minfollowedbyfurthertreatedwith100μmnahsfor30min。

圖4、探針bsohs的hrms譜圖。

圖5、顯示了將bsohs(10μm)溶液中加入100μmh2s的紫外吸收光譜，其中，曲線分別在加入h2s之前以及加入5分鐘后獲取；測試條件：pbs-乙腈緩沖體系(1:1,v/v,ph＝7.4)。

圖6、顯示了加入100μmh2s之后,探針bsohs-2(10μm)溶液隨時間變化的熒光發(fā)射光譜；時間曲線分別在加入h2s0、0.5、1、1.5、2、3、4、5分鐘后獲?。粶y試條件：pbs-乙腈緩沖體系(1:1,v/v,ph＝7.4)，激發(fā)波長490nm。

圖7、顯示了探針bsohs在565nm處熒光強(qiáng)度隨時間變化的線性擬合直線，其中，測試條件：pbs緩沖溶液(ph＝7.4)，激發(fā)波長490nm。根據(jù)公式dl＝3σ/k，計算獲得bsohs的檢測限為4.59×10^-7m。

圖8、顯示了探針boshs在細(xì)胞內(nèi)對硫化氫的響應(yīng).cardiomyocytesweretreatedwithboshsfor30min,subsequentlyincubatedwith0μm(a)or100μm(b)nahsforanother30min。

具體實施方式：

實施例1：化合物b1(r1,r4,r6＝甲基,r5＝乙基)的制備

將3ml干燥的三氯氧磷加入100ml的圓底燒瓶中，逐滴緩慢滴加入3ml干燥的dmf，攪拌30min。接著，取化合物a1(0.446g,1mmol)的二氯甲烷溶液，滴加至pocl3-dmf混合體系。滴加完成后，室溫反應(yīng)4h。向其中緩慢滴加過量的飽和碳酸鈉溶液，直至沒有氣泡產(chǎn)生。注意控制滴加速度，防止反應(yīng)過于劇烈。待多余的三氯氧磷全部反應(yīng)完，所得混合溶液加適量去離子水洗滌3次，合并的有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥20分鐘，過濾,減壓蒸餾旋干溶劑，得到紅色固體混合物；粗產(chǎn)品用硅膠柱色譜分離，洗脫劑比例為pe:ea＝2:1，得產(chǎn)物b1，產(chǎn)率50％。¹hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ＝9.85(s,1h),7.52(m,3h),7.35(m,4h),7.09(d,j＝8hz,2h),6.71(s,1h),2.72(s,3h),2.43(q,j＝8hz,2h),2.32(s,3h),1.53(s,3h),1.07(t,j＝8hz,3h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ＝186.5,168.3,145.8,143.6,140.5,138.8,137.3,135.9,135.7,133.0,132.6,131.2,130.1,129.9,129.8,128.8,128.7,122.9,21.0,17.1,13.9,13.8,12.6；hrms(esi⁺)calculatedforc27h26n2bf2so[m+h]⁺:475.1827.found:475.1828.。

實施例2：化合物c1(r1,r4,r6＝甲基,r5＝乙基)的制備

將化合物b1(0.238g,0.5mmol)溶于適量的二氯甲烷中，并充分?jǐn)嚢杈鶆颉＜尤?-氯過氧苯甲酸(0.115g,0.49mmol)，零攝氏度下反應(yīng)6h。加入過量飽和碳酸氫鈉溶液中和未參加反應(yīng)的3-氯過氧苯甲酸，并將體系溫度升至室溫，繼續(xù)攪拌1h。所得混合溶液加適量去離子水洗滌3次，合并的有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾,減壓蒸餾旋干溶劑，得到紅色固體混合物；粗產(chǎn)品利用硅膠柱色譜分離，洗脫劑比例為pe:ea＝1:1，得到產(chǎn)物c1，產(chǎn)率75％。¹hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ＝10.50(s,1h),7.75(d,j＝8hz,2h),7.57-7.47(m,3h),7.35-7.28(m,4h),6.69(s,1h),2.73(s,3h),2.41(q,j＝8hz,2h),2.38(s,3h),1.50(s,3h),1.06(t,j＝8hz,3h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ＝185.7,170.0,144.6,141.4,141.2,139.4,136.3,134.7,132.6,130.5,130.1,130.1,129.0,128.9,128.6,128.4,124.8,124.7,122.6,29.7,21.3,17.2,14.1,13.8,12.6；hrms(esi⁺)calculatedforc27h26n2bf2so2[m+h]⁺:491.1776.found:491.1779.。

實施例3:化合物bsop1(r1-r4,r6＝甲基,r5＝乙基)的制備

將化合物c1(490mg,1mmol)、1-r3-2-r2-1h-咪唑-5(4h)-酮(560mg,5mmol)溶于經(jīng)過重蒸處理的無水乙醇中，回流過夜。減壓蒸去溶劑，粗產(chǎn)物直接過硅膠柱色譜分離，展開劑比例為dcm:meoh＝50:1,得到黃色固體產(chǎn)物bsop1292mg，產(chǎn)率50％。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝7.77-7.76(m,3h),7.70-7.65(m,1h),7.53-7.51(m,2h),7.38-7.34(t,2h),7.29(s,1h),7.25-7.23(d,2h),3.06(s,3h),2.71(s,3h),2.42-2.36(dd,2h),2,32(s,3h),2.13(s,3h),1.48(s,3h),1.07-1.03(t,3h)；¹³cnmr(cdcl3,100mhz)δ＝12.60,13.88,15.57,17.21,21.32,26.46,29.69,117.75,124.62,124.66,125.17,126.89,128.60,128.77,128.79,128.93,129.75,129.88,133.12,135.33,138.64,140,74,141.42,143.97,161.54,168.07,169.57.hrms(esi,m/z):calculatedforc32h32bf2n4o2s[m+h]⁺:585.2307,found:585.2300.。

實施例4：化合物bsohs(r1,r4,r6＝甲基,r5,r7＝乙基)的制備

將化合物c1(0.246g,0.5mmol)、n-乙基-2,3,3-三甲基吲哚(0.134g,0.5mmol)溶于經(jīng)過重蒸處理的無水乙醇中，回流過夜。減壓蒸去溶劑，粗產(chǎn)物直接過硅膠柱色譜分離，展開劑比例為dcm:meoh＝20:1,得到黃色固體產(chǎn)物bsohs1，產(chǎn)率65％。¹hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ＝7.64-7.53(m,4h),7.47-7.41(m,5h),7.35-7.23(m,4h),7.20(m,2h),7.04(m,1h),2.64(s,2h),2.34(s,3h),1.69(s,3h),1.46(m,5h),1.36(s,3h),1.26(s,6h),1.00(t,j＝8hz,3h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ＝144.73,141.73,141.46,141.21,139.55,136.40,134.71,132.49,130.14,129.54,128.99,128.87,128.59,128.39,124.72,124.68,123.32,122.48,115.21,115.16,54.60,44.93,22.39,21.38,18.44,17.22,16.10,13.91,12.67,hrms(esi⁺)calculatedforc40h41n3bf2so⁺:660.3026；found:.660.3021。

實施例5：將細(xì)胞與1μmbsop1探針在dmem中孵育30分鐘,除去培養(yǎng)液,并用pbs緩沖液清洗三遍,在加入含有100μmnahs的dmem溶液,孵育30分鐘,然后在激光共聚焦顯微鏡上進(jìn)行細(xì)胞成像。

實施例6:將細(xì)胞與1μmbsohs1探針在dmem中孵育30分鐘,除去培養(yǎng)液,并用pbs緩沖液清洗三遍,在加入含有100μmnahs的dmem溶液,孵育30分鐘,然后在激光共聚焦顯微鏡上進(jìn)行細(xì)胞成像。