一種鑒別飼料中牛乳成分和牛肉骨粉成分的核苷酸序列和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于鑒別飼料中牛肉骨粉成分的試劑盒和寡核苷酸，具體涉及一組鑒別牛肉骨粉成分的寡核苷酸，見(jiàn)序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的寡核苷酸序列，及含有這些寡核苷酸的試劑盒及其檢測(cè)方法，本發(fā)明所述的試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡(jiǎn)便。
【專利說(shuō)明】-種鑒別飼料中牛乳成分和牛肉骨粉成分的核苷酸序列和 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢驗(yàn)檢疫和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)，涉及一種鑒別飼料中牛乳成分 和牛肉骨粉成分的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 為防止瘋牛病通過(guò)飼料及其它動(dòng)物產(chǎn)品傳入我國(guó)，我國(guó)根據(jù)OIE法典制定的BSE 貿(mào)易禁令規(guī)定了禁止從瘋牛病國(guó)家和地區(qū)直接或間接進(jìn)口除牛皮、牛奶及奶制品、牛精液、 牛胚胎、無(wú)蛋白油脂及其產(chǎn)品、骨制磷酸氫鈣（不含蛋白或油脂）、完全由皮革或皮張加工 的工業(yè)用明膠和膠原、照相用明膠、非反芻動(dòng)物源性飼料及產(chǎn)品（出口國(guó)家或地區(qū)禁止使 用的除外）以外的牛及牛產(chǎn)品。飼料和飼料添加劑生產(chǎn)中可能添加的來(lái)源于牛羊的原料包 括：肉粉、骨粉、血液及其制品、內(nèi)臟及其制品、奶及其制品。在這些可能原料中，除奶及其制 品是允許在進(jìn)口飼料及添加劑中存在的之外，其它成分都是不允許添加的。
[0003] 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于同一種屬不同組織成分來(lái)源的鑒別研究還比較少，主要有酶聯(lián)免 疫吸附法（ELISA)、氯仿分離后PCR檢測(cè)法、水和次氯酸鈉洗滌后PCR檢測(cè)法，這些方法的使 用范圍很窄，且特異性不高，因此也很少在實(shí)際中應(yīng)用。目前我國(guó)對(duì)進(jìn)口動(dòng)物飼料和飼料添 加劑的把關(guān)主要采用普通PCR方法或?qū)崟r(shí)熒光PCR方法對(duì)飼料中是否含有牛源性成分進(jìn)行 檢測(cè)，但這類方法是對(duì)種屬來(lái)源進(jìn)行鑒別，無(wú)法對(duì)成分的組織來(lái)源進(jìn)行鑒別和區(qū)分，即無(wú)法 區(qū)分其中添加的是允許添加的乳源性成分，還是加入了貿(mào)易禁令范圍內(nèi)的組織成分。本技 術(shù)建立的是一種可以對(duì)飼料中的牛源性成分進(jìn)行組織來(lái)源鑒別的檢測(cè)方法，對(duì)飼料中貿(mào)易 禁令范圍內(nèi)和范圍外的牛源性組織成分進(jìn)行鑒別，滿足進(jìn)境飼料和飼料添加劑中瘋牛病危 險(xiǎn)物質(zhì)檢測(cè)的需要，以實(shí)現(xiàn)科學(xué)、有效的執(zhí)法把關(guān)，同時(shí)也可用來(lái)規(guī)范我國(guó)的飼料生產(chǎn)，保 障畜產(chǎn)品安全和人民生命健康。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于鑒別牛肉骨粉成分的寡核苷酸。
[0005] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的用 于鑒別牛肉骨粉成分的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種鑒別飼料中牛肉骨粉成分的方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了用于鑒別牛肉骨粉成分的組織標(biāo)的物：牛骨粘連蛋白mRNA的一段 98bp的核糖核酸序列，其具有如序列表SEQ ID No. 1所示的堿基序列。
[0009] 5，-GAUG⑶G⑶GAGGAAACCGAAGAGGAG⑶G⑶GGCCGAGAACCC⑶GCCAGAACCACCA⑶GCAM CACGGCAAG ⑶⑶ GCGAACUGGACGAGAACAA-3，
[0010] 其中，牛骨粘連蛋白對(duì)應(yīng)的堿基序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 根據(jù)上述選取的牛骨粘連蛋白的mRNA序列，本發(fā)明提供了一組用于鑒別牛肉骨 粉成分的寡核苷酸，其具有SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的堿基序列，具體序列如下：
[0012] 上游引物序列：5' -GATGGTGCTGAGGAAACCGA-3'（SEQ ID No. 3)
[0013] 下游引物序列：5' -TTGTTCTCGTCCAGTTCGCA-3'（SEQ ID No. 4)
[0014] 本發(fā)明還提供了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的鑒別牛肉骨粉成分的試劑 盒，包括以下試劑：
[0015] I) RT-PCR反應(yīng)液，其包括：
[0016] 上游引物、下游引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶和RT-PCR buffer ;
[0017] 其中，上游引物和下游引物分別是SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序 列；
[0018] 進(jìn)一步地，本發(fā)明所用的逆轉(zhuǎn)錄酶通常為商品化試劑，例如PrimeScript? RT Enzyme Mix II，購(gòu)自Takara公司；本發(fā)明所用的Taq聚合酶通常為商品化試劑，例如TaKaRa Ex Taq? HS(5U/y 1)，購(gòu)自Takara公司；本發(fā)明所用的RT-PCR buffer通常為商品化試 齊[J，例如 2 X One St印 SYBR? RT-PCR Buffer III，購(gòu)自 Takara 公司。
[0019] 2) RNase Free dH20 ；
[0020] 3)陰性對(duì)照，所述陰性對(duì)照為從牛乳中提取的總RNA ;
[0021] 4)陽(yáng)性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為從牛肉骨粉中提取的總RNA。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種鑒別牛肉骨粉成分的試劑盒的使用方法，該方法基于牛骨粘 連蛋白的mRNA序列和特異性引物、通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法鑒別飼料中牛肉骨粉成分的 方法，包括以下步驟：
[0023] 1)取待測(cè)樣品研磨，提取總RNA ;
[0024] 其中，提取總RNA是按照Trizol法或商品化試劑方法等總RNA提取方法來(lái)進(jìn)行提 取的；
[0025] 2)進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增，其中使用的引物為序列表SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4 所示的上、下游引物；該反應(yīng)體系按照一步法反應(yīng)體系配制，具體組分及配比見(jiàn)表1 :
[0026] 表1實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系組分及配比（總體積20 μ 1)
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一組用于鑒別飼料中牛肉骨粉成分的寡核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列由SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸在制備用于鑒別飼料中牛肉骨粉成分的試劑盒中的 應(yīng)用。
3. -種用于鑒別飼料中牛肉骨粉成分的試劑盒，其特征在于，由以下組分組成： 1. RT-PCR反應(yīng)液，其包括：上游引物、下游引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶和RT-PCR buffer ； 其中，上游引物和下游引物分別是SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列； 2. RNase Free dH20 ； 3) 陰性對(duì)照； 4) 陽(yáng)性對(duì)照。
4. 一種鑒別飼料中牛肉骨粉成分的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 取待測(cè)樣品，提取總RNA ; 2) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，并繪制擴(kuò)增曲線和溶解曲線，其中使用的引物為序列表 SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下游引物； 3) 結(jié)果判定： 陰性檢測(cè)結(jié)果：樣品在83°C處未出現(xiàn)溶解峰，則判定樣品中不含有牛肉骨粉成分。 陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果：樣品在83°C處出現(xiàn)溶解峰，則判定樣品中含有牛肉骨粉成分。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104313161SQ201410592622
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】李冰玲, 馬貴平, 高志強(qiáng), 劉全國(guó), 李炎鑫, 蒲靜, 史喜菊 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局