一種構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的方法。本發(fā)明所提供的構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的方法包括如下步驟：利用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶敲除目的小鼠的尿酸氧化酶基因，得到所述尿酸氧化酶基因被敲除的純合體小鼠即為自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型。實驗證明，利用本發(fā)明方法所得的自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的血尿酸水平為野生型小鼠的3-4倍，達到了高尿酸血癥的水平，更好的模擬了原發(fā)性高尿酸血癥的發(fā)病過程。另外，由于本發(fā)明所得血尿酸水平相對于之前文獻報道的超高水平血尿酸值要低，不存在致死性高尿酸血癥，小鼠存活時間長，利于對該類小鼠行長期實驗。
【專利說明】一種構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的方法及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。涉及一種自發(fā)性高尿酸血癥小鼠的模型的方法及該模 型的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 高尿酸血癥是尿酸合成增加和（或）尿酸排泄減少所引起的全身性疾病，目前已 成為常見的代謝性疾病，其患病率達5%-23. 5%，接近歐美發(fā)達國家水平。近年來國內(nèi)外 研究資料顯示，高尿酸血癥患者中有20%可發(fā)生痛風(fēng)。另外，作為心腦血管疾病的獨立危險 因素，高尿酸血癥可誘發(fā)和加重動脈粥樣硬化性疾病，增加心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡 率，同時，高尿酸血癥也與代謝綜合征、腎臟疾病密切相關(guān)。
[0003] 尿酸氧化酶可將尿酸分解為更易溶于水的小分子尿囊素排出體外，這是許多低級 動物（包括小鼠）維持尿酸穩(wěn)態(tài)的主要途徑。與低級動物不同，人類在進化過程中由于基 因突變，導(dǎo)致該基因不能表達尿酸氧化酶，這是人類易患高尿酸血癥的重要原因。有關(guān)資料 顯示，尿酸氧化酶基因敲除后，小鼠可出現(xiàn)高尿酸血癥和痛風(fēng)癥狀，成為與人類高尿酸血癥 發(fā)病機制非常相似的自發(fā)性高尿酸血癥小鼠動物模型。但之前文獻報道的高尿酸血癥小鼠 模型存在下列缺陷：（1)尿酸氧化酶基因缺失的純合子小鼠于出生后4周內(nèi)有超過一半死 亡；(2)純合子小鼠血尿酸水平是野生型小鼠的10倍余，合并致死性腎臟疾病等，從而無法 模擬人類的發(fā)病過程。
[0004] 基于類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)的靶向基因修飾技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具，其本質(zhì)是一個人工 合成的核酸酶，主要有兩個結(jié)構(gòu)域：特異性識別靶核酸序列的結(jié)合功能域，切斷DNA序列 的核酸酶功能結(jié)構(gòu)域。人工構(gòu)建的序列特異性核酸內(nèi)切酶能夠識別并切割特定的DNA靶 序列，造成雙鏈斷裂從而使得翻譯提前終止或者蛋白讀碼框移位，基因功能性失活。TALEN 技術(shù)自2010年底開始成功應(yīng)用于基因打靶，很快成為一種比鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN)更容易設(shè)計、特異性更高、毒性更低的人工核酸內(nèi)切酶。TALE蛋白家族來 自一類特殊的植物病原體--黃單胞桿菌，TALE蛋白類似于真核生物的轉(zhuǎn)錄因子，它可以 通過識別特異的DNA序列調(diào)控宿主植物內(nèi)源基因的表達，從而提高宿主對該病原體的易感 性。TALE蛋白N端一般有轉(zhuǎn)運信號，C端有核定位信號和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，而中部則是介 導(dǎo)其與DNA特異識別與結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。TALE蛋白的中部包含一段很長的、串聯(lián)排列的重復(fù) 序列，這種重復(fù)序列為這一蛋白家族所獨有，是其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個重要組成部分，具 有特異性識別并結(jié)合特異DNA序列的特性。其序列重復(fù)的部分由1到33個長度為33? 35個氨基酸殘基的重復(fù)單位（或稱重復(fù)單元）串聯(lián)后，再加上末尾（C端）的一個含有20 個氨基酸殘基的半重復(fù)單位構(gòu)成。也就是說，TALE蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含一段連續(xù)的 1. 5?33. 5個重復(fù)單位，其中每個重復(fù)單位以及末尾的半重復(fù)單位可特異地識別并結(jié)合一 個特定的核苷酸靶位點。在每個重復(fù)單位中，+12和+13位的氨基酸殘基是實現(xiàn)靶向識別 特異DNA堿基的關(guān)鍵位點，隨靶點核苷酸序列的不同而異，被稱作重復(fù)可變雙殘基（Repeat variable di-residue，RVD);其他位置的氨基酸殘基則相對固定。不同的RVD能夠相對特 異地分別識別A、T、C、G這4種堿基中的一種或多種，其中分別與這4種堿基相對應(yīng)的最常 見的4種1^0分別是見仏811116)、如仏811617)、冊〇^8 48口）和剛仏811六811)。由此可 見，TALE的重復(fù)單元跟靶序列具有很好的一一對應(yīng)性。另外，應(yīng)用TALEN技術(shù)構(gòu)建周期短， 通常6個月即可得到基因敲除的雜合子小鼠。
[0005] 自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型是研究高尿酸血癥發(fā)病機制、篩選治療高尿酸血癥新 藥的重要工具，因此構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型勢在必行。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的方法。
[0007] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的方法，包括如下步驟：利用類 轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN)技術(shù)敲除目的小鼠的尿酸氧化酶基因，得到所述尿酸 氧化酶基因被敲除的純合體小鼠即為自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型。
[0008] 在本發(fā)明中，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶作用于所述尿酸氧化酶基因的其 中一個編碼蛋白--尿酸氧化酶-001的第三個外顯子，其核苷酸序列如序列表中序列5所 /Jn 〇
[0009] 具體而言，在本發(fā)明中，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶對所述尿酸氧化酶基 因的兩個作用靶點分別為：序列表中序列5的第20-34位，以及序列表中序列5的第51-66 位。
[0010] 更加具體的，在本發(fā)明中，組成所述類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶的兩個TALEN 蛋白的氨基酸序列分別如序列表中序列3和序列表中序列4所示；序列3所示的TALEN蛋 白作用于序列5的第20-34位；序列4所示的TALEN蛋白作用于序列5的第51-66位。
[0011] 其中，序列3由934個氨基酸組成，第176-666位為RVD區(qū)域，第689-934位為Fok I結(jié)構(gòu)域。序列4由966個氨基酸組成，第176-700為RVD區(qū)域，第723-966位為Fok I結(jié) 構(gòu)域。
[0012] 所述序列3所示的TALEN蛋白的編碼序列具體如序列表中序列1的第383-3187 位所示；所述序列4所示的TALEN蛋白的編碼序列具體如序列表中序列2的第332-3232位 所示。
[0013] 在本發(fā)明中，所述方法具體可包括如下步驟：
[0014] (1)將序列表中序列1的第383-3187位和序列2的第332-3232位所示的兩個DNA 片段分別進行體外轉(zhuǎn)錄，得到兩段mRNA序列，分別記為TALEN-LlmRNA和TALEN-RlmRNA ;
[0015] 所述TALEN-LlmRNA的序列為將序列1中的T替換為U后得到的序列；所述 TALEN-RlmRNA的序列為將序列2中的T替換為U后得到的序列；
[0016] (2)將步驟（1)獲得的所述TALEN-LlmRNA和所述TALEN-RlmRNA注射到所述目的 小鼠的受精卵胞質(zhì)中，得到代小鼠；
[0017] 所述代小鼠在基因型上為嵌合體小鼠；
[0018] (3)將步驟⑵獲得的所述R)代小鼠與新的所述目的小鼠（野生型）進行雜交， 從Fl代小鼠中獲得所述尿酸氧化酶基因被敲除的雜合體小鼠；
[0019] (4)將雄性的所述雜合體小鼠與雌性的所述雜合體小鼠進行一次或多次雜交，從 雜交后代中獲得所述尿酸氧化酶基因被敲除的純合體小鼠；所述純合體小鼠即為自發(fā)性高 尿酸血癥小鼠模型。
[0020] 在所述方法的步驟⑵中，將所述TALEN-LlmRNA和所述TALEN-RlmRNA注射 到所述目的小鼠的受精卵胞質(zhì)中，具體為：將5 μ g所述TALEN-L ImRNA和5 μ g所述 TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠的所述受精卵胞質(zhì)中。
[0021] 在本發(fā)明中，所述目的小鼠具體為C57BL/6J小鼠。
[0022] 本發(fā)明的另一個目的是用于構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的試劑盒。
[0023] 本發(fā)明所提供的用于構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的試劑盒，可包括如下（al) 和（a2):
[0024] (al) TALEN-LlmRNA，其序列為將序列1中的T替換為U后得到的序列；
[0025] (a2) TALEN-RlmRNA，其序列為將序列2中的T替換為U后得到的序列。
[0026] 所述試劑盒中還含有記載有上述步驟（2)-(4)內(nèi)容的說明書。
[0027] 其中，將所述TALEN-LlmRNA和所述TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠的受精卵 胞質(zhì)中，為：將5 μ g的所述TALEN-LlmRNA和5 μ g的所述TALEN-RlmRNA注射到所述目的小 鼠的所述受精卵胞質(zhì)中。所述目的小鼠具體為C57BL/6J小鼠。
[0028] 在本發(fā)明中，所述尿酸氧化酶基因敲除是指尿酸氧化酶基因發(fā)生突變，導(dǎo)致尿酸 氧化酶蛋白讀碼框改變，尿酸氧化酶蛋白功能性失活。所述尿酸氧化酶基因被敲除的雜合 體小鼠是指來自父方和母方的兩套染色體中有一套染色體的所述尿酸氧化酶基因被敲除， 另一套未被敲除。所述尿酸氧化酶基因被敲除的純合體小鼠是指來自父方和母方的兩套染 色體上的所述尿酸氧化酶基因均被敲除。進一步，在本發(fā)明的一個實施例中，所述尿酸氧化 酶基因被敲除具體體現(xiàn)為缺失序列表中序列5的第17-44位核苷酸。
[0029] 在本發(fā)明中，所述自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型中的"自發(fā)性"主要體現(xiàn)為：所述小 鼠模型（即所述尿酸氧化酶基因被敲除的純合體小鼠）的血尿酸含量相對于野生型小鼠的 水平為高尿酸血癥狀態(tài)，且不同于傳統(tǒng)給藥造模構(gòu)建的繼發(fā)性高尿酸血癥。
[0030] 實驗證明，利用本發(fā)明方法所得的自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型（即所述尿酸氧化 酶基因被敲除的純合體小鼠）的血尿酸水平為野生型小鼠的3-4倍（包括雌雄小鼠）。另 夕卜，由于本發(fā)明所得小鼠模型的血尿酸水平相對于之前文獻報道的超高水平血尿酸值要 低，不存在致死性高尿酸血癥，小鼠存活時間長，利于對該類小鼠實施長期實驗。
[0031] 本發(fā)明的優(yōu)勢：現(xiàn)有的高尿酸血癥動物模型尚缺乏穩(wěn)定性和持久性，與人類發(fā)病 機制存在不同程度的差距，造模用藥劑量和時間不統(tǒng)一，缺乏公認(rèn)的建立模型的標(biāo)準(zhǔn)，造模 導(dǎo)致的腎損害和動物的死亡率問題需要仍待處理。本發(fā)明所制備的自發(fā)性高尿酸血癥小鼠 模型更近似于人類嘌呤代謝障礙和（或）尿酸排泄障礙所形成的持久穩(wěn)定的高尿酸血癥動 物模型，利于觀察治療藥物對尿酸排泄和嘌呤代謝的作用以及對尿酸鹽沉積的影響，從而 為商尿酸血癥治療提供研究基礎(chǔ)和思路。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1為TALEN技術(shù)尿酸氧化酶基因敲除示意圖。
[0033] 圖2為體外轉(zhuǎn)錄mRNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖。其中，泳道1為不帶有 po IyA的TALEN-LlmRNA ;泳道2為帶有po IyA的TALEN-LlmRNA ;泳道3為純化后帶有 polyA 的 TALEN-LlmRNA ;泳道 4 為不帶有 polyA 的 TALEN-RlmRNA ;泳道 5 為帶有 polyA 的 TALEN-RlmRNA ;泳道 6 為純化后帶有 polyA 的 TALEN-RlmRNA ;泳道 7 為 DL2000DNA Marker (Takara) 〇
[0034] 圖3為R)代小鼠基因型鑒定結(jié)果圖（兩個下劃線區(qū)域為TALEN的兩個靶序列， 中間區(qū)域為TALEN的spacer區(qū)域）。其中，WT為野生型小鼠；6#和12#為2個R)代小鼠 (12#小鼠的尿酸氧化酶基因的2個拷貝突變的不一樣）。
[0035] 圖4為尿酸氧化酶基因被敲除的Fl代雜合體小鼠的基因型比較分析一TALEN作 用位點附近敲除前后序列比對結(jié)果。其中，WT為野生型小鼠（即敲除前）；MT為Fl代雜合 體小鼠（即敲除后）。
[0036] 圖5為Fl代雜合體小鼠的尿酸氧化酶基因敲除前后轉(zhuǎn)錄本1和3編碼蛋白序列 比對結(jié)果。其中，WT為野生型小鼠（即敲除前）；MT為Fl代雜合體小鼠（即敲除后）。
[0037] 圖6為F2代小鼠基因型鑒定電泳圖結(jié)果。泳道10-21對應(yīng)待測的F2代小鼠。其 中，泳道10和13對應(yīng)的小鼠為純合體（僅得到一條大小為206bp)，泳道12、14、15、16、17、 18、20對應(yīng)的小鼠為雜合體（得到兩條大小分別為234bp和206bp的目的條帶），泳道11、 19和21為野生型（僅得到一條大小為234bp)。WT為作為對照的野生型C57BL/6J小鼠； H2O為以水代替模板的對照。
[0038] 圖7為RNA水平驗證F2代純合體小鼠的尿酸氧化酶基因敲除。Homo :純合體小 鼠 ；WT :野生型小鼠；*#p〈0. 001。
[0039] 圖8為實施例1采用TALEN技術(shù)獲得的基因敲除的8周齡雄性純合體小鼠的照片。
[0040] 圖9為實施例1采用TALEN技術(shù)獲得的基因敲除的8周齡雌雄性純合體小鼠及同 窩野生型小鼠血尿酸水平。Homo :純合體小鼠 ；WT :野生型小鼠；#p〈0. 01。
[0041] 圖10為實施例1采用TALEN技術(shù)獲得的基因敲除的8周齡雄性純合體小鼠腎臟 大體觀察結(jié)果。A為純合體小鼠腎臟大體肉眼觀察照片，B為純合體小鼠腎臟大體解剖鏡下 觀察結(jié)果（10倍）。
[0042] 圖11為實施例1采用TALEN技術(shù)獲得的基因敲除的8周齡雄性純合體小鼠及同 窩野生型小鼠的腎臟病理檢測。A為野生型小鼠腎臟HE染色（鏡下X 40倍）；B為純合體 小鼠腎臟HE染色（鏡下X 40倍）。

【具體實施方式】
[0043] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0044] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045] 各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq酶及PCR相關(guān)試劑購自NEB公司。常規(guī)化 學(xué)試劑主要購自Sigma和上海化學(xué)試劑公司。膠回收試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒購于Qiagen 公司，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司。
[0046] C57BL/6J小鼠：斯萊克公司。
[0047] 實施例1、自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的構(gòu)建
[0048] 本實施例利用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN)技術(shù)敲除C57BL/6J小鼠的 尿酸氧化酶基因，得到所述尿酸氧化酶基因被敲除的純合體小鼠即為自發(fā)性高尿酸血癥小 鼠模型。
[0049] 一、TALEN 位點設(shè)計
[0050] 小鼠的尿酸氧化酶基因 （MGI :98907 ;基因染色體位置：Chr3:146597077-1466323 05bp,+strand)可產(chǎn)生4個轉(zhuǎn)錄本，2個可編碼蛋白。尿酸氧化酶-001，尿酸氧化酶-003分 別為303aa和199aa。本發(fā)明的發(fā)明人針對尿酸氧化酶-001的第三個外顯子設(shè)計TALEN， 該外顯子的序列信息如下（設(shè)計TALEN的兩個靶序列為下劃線標(biāo)記處，中間區(qū)域為TALEN 的spacer區(qū)域）：
[0051] 5, -ATCAGAAACATCGAGACCTTTGCAATGAACATCTGTGAGCACTTCCTCTCTTCTTTTAACCATGTC ACTCGAGCCCACGTCTACGTGGAAGAGGTCCCCTGGAAACGATTTGAAAAG-3'（序列 5)。
[0052] 最終設(shè)計并人工合成得到組成類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶的兩個TALEN蛋白 對應(yīng)的兩段DNA序列，分別如序列表中序列1的第383-3187位和序列2的第332-3232位 所示。其中，序列1的第383-3187位編碼序列表中序列3所示的TALEN蛋白；序列2的 第332-3232位編碼序列表中序列4所示的TALEN蛋白。序列3由934個氨基酸組成，第 176-666位為RVD區(qū)域，第689-934位為Fok I結(jié)構(gòu)域。序列4由966個氨基酸組成，第 176-700為RVD區(qū)域，第723-966位為Fok I結(jié)構(gòu)域。
[0053] TALEN技術(shù)基因敲除示意圖如圖1所示。
[0054] 二、TALEN 體外轉(zhuǎn)錄
[0055] 采用mMESSAGE mMACH丨NE ? T7Ultra Kit對步驟一設(shè)計合成的序列1的 第383-3187位和序列2的第332-3232位所示兩個DNA序列分別進行體外轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物使 用MEGAclearTM Kit純化。相關(guān)操作步驟詳見相關(guān)產(chǎn)品說明書。體外轉(zhuǎn)錄mRNA的1% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。最終得到兩段mRNA序列，分別記為TALEN-LlmRNA和 TALEN-RlmRNA。
[0056] 其中，所述TALEN-LlmRNA的序列為將序列1中的T替換為U后得到的序列；所述 TALEN-RlmRNA的序列為將序列2中的T替換為U后得到的序列。
[0057] 三、TALEN mRNA注射受精卵獲得R)代嵌合體小鼠
[0058] 用 I X TE 緩沖溶液（配方：1M Tris-HCl(pH 8.0) lml，加 0.5M EDTA(pH 8. 0)0. 2ml，用去離子水定容至100ml)將步驟二體外轉(zhuǎn)錄獲得的兩段mRNA配制成100 μ I 體系，使其中TALEN-LlmRNA和TALEN-RlmRNA的終濃度均為50ng/ μ 1。將配置好的樣品注 射到C57BL/6J小鼠的受精卵胞質(zhì)中，于37°C培養(yǎng)24小時至二細胞期后移植到代孕雌鼠中， 至代小鼠出生。
[0059] 四、FO代小鼠基因型的鑒定
[0060] 1、H)代小鼠基因組制備
[0061] 代小鼠出生14天剪取鼠尾0. 3cm，加400 μ 1裂解液（由上海南方模式生物研 究中心提供，產(chǎn)品目錄號：匪S014)及40μ 1蛋白酶Κ(濃度為10mg/ml)，56°C消化過夜。離 心取上清，兩倍體積無水乙醇沉淀，75 %乙醇洗滌，稍晾干后溶解于100 μ 1純水中，50°C烘 箱助溶1小時。
[0062] 2、R)代小鼠基因型鑒定
[0063] 以步驟1獲得的各R)代小鼠的基因組為模板，使用NEB LongAmpR Taq DNA Polymerase 擴增鑒定片段，引物為 5' -ggctgggtttagtggcgatttc-3' 和 5'-tcccgtgagtaggcatttggtgat_3'?？蓴U增出約 1500bp 條帶。反應(yīng)條件為 94°C30s 變性 后；94°C 20s，65°C 90s，進行31個循環(huán)；65°C延伸lOmin。PCR體系參見NEB說明書。1%瓊 脂糖凝膠電泳后割膠回收約1500bp條帶，使用Qiagen膠回收Kit，最后直接用水回收DNA， 體積為20 μ 1?；厥债a(chǎn)物連接T-載體，轉(zhuǎn)化后涂于Amp+LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時。每塊 平板挑取6個單克隆送測序，測序引物為5'-ggctgggtttagtggcgatttc_3'。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn) 尿酸氧化酶-OOl的第三個外顯子區(qū)出現(xiàn)缺失或移碼的小鼠為陽性。
[0064] 結(jié)果顯示，通過受精卵胞質(zhì)注射和移植，受體小鼠數(shù)為8只，懷孕數(shù)為3只，懷孕率 37. 50%;移植卵數(shù)為144,出生小鼠（R)代）數(shù)為19,出生率13. 19%。陽性11只，陽性率 57. 89%。部分陽性小鼠（6#和12#)的基因型鑒定結(jié)果如圖3所示。
[0065] 五、Fl代雜合體小鼠的獲得及基因型鑒定
[0066] 1、Fl代小鼠的獲得
[0067] 根據(jù)步驟四對R)代小鼠的基因測序結(jié)果，選取尿酸氧化酶編碼蛋白序列出現(xiàn)移 碼的代雄鼠（12#)與野生型C57BL/6J雌鼠交配，得到Fl代小鼠（野生型和雜合型）。
[0068] 2、F1代小鼠基因組制備
[0069] 參照步驟四1進行。
[0070] 3、F1代小鼠基因型鑒定
[0071] 參照步驟四2進行。
[0072] 結(jié)果顯示，最終獲得的Fl代雜合體小鼠為缺失28個堿基對的尿酸氧化酶基因敲 除雜合子小鼠（即缺失序列表中序列5的第17-44位核苷酸）（圖4)。相應(yīng)的，由此而引起 的Fl代雜合體小鼠的尿酸氧化酶基因敲除前后轉(zhuǎn)錄本1和3編碼蛋白序列比對結(jié)果如圖 5所示。
[0073] 六、F2代純合體小鼠的獲得及基因型鑒定
[0074] 1、F2代小鼠的獲得
[0075] 選取步驟五獲得的Fl代雜合體雄性小鼠與步驟五獲得的Fl代雜合體雌性小鼠， 進行雜交，得到F2代小鼠（野生型、雜合型和純合型）。
[0076] 2、F2代小鼠基因組制備
[0077] 參照步驟四1進行。
[0078] 3、F2代小鼠基因型鑒定
[0079] 以步驟2獲得的F2代小鼠的基因組為模板，使用NEB LongAmp? Taq DNA Polymerase 擴增鑒定片段，引物為 5' -acagatcagaaacatcgaga-3' 和 5'-tggacgtgtttgatcccatt_3'。反應(yīng)條件為 94°C 30s 變性后；94°C 20s，65°C 90s,進行 31 個循環(huán)；65°C延伸lOmin。PCR體系參見NEB說明書。反應(yīng)結(jié)束后進行1 %瓊脂糖凝膠電泳。 同時設(shè)置了野生型C57BL/6J小鼠作為對照，設(shè)置以水代替模板的對照。
[0080] 電泳結(jié)果如圖6所示，泳道10-21對應(yīng)待測的F2代小鼠。其中，泳道10和13對應(yīng) 的小鼠為純合體（僅得到一條大小為206bp的目的條帶），泳道12、14、15、16、17、18、20對 應(yīng)的小鼠為雜合體（得到兩條大小分別為234bp和206bp，泳道11、19和21為野生型（僅 得到一條大小為234bp的目的條帶）。進一步經(jīng)測序證實，234bp的目的條帶與206bp的目 的條帶相差的28bp正為序列表中序列5的第17-44位核苷酸。
[0081] 七、RNA水平驗證F2代純合體小鼠的尿酸氧化酶基因敲除成功
[0082] 1、RNA抽提：取野生型及F2代純合體小鼠肝臟組織，剪碎，置于硬壁管，力口 入Iml Trizol (Roche公司）及瓷珠10粒，于全自動樣品快速研磨儀（上海凈信科技； TiSSuelySer48)中震蕩60秒，震蕩頻率為70Hz。離心取上清液。后續(xù)RNA抽提步驟按 TIANGEN-kit(PRlOOll)說明書進行。
[0083] 2、反轉(zhuǎn)錄：按TaKaRa(RR047A)反轉(zhuǎn)試劑盒說明書對抽提的RNA進行反轉(zhuǎn)。
[0084] 3、RT-PCR :尿酸氧化酶基因的檢測引物為 5' -gtgagcacttcctctcttcttt-3' 和5' -ggacgtgtttgatcccattct-3'，作為內(nèi)的Actin基因的檢測引物為 5,-Ctccctggagaagagctatga-Sj和 5'-ggcatagaggicttiacggatg-S'。反應(yīng)條件為 94。。30s 預(yù)變性后；94°C 10s，57°C 20s，72°C 20s，進行40個循環(huán)。反應(yīng)體系參見TaKaRa(RR047A)說 明書。應(yīng)用軟件OriginProS進行統(tǒng)計分析，得到結(jié)果如圖7。說明從RNA水平來說，尿酸氧 化酶基因已經(jīng)敲除成功。
[0085] 實施例2、F2代純合體小鼠的表型及生理特性鑒定
[0086] 一、小鼠表型觀察
[0087] 實施例1得到的F2代純合體小鼠、雜合體小鼠及同窩野生型小鼠均與普通的C57 小鼠相似。毛色均為黑色，飲食活動均正常，且無發(fā)育不全及畸形。其中圖8為實施例1采 用TALEN技術(shù)獲得的基因敲除的8周齡雄性純合體小鼠的照片。
[0088] 二、血尿酸水平檢測
[0089] 檢測實施例1應(yīng)用TALEN技術(shù)獲得的基因敲除8周齡雌雄性純合體及同窩野生型 小鼠血尿酸水平。具體如下：
[0090] 8周齡雌雄性純合體及同窩野生型小鼠分為4組，即雄性純合子小鼠、雌雄純合 子小鼠、雄性野生型小鼠及雌雄野生型小鼠，每組各5只小鼠。將小鼠禁食不禁水14小時 后，稱取體質(zhì)量，將濃度為10% (l〇g/l〇〇mL)的水合氯醛水溶液按照3mL/kg體重的用量對 小鼠進行腹腔麻醉，并于內(nèi)眥靜脈處采取靜脈血，3500r/min離心15分鐘分離出血清，在 TOSHIBA TBA-40FR全自動生化分析儀上檢測血尿酸（UA)值。每份測試樣本重復(fù)測定三次， 結(jié)果取平均值。
[0091] 結(jié)果顯示，純合體小鼠血尿酸水平為同窩野生型小鼠的3-4倍（包括雌雄小鼠）， 且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。詳細結(jié)果見圖9?？梢?，純合體小鼠的血尿酸水平達到了高尿酸血癥 的水平，更好的模擬了原發(fā)性高尿酸血癥的發(fā)病過程。
[0092] 三、病理觀察
[0093] 解剖實施例1應(yīng)用TALEN技術(shù)獲得的基因敲除純合體小鼠，肉眼見大體表面呈不 規(guī)則形態(tài)，布滿黃色結(jié)節(jié)樣物，結(jié)果見圖10中A。解剖鏡下見明顯腎盂積水，腎臟結(jié)構(gòu)異常， 結(jié)果見圖10中B。
[0094] 解剖實施例1應(yīng)用TALEN技術(shù)獲得的基因敲除純合體、野生型小鼠，制備腎臟切 片，通過HE染色檢查病理變化。從病理切片可見，野生型小鼠為正常腎臟形態(tài)，純合體小鼠 見腎小球結(jié)構(gòu)異常，有腎結(jié)石形成，結(jié)果見圖11。
【權(quán)利要求】
1. 一種構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的方法，包括如下步驟：利用類轉(zhuǎn)錄激活因子 效應(yīng)物核酸酶敲除目的小鼠的尿酸氧化酶基因，得到所述尿酸氧化酶基因被敲除的純合體 小鼠即為自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物 核酸酶作用于所述尿酸氧化酶基因的如下片段：序列表中序列5所示的DNA片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶對所 述尿酸氧化酶基因的兩個作用靶點分別為：序列表中序列5的第20-34位，以及序列表中序 列5的第51-66位。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：組成所述類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶 的兩個TALEN蛋白的氨基酸序列分別如序列表中序列3和序列表中序列4所示；序列3所 示的TALEN蛋白作用于序列5的第20-34位；序列4所示的TALEN蛋白作用于序列5的第 51-66 位。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述序列3所示的TALEN蛋白的編碼序 列如序列表中序列1的第383-3187位所示；所述序列4所示的TALEN蛋白的編碼序列如序 列表中序列2的第332-3232位所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟： (1) 將序列表中序列1的第383-3187位和序列2的第332-3232位所示的兩個DNA片 段分別進行體外轉(zhuǎn)錄，得到兩段mRNA序列，分別記為TALEN-LlmRNA和TALEN-RlmRNA ; (2) 將步驟（1)獲得的所述TALEN-LlmRNA和所述TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠 的受精卵胞質(zhì)中，得到代小鼠； (3) 將步驟（2)獲得的所述R)代小鼠與所述目的小鼠進行雜交，從F1代小鼠中獲得所 述尿酸氧化酶基因被敲除的雜合體小鼠； (4) 將雄性的所述雜合體小鼠與雌性的所述雜合體小鼠進行一次或多次雜交，從雜交 后代中獲得所述尿酸氧化酶基因被敲除的純合體小鼠；所述純合體小鼠即為自發(fā)性高尿酸 血癥小鼠模型。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，將所述TALEN-LlmRNA和所 述TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠的受精卵胞質(zhì)中，為：將5 y g的所述TALEN-LlmRNA 和5 y g的所述TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠的所述受精卵胞質(zhì)中。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述目的小鼠為C57BL/6J小 鼠。
9. 用于構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型的試劑盒，包括如下（al)和（a2): (al)TALEN-LlmRNA，其序列為將序列1中的T替換為U后得到的序列； (a2)TALEN-RlmRNA，其序列為將序列2中的T替換為U后得到的序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有記載有權(quán)利要求 6中的步驟（2)-⑷內(nèi)容的說明書； 所述說明書中，所述"將步驟（1)獲得的所述TALEN-LlmRNA和所述TALEN-RlmRNA注 射到所述目的小鼠的受精卵胞質(zhì)中"，具體為：將5 y g的所述TALEN-LlmRNA和5 y g的所述 TALEN-RlmRNA注射到所述目的小鼠的所述受精卵胞質(zhì)中； 所述目的小鼠具體為C57BL/6J小鼠。
【文檔編號】C12N15/89GK104388467SQ201410584163
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】李長貴, 路杰 申請人:李長貴