體外模擬胃腸消化制備綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮抗氧化肽液的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及體外模擬胃腸消化制備綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮抗氧化肽液的方法，屬于食品加工技術(shù)和蛋白利用【技術(shù)領(lǐng)域】。采用的制備工藝以綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮為原料，經(jīng)剪切、烘干、粉碎等預(yù)處理后，使用體外模擬胃腸消化技術(shù)，由含胃蛋白酶、胰蛋白酶構(gòu)建的雙酶模擬胃腸消化體系，沸水浴滅酶、調(diào)節(jié)pH法集成2次離心手段制備魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液。本發(fā)明的制備方法采用雙酶酶解反應(yīng)體系，極大地提高了魚(yú)皮蛋白的水解效率，使原料得以充分利用；體外模擬胃腸消化過(guò)程，在37℃水浴中進(jìn)行，酶解條件溫和，與人體相近，能更好地反映人體的消化過(guò)程。
【專(zhuān)利說(shuō)明】體外模擬胃腸消化制備綠鰭?cǎi)R面鈍魚(yú)皮抗氧化肽液的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)和蛋白利用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及利用體外模擬胃腸消化 制備魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 綠鰭?cǎi)R面飩，亦稱(chēng)馬面飩、馬面魚(yú)，因皮較厚且硬，少部分用于制造飼料魚(yú)粉，而大 部分在加工過(guò)程中被剝除丟棄，這不僅嚴(yán)重污染了環(huán)境，而且還造成資源的極大浪費(fèi)。馬面 魚(yú)皮中粗蛋白含量一般在40%以上，其氨基酸組成豐富。之前有報(bào)道稱(chēng)馬面魚(yú)皮不能食用， 目前對(duì)馬面魚(yú)皮的開(kāi)發(fā)利用主要有提取氨基酸、制膠、制革、提取食用水溶性蛋白質(zhì)，提取 魚(yú)皮膠原蛋白及其特性的研究。因此，研究馬面魚(yú)皮蛋白的抗氧化多肽具有可觀的現(xiàn)實(shí)意 義和經(jīng)濟(jì)意義。
[0003] 多肽是α-氨基酸以肽鍵連接而成的化合物，也是蛋白質(zhì)分解的中間體，通常分 子量在200Da到IOOOODa之間，能透過(guò)半透膜，不能被三氯乙酸及硫酸銨等沉淀。隨著人們 發(fā)現(xiàn)某些蛋白質(zhì)具有清除生物體內(nèi)過(guò)量游離基，抑制脂質(zhì)氧化作用后，肽的抗氧化性成為 一大熱點(diǎn)。抗氧化肽的制取方法主要有直接提取法、酸堿水解法、酶水解法、發(fā)酵法、化學(xué)合 成法和基因重組法。針對(duì)魚(yú)皮蛋白的結(jié)構(gòu)特性而言，現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝、方法依照設(shè)計(jì)流程主 要可分為兩類(lèi)： (1)將魚(yú)皮干燥、粉碎，采用蛋白酶水解制得蛋白多肽酶解液，最后進(jìn)行冷凍干燥獲 得多肽粉。直接相關(guān)的研究結(jié)果很少，就相關(guān)技術(shù)而言，例如：中國(guó)專(zhuān)利CN103431154A， CN102676621B中，直接以菜籽柏或者菜籽分離蛋白質(zhì)為原料，通過(guò)中性蛋白酶或堿性蛋白 酶法水解，獲得功能多肽。
[0004] (2)對(duì)魚(yú)皮進(jìn)行預(yù)處理，再接種微生物菌種，進(jìn)行發(fā)酵獲得多肽產(chǎn)品。類(lèi)似的相 關(guān)技術(shù)有：CN103436581A，CN101654696B中，采用濕法球磨（250-400r/min)聯(lián)合纖維素酶 (5-10μ g)預(yù)處理l-3h，接著中性蛋白酶酶解，得到粗制多肽溶液；另外有將菜籽柏粉與營(yíng) 養(yǎng)液混合制備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，微生物接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，固液分離，得到多肽的粗 提液。
[0005] 長(zhǎng)期以來(lái)，傳統(tǒng)的蛋白酶解法（中性蛋白酶或堿性蛋白酶）和微生物發(fā)酵法在制備 魚(yú)皮膠原蛋白多肽的工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮了很大作用。但由于單一酶酶解效率低，且為維 持最適酶解PH需在酶解過(guò)程中不斷添加堿液以維持恒定pH，酶解產(chǎn)物中存在大量鈉鹽，從 而不利于高血壓人群使用等缺點(diǎn)，使該方法存在一定的安全隱患。另外，微生物發(fā)酵法，主 要采用黑曲霉、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌或橙黃紅酵母等具有較高蛋白酶酶解活力、月旨 肪酶酶解活力、產(chǎn)酸能力的菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)多肽。該方法中，由于接種微生物的不穩(wěn)定性 和其他微生物的影響使得到的產(chǎn)品難以達(dá)到所需的功能性要求；另一方面，從發(fā)酵液中分 離多肽能耗高，廢液量大，產(chǎn)物復(fù)雜，安全性不高等缺點(diǎn)也使微生物發(fā)酵法不能得以很好利 用。
[0006] 隨著對(duì)環(huán)境保護(hù)，生產(chǎn)監(jiān)控及產(chǎn)品穩(wěn)定性等日趨規(guī)范及對(duì)蛋白資源利用水平要求 認(rèn)識(shí)的不斷重新定義和逐步提高，以上兩種方法的主要不足使得蛋白酶解工藝、方法在工 業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用前景不佳，將逐步被新的技術(shù)和理念所替代。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中由于單酶酶解效率不高，酶解反應(yīng)中不斷調(diào)節(jié) PH而大量使用NaOH，增大鹽濃度，酶解產(chǎn)物活性和多肽分子量關(guān)聯(lián)特征不夠清晰等問(wèn)題， 提供一種基于模擬人體胃腸消化體系，構(gòu)建極為安全的魚(yú)皮蛋白多肽制備方法。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)工藝與科學(xué)原理如下： 隨著馬面魚(yú)資源的積極開(kāi)發(fā)，它已成為我國(guó)主要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，魚(yú)皮資源相當(dāng)豐富， 使得多肽增值化利用成為其極有前途的方向，基于高效安全的胃腸消化模式，采用胃蛋白 酶、胰蛋白酶雙酶模擬胃腸消化體系，制備具有抗氧化特性且分子量分布明確的魚(yú)皮蛋白 多肽；本發(fā)明中的胃液消化體系和十二指腸液消化體系是模擬人體消化原理所構(gòu)筑的雙酶 分步反應(yīng)體系，模擬胃消化結(jié)束時(shí)未進(jìn)行滅酶處理，直接進(jìn)行模擬十二指腸液消化，有利于 充分酶解消化反應(yīng)；此外，消化結(jié)束時(shí)，進(jìn)行沸水浴終止反應(yīng)，離心獲取上清液后，調(diào)節(jié)PH 去除大分子蛋白，進(jìn)行二次離心，獲得精制的魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液。其優(yōu)點(diǎn)是：雙酶作用位 點(diǎn)更多，使得酶解效率更高；沸水浴和調(diào)節(jié)PH，2次離心能有效去除少量未被酶解的大分子 蛋白，使得所制備的多肽純度更高。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是創(chuàng)新性地采用雙酶體外模擬胃腸消化技術(shù)，提高酶解效率， 采用沸水浴變性蛋白酶和PH等電點(diǎn)沉淀蛋白技術(shù)，高效安全的酶解手段和簡(jiǎn)單可行的多 肽純化精制工藝集成創(chuàng)新，因此本發(fā)明中的方法較傳統(tǒng)方法更適合于大規(guī)模開(kāi)發(fā)魚(yú)皮蛋白 抗氧化肽液。
[0010] 本發(fā)明體外模擬胃腸消化制備魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液的方法，實(shí)施流程圖如圖1所 示，按照下述步驟進(jìn)行： (1)取烘干的魚(yú)皮，粉碎，獲得粗蛋白質(zhì)量百分含量為40%的魚(yú)皮蛋白原料。
[0011] (2)模擬胃腸消化體系： 模擬胃液(稱(chēng)取〇. 20g NaCl，0. 32g胃蛋白酶，7 mL蒸餾水，0. 7 mL 3mol/L鹽酸，鹽 酸調(diào)pH至L 2±0· 1，蒸饋水定容至100 mL。）， 模擬十二指腸液(稱(chēng)取〇. 70g磷酸二氫鉀溶于25 mL蒸餾水中，振蕩使之完全溶解，力口 入19 1^0.2111〇1/1恥0!1和40 1^蒸餾水，加入1.(^胰蛋白酶，用0.2111〇1/1恥0!1調(diào)口!1至 6. 4±0. 1，蒸餾水定容至100 mL。）溫度37°C，消化時(shí)間I h。
[0012] (3)在100 mL錐形瓶中加入25 mL模擬胃液，37°C恒溫水浴5min。加入一定質(zhì)量 的魚(yú)皮粉4-8%，迅速渦旋震蕩并快速置于37°C水浴，攪拌酶解4h。然后加入37°C恒溫水浴 5min的模擬十二指腸液175mL，調(diào)節(jié)pH至6. 4, 37°C恒溫條件下酶解lh。
[0013] (4)沸水浴1〇!1^11終止反應(yīng)；450〇17^11離心1〇1^11，取上清液調(diào)節(jié)？!1至4.2， 4500r/min離心30min去除大分子蛋白，獲得魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液。
[0014] 其中步驟（1)中的魚(yú)皮原料是指經(jīng)烘干、剪切、粉碎后的魚(yú)粉，且蛋白含量40%以 上。
[0015] 其中步驟（3)中模擬胃液和模擬十二指腸液消化反應(yīng)前都進(jìn)行了 37°C恒溫水浴 5min預(yù)熱處理。
[0016] 其中步驟（3)中模擬胃液消化4h后，未進(jìn)行胃蛋白酶滅酶處理，直接進(jìn)行模擬 十二指腸液消化Ih。
[0017] 其中步驟（4)進(jìn)行了沸水浴和調(diào)節(jié)pH兩種方法結(jié)合變性法和等電法沉淀蛋白，集 成2次離心法脫除大分子蛋白。
[0018] 其中步驟（4)中所得的魚(yú)皮蛋白多肽中含有分子量為2152Da、1352Da的多肽，兩 者可能與抗氧化活性相關(guān)。
[0019] 本發(fā)明的有益效果如下： (1) 本發(fā)明的制備方法采用胃蛋白酶、胰蛋白酶雙酶酶解反應(yīng)體系，極大地提高魚(yú)皮蛋 白水解效率，充分利用原料，使得廢棄液中的蛋白更少。
[0020] (2)本發(fā)明的制備方法是模擬胃腸消化過(guò)程，溫度在37°C，條件溫和，并未進(jìn)行常 規(guī)酶解中不斷添加 NaOH維持反應(yīng)在最適pH進(jìn)行，反應(yīng)過(guò)程更加綠色；另外，由于模擬最完 美的人體胃腸消化手段，在潛在食品安全方面，較微生物發(fā)酵更有優(yōu)勢(shì)。
[0021] (3)本發(fā)明的制備方法中沸水浴變性去蛋白和pH等電點(diǎn)沉淀蛋白技術(shù)，結(jié)合2次 離心分離手段，使得所制備的多肽含量更高，精制過(guò)程更加低碳節(jié)能、簡(jiǎn)便易行。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1是體外模擬胃腸消化制備魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液的工藝流程圖。
[0023] 圖2是標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白和多肽對(duì)照品色譜圖（A)，其中l(wèi)_67000Da ;2_12500Da ; 3_204Da ； 魚(yú)皮抗氧化肽液多肽分子量分布色譜圖（B)，l-2152Da ;2-1352Da ;3-190Da。
[0024] 圖3是游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（A)分析測(cè)試色譜圖，魚(yú)皮原料（B)和魚(yú)皮蛋白抗氧化 肽液（C)中游離氨基酸測(cè)試色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明采用液相色譜法、氨基酸分析儀、DPPH清除率、（V ·(超氧自由基）清除率 分別測(cè)定多肽液中肽分子量分布、游離氨基酸組成及含量、DPPH清除能力和(V ·(超氧自由 基）清除能力。
[0026] (1)膚分子量分布 色譜柱：TSKgel-G2000 SWxl(7. 8mmX 30cm，Tosoh);流動(dòng)相：0· lmol/L Na2S04+0. Imol/ L磷酸緩沖液（pH6. 7);柱溫30°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm ;流速：0. 5 mL/min ;進(jìn)樣量：10 μ L。 1260型安捷倫液相色譜儀(安捷倫科技貿(mào)易公司） (2) 游離氨基酸組成及含量 通過(guò)全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定游離氨基酸組分和含量。吸取不同消化時(shí)間的酶解液 0.1 mL于1.5 mL離心管中，加入0.9 mL 1%的磺基水楊酸，沉淀2h，10000rpm/min離心 15min，取上清液，用0. 22 μ m微膜(水膜)過(guò)濾至樣品瓶中，供上機(jī)測(cè)定，德國(guó)Sykam-433D全 自動(dòng)氨基酸分析儀（SYKAM公司）。
[0027] (3) DPPH 清除能力 2 11^0--!1溶液(在95%乙醇中的濃度為0.1臟〇1/1)與2 1^樣品溶液混合。混合物 在室溫下避光靜置30min，用VIS-7220N型可見(jiàn)分光光度計(jì)在517nm處測(cè)定吸光度。使用蒸 餾水代替樣品作為對(duì)照。j/w·清除率計(jì)算公式如下

【權(quán)利要求】
1. 體外模擬胃腸消化制備綠鰭?cǎi)R面飩魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液的方法，其特征在于按照下 述步驟進(jìn)行： (1) 取烘干的魚(yú)皮，粉碎，獲得粗蛋白質(zhì)量百分含量為40%的魚(yú)皮蛋白原料； (2) 模擬胃腸消化體系： 模擬胃液(稱(chēng)取〇. 20g NaCl，0. 32g胃蛋白酶，7 mL蒸餾水，0. 7 mL 3mol/L鹽酸，鹽 酸調(diào)pH至1. 2±0· 1，蒸饋水定容至100 mL ;)， 模擬十二指腸液(稱(chēng)取〇. 70g磷酸二氫鉀溶于25 mL蒸餾水中，振蕩使之完全溶解，力口 入19 mL 0.2mol/L NaOH和40 mL蒸餾水，加入l.Og胰蛋白酶，用0.2mol/L NaOH調(diào)pH至 6. 4±0. 1，蒸餾水定容至100 mL ;)溫度37°C，消化時(shí)間1 h ; (3) 在100 mL錐形瓶中加入25 mL模擬胃液，37°C恒溫水浴5min ; 加入一定質(zhì)量的魚(yú)皮粉4-8%，迅速渦旋震蕩并快速置于37°C水浴，攪拌酶解4h ; 然后加入37°C恒溫水浴5min的模擬十二指腸液175mL，調(diào)節(jié)pH至6. 4, 37°C恒溫條件 下酶解lh ; (4) 沸水浴10 min終止反應(yīng)；4500r/min離心lOmin，取上清液調(diào)節(jié)pH至4. 2,4500r/ min離心30min去除大分子蛋白，獲得魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外模擬胃腸消化制備綠鰭?cǎi)R面飩魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液的 方法，其特征在于其中步驟（1)中的魚(yú)皮原料是指經(jīng)烘干、剪切、粉碎后的魚(yú)粉，且蛋白含量 40%以上。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外模擬胃腸消化制備綠鰭?cǎi)R面飩魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液的 方法，其特征在于其中步驟（3)模擬胃液和模擬十二指腸液消化反應(yīng)前都進(jìn)行了 37°C恒溫 水浴5min預(yù)熱處理。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外模擬胃腸消化制備綠鰭?cǎi)R面飩魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液的 方法，其特征在于其中步驟（4)進(jìn)行了沸水浴和調(diào)節(jié)pH兩種方法結(jié)合變性法和等電法沉淀 蛋白，集成2次離心法脫除大分子蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外模擬胃腸消化制備綠鰭?cǎi)R面飩魚(yú)皮蛋白抗氧化肽液 的方法，其特征在于其中步驟（4)中所得的所得的魚(yú)皮蛋白多肽中含有分子量為2152Da、 1352Da的多肽。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104263789SQ201410515066
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】周存山, 馬海樂(lè), 余筱潔, 何榮海, 秦曉佩, 胡佳麗 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)