HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型的構(gòu)建方法，將保藏編號為CGMCC No.8753的HBV抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞HBV-CTL靜脈注射給HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，即構(gòu)建獲得HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型。研究表明，本發(fā)明構(gòu)建的肝炎小鼠動物模型克服了HBV病毒種屬特異性，HBV-CTLs可模擬生理狀態(tài)下肝炎病毒感染后所介導(dǎo)的肝組織損傷，并可通過回輸腫瘤誘導(dǎo)的MDSCs降低肝組織受損程度。本發(fā)明在建立肝炎小鼠動物模型的基礎(chǔ)上提出了新的治療肝炎的策略，為肝炎的治療提供了新的思路。
CGMCC NO.8753
2014.01.07

CGMCC NO.8754
2014.01.07
【專利說明】HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，涉及一種HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型的構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002]慢性肝炎(chronic hepatitis)是威脅人類健康的最常見疾病之一,多種因素如慢性病毒感染，過量酒精攝入，代謝性疾病及機(jī)體免疫紊亂，均可導(dǎo)致長期慢性肝組織損傷，造成肝臟組織病變，甚至發(fā)生慢加急性肝炎及原發(fā)性肝癌。在歐美等國，慢性肝炎主要由過量酒精攝入引起，如60%以上的肝硬化及肝癌患者就有酒精性肝病病史。而在中國，慢性病毒感染是慢性肝炎及肝硬化、肝癌的最主要病因，其中主要包括乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染。病毒性肝炎是造成慢性肝組織損傷、慢性及慢加急性肝衰竭最終導(dǎo)致患者死亡的重要原因。截至目前，針對病毒感染的治療取得了很大進(jìn)步，但由于存在病毒基因突變，服藥周期長，患者不能耐受藥物副作用等諸多問題，慢性肝炎的治療依然任重而道遠(yuǎn)。
[0003]肝炎病毒感染機(jī)體后，一方面引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對病毒的免疫應(yīng)答，主要是細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)、輔助性CD4+T細(xì)胞及天然免疫系統(tǒng)的參與，消滅病毒感染的細(xì)胞，同時(shí)也造成肝組織損傷。因此，免疫介導(dǎo)的肝損傷是病毒性肝炎造成肝損傷的主要發(fā)病機(jī)制；同時(shí)由于肝炎病毒的種屬限制，模擬生理狀態(tài)下病毒感染造成的免疫介導(dǎo)的肝損傷動物模型亦很有限。前期研究報(bào)道，將HBV病毒DNA導(dǎo)入⑶8+T細(xì)胞中，得到CTLs，并將攜帶HBV的CTLs注射小鼠，得到了肝炎小鼠動物模型，其突破了 HBV病毒的種屬限制，但也存在局限性，如需要反復(fù)多次CTLs注射，且肝組織損傷有一定的自限性。目前最常用的肝炎動物模型之一，即注射刀豆蛋白(ConA)誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型。刀豆蛋白可誘導(dǎo)T細(xì)胞異常活化，造成肝組織損傷，但刀豆蛋白誘導(dǎo)的肝損傷屬于抗原非特異性，且具有劑量依賴性，主要是活化的CD4+T細(xì)胞的參與，并可造成多臟器損傷。另外一些研究嘗試給動物動態(tài)注射攜帶有病毒基因的腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒重組載體，以建立病毒感染的肝炎模型，缺點(diǎn)是病毒易發(fā)生突變，并受病毒和宿主等各方面的影響。
[0004]慢性病毒感染導(dǎo)致肝組織受損，長期的慢性肝炎是肝功能逐漸減退、肝硬化，并最終部分發(fā)展為原發(fā)性肝癌(HCC)的重要原因。因此如何最大限度地保護(hù)肝功能是目前亟待解決另一難題。肝臟除了是重要的代謝器官，也是最重要的免疫器官之一。肝臟是天然的免疫耐受器官，有大量的免疫細(xì)胞分布，如淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞(庫弗細(xì)胞)、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及髓源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs),這些免疫細(xì)胞在維持肝臟局部免疫耐受中發(fā)揮重要作用。隨著免疫學(xué)認(rèn)識的深入，MDSCs在感染性疾病及自身免疫病中的作用受到極大重視。
[0005]MDSCs是骨髓來源的具有免疫抑制功能的未成熟細(xì)胞亞群，具有高度異質(zhì)性，最早在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，因其具有抑制針對腫瘤的免疫應(yīng)答效應(yīng)，被稱為髓源抑制性細(xì)胞。根據(jù)其形態(tài)及表面分子的表達(dá)分為不同細(xì)胞亞群，主要包括單核樣-MDSCsOnonocytic-MDSCs，M-MDSCs)和粒細(xì)胞樣-MDSCs (granulocytic-MDSCs，Gr-MDSCs)及少量的樹突狀細(xì)胞和髓系前體細(xì)胞。MDSCs參與免疫系統(tǒng)的負(fù)性調(diào)控，在生理和病理狀態(tài)下發(fā)揮重要作用。在小鼠中，MDSCs以共表達(dá)Gr-1和⑶IIb為識別標(biāo)記，在多種疾病模型中均有研究。MDSCs通過免疫抑制作用，在荷瘤動物、感染性疾病、炎癥性腸病、器官移植等多種疾病模型中均起到重要作用。大量體內(nèi)及體外研究表明，MDSCs可通過多種途徑發(fā)揮作用，如MDSCs釋放精氨酸酶-1 (Arg-1)抑制T細(xì)胞的活化，MDSCs可下調(diào)T細(xì)胞表面⑶62L的表達(dá)，從而影響效應(yīng)T細(xì)胞向腫瘤部位的遷移；MDSC亦可通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)數(shù)量的增加發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，MDSCs還可通過誘導(dǎo)I3D-Ll的表達(dá)上調(diào)參與負(fù)性免疫調(diào)控，提示MDSCs免疫抑制作用并非抗原特異性。以上所述MDSCs的負(fù)性調(diào)控作用在免疫介導(dǎo)組織損傷或自身免疫病中亦有異曲同工的作用。如有研究表明，MDSCs在抗原特異性CTLs介導(dǎo)炎癥性腸病(IBD)中有抑制免疫細(xì)胞活化，減輕腸壁組織損傷的作用。課題組的前期研究亦顯示:肝臟MDSCs數(shù)量增加及外源給予MDSCs均有助于減輕ConA誘導(dǎo)的自身反應(yīng)性肝炎小鼠肝組織損傷程度，降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平。最新一項(xiàng)關(guān)于ConA誘導(dǎo)的自身反應(yīng)性肝炎小鼠治療的研究顯示:α 4整合素抗體使ConA誘導(dǎo)的小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高，可能與α 4整合素抗體使肝炎小鼠肝臟內(nèi)MDSCs數(shù)量減少有關(guān)，MDSCs數(shù)量減少，Treg活化也受阻，肝臟效應(yīng)T細(xì)胞過度活化，最終造成肝組織損傷加重，提示MDSCs在肝臟內(nèi)發(fā)揮免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供MDSCs在制備用于治療肝炎病毒感染所介導(dǎo)的肝組織損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型的構(gòu)建方法，將保藏編號為CGMCC N0.8753的HBV抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞HBV-CTL靜脈注射給HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，即構(gòu)建獲得HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型。
[0009]具體地，給每只小鼠靜脈注射I X 17個(gè)HBV-CTL細(xì)胞，小鼠選用6_8周齡、雌性、體重為18-20g的HBV轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠。
[0010]本發(fā)明中涉及的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法為:
[0011]將純化的高表達(dá)1.3拷貝HBV全基因的表達(dá)質(zhì)粒(質(zhì)粒構(gòu)建方法參見GuidottiLG, et al.，1995)通過原核細(xì)胞顯微注射的方法，將病毒基因組導(dǎo)入BALB/c小鼠受精卵中，建立近交系高表達(dá)HBV轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠，進(jìn)一步通過回交傳代、并對后代小鼠血清中HBsAg進(jìn)行定性和定量檢測，篩選出持續(xù)高表達(dá)HBV基因并可穩(wěn)定傳代的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。參見劉光澤，熊一力，王洪敏，賈彥征，周軍輝，etal.近交系高表達(dá)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及表達(dá)傳代穩(wěn)定性.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)2003:580-582 ;劉光澤.復(fù)制型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的建立、生物學(xué)特性、應(yīng)用及無免疫耐受研究:第一軍醫(yī)大學(xué)；2007 ;孔祥平，吳慶洲，羅顯榮，胡蓮美，李秀梅，et al.復(fù)制型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠遺傳穩(wěn)定性研究.中國生物工程雜志2008:17-21 等。
[0012]本發(fā)明還提供一種HBV抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞HBV-CTL，現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC N0.8753，保藏日期2014年I月7日。
[0013]本發(fā)明還提供細(xì)胞HBV-CTL在構(gòu)建HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明還提供根據(jù)上述方法構(gòu)建的HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型在篩選用于治療肝炎病毒感染所介導(dǎo)的肝組織損傷疾病的藥物或化合物中的應(yīng)用。將待測藥物或化合物靜脈注射給HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠，篩選得到可減輕肝炎小鼠肝組織損傷程度或癥狀的藥物或化合物。
[0015]本發(fā)明還提供荷瘤小鼠骨髓來源抑制性細(xì)胞MDSC，現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC N0.8754，保藏日期2014年I月7日。
[0016]本發(fā)明進(jìn)一步提供細(xì)胞MDSC在制備用于治療肝炎病毒感染所介導(dǎo)的肝組織損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。所述肝炎病毒為HBV。
[0017]鑒于HBV病毒感染的種屬特異性，本發(fā)明選擇了穩(wěn)定的、高復(fù)制型的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠及同品系的普通BALB/c小鼠，用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟勻漿誘導(dǎo)普通BALB/c小鼠產(chǎn)生針對 HBV 抗原特異性的 CTL (HBV-specific CTLs, HBV-CTLs)，并將 HBV-CTLs 回輸給 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠，模擬HBV病毒感染人類后造成人體肝組織損傷的病理過程(由于HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞表面有HBV病毒相關(guān)抗原的表達(dá)，因此利用分離得到的普通小鼠脾臟來源的HBV-CTLs，靜脈回輸給HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，并在回輸后不同時(shí)間點(diǎn)取血，根據(jù)測得的小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT/AST水平以評估小鼠肝組織損傷程度)，最終建立了 HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型。由于HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠的致病機(jī)制類似于HBV感染后免疫介導(dǎo)的肝損傷，因此該動物模型可用于病毒感染相關(guān)肝炎的發(fā)病機(jī)制及治療的研究。
[0018]前期研究顯示，腫瘤誘導(dǎo)的MDSCs向肝臟大量聚集，而到達(dá)肝臟的MDSCs具有負(fù)性免疫調(diào)控作用，而MDSCs在肝炎小鼠肝臟是否可以發(fā)揮免疫抑制作用成為關(guān)注的焦點(diǎn)。研究顯示，將腫瘤誘導(dǎo)MDSCs與HBV-CTLs同時(shí)注射給HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，則肝組織損傷程度可顯著減輕，而單獨(dú)注射HBV-CTLs的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織受損、血清轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高，提示MDSCs可能通過抑制CTLs的活化進(jìn)而降低肝組織損傷程度，MDSCs可參與維持肝臟免疫耐受，MDSCs可作為肝炎新的治療手段。
[0019]本發(fā)明提供了一種研究免疫介導(dǎo)肝損傷的肝炎小鼠模型，并利用髓源抑制細(xì)胞對肝炎小鼠進(jìn)行治療。研究表明，HBV抗原特異性CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠動物模型克服了 HBV病毒種屬特異性，HBV-CTLs可模擬生理狀態(tài)下肝炎病毒感染后所介導(dǎo)的肝組織損傷，并可通過回輸腫瘤誘導(dǎo)的MDSCs降低肝組織受損程度。本發(fā)明在建立肝炎小鼠動物模型的基礎(chǔ)上提出了新的治療肝炎的策略，為肝炎的治療提供了新的思路。
[0020]本發(fā)明將腫瘤誘導(dǎo)的MDSCs用于HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝損傷的治療，通過靜脈回輸?shù)姆绞剑瑢⒑闪鲂∈髞碓吹腗DSCs給予HBV肝炎小鼠，回輸后測小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平，發(fā)現(xiàn)MDSCs可顯著降低肝炎小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平和肝組織損傷程度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟勻漿致敏普通小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生HBV-CTLs的流程圖。
[0022]圖2為本發(fā)明建立HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型及MDSCs回輸流程圖。
[0023]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型中血清轉(zhuǎn)氨酶水平變化。
[0024]圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中流式分選MDSCs的純度鑒定結(jié)果。
[0025]圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中MDSCs回輸后降低肝炎小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平。

【具體實(shí)施方式】
[0026]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0027]以下實(shí)施例中使用的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法參見劉光澤，熊一力，王洪敏，賈彥征，周軍輝，et al.近交系高表達(dá)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及表達(dá)傳代穩(wěn)定性.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)2003:580-582 ;劉光澤.復(fù)制型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的建立、生物學(xué)特性、應(yīng)用及無免疫耐受研究:第一軍醫(yī)大學(xué)；2007 ;孔祥平，吳慶洲，羅顯榮，胡蓮美，李秀梅，et al.復(fù)制型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠遺傳穩(wěn)定性研究.中國生物工程雜志2008:17-21等。
[0028]實(shí)施例1 HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型及其構(gòu)建方法
[0029]HBV-CTLs可誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織損傷:
[0030]致敏小鼠在接受HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟勻漿注射后，觀察到小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST水平均有一過性升高，并且在連續(xù)多次刺激后致敏小鼠脾臟體積顯著增大。分離HBV-CTLs (保藏編號CGMCC N0.8753)靜脈注射給HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。圖3結(jié)果顯示:CTLs注射后，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中ALT、AST水平顯著升高；與注射HBV-CTLs的小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平相比，將普通BALB/c小鼠脾臟來源CTLs，靜脈注射給HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，血清中ALT、AST無顯著變化。多次連續(xù)注射HBV-CTLs后，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT和AST水平持續(xù)上升，提示肝臟病損程度逐漸加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。
[0031]圖1為HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟勻漿致敏普通小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生HBV-CTLs的流程圖。
[0032]實(shí)施例2腫瘤誘導(dǎo)的MDSCs的制備、分離和純化
[0033]首先將H22肝細(xì)胞癌細(xì)胞系皮下注射給普通BALB/c小鼠，4X 15/只，建立肝癌移植瘤模型。隔天觀察瘤體大小，2周后，待腫瘤直徑達(dá)Icm以上時(shí)，將小鼠麻醉、處死，取股骨骨髓，利用磁性分選系統(tǒng)(加拿大stem cell公司)分選CDllb+髓系細(xì)胞，得到的細(xì)胞標(biāo)記流式抗體，用流式分選技術(shù)進(jìn)一步純化MD S C s，得到純度達(dá)9 5 %左右的Gr-1+CDllb+MDSCs (圖 4，保藏編號 CGMCC N0.8753)，備用。
[0034]實(shí)施例3 MDSCs過繼回輸可減輕HBV肝炎小鼠中肝臟損傷
[0035]MDSCs具有抗原非特異性和特異性的免疫抑制作用，在誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受中發(fā)揮重要作用。對實(shí)施例2中分離出的荷瘤小鼠骨髓來源的MDSCs進(jìn)行純化，按5X 16MDSCs/只靜脈回輸給實(shí)施例1中的肝炎小鼠，對照組注射等量PBS，24h后測小鼠血清ALT、AST水平。圖5結(jié)果顯示，靜脈回輸MDSCs后，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT、AST水平較未注射MDSCs組小鼠顯著降低(P〈0.05)。
[0036]圖2為本發(fā)明中建立HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型及MDSCs回輸流程圖。
[0037]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0038]參考文獻(xiàn)
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【權(quán)利要求】
1.HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，將保藏編號為CGMCCN0.8753的HBV抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞HBV-CTL靜脈注射給HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，即構(gòu)建獲得HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，給每只小鼠靜脈注射IX 17個(gè)HBV-CTL細(xì)胞，小鼠選用6-8周齡、雌性、體重為18-20g的HBV轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法為:將純化的高表達(dá)1.3拷貝HBV全基因的表達(dá)質(zhì)粒通過原核細(xì)胞顯微注射的方法，將病毒基因組導(dǎo)入BALB/c小鼠受精卵中，建立近交系高表達(dá)HBV轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠，進(jìn)一步通過回交傳代、并對后代小鼠血清中HBsAg進(jìn)行定性和定量檢測，篩選出持續(xù)高表達(dá)HBV基因并可穩(wěn)定傳代的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。
4.HBV抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞HBV-CTL，其保藏編號為CGMCC N0.8753。
5.權(quán)利要求4所述細(xì)胞HBV-CTL在構(gòu)建HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述方法構(gòu)建的HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型在篩選用于治療肝炎病毒感染所介導(dǎo)的肝組織損傷疾病的藥物或化合物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，將待測藥物或化合物靜脈注射給HBV-CTLs誘導(dǎo)的肝炎小鼠，篩選得到可減輕肝炎小鼠肝組織損傷程度或癥狀的藥物或化合物。
8.荷瘤小鼠骨髓來源抑制性細(xì)胞MDSC，其保藏編號為CGMCCN0.8754。
9.權(quán)利要求8所述細(xì)胞MDSC在制備用于治療肝炎病毒感染所介導(dǎo)的肝組織損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述肝炎病毒為HBV。
【文檔編號】C12N15/89GK104232688SQ201410336626
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】張恒輝, 陳紅松, 賀改霞, 張明徽, 陳棟偉 申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院, 清華大學(xué)