專(zhuān)利名稱(chēng)：一種構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哮喘動(dòng)物模型構(gòu)建領(lǐng)域，特別涉及一種構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法。
背景技術(shù)：
支氣管哮喘是一種氣道慢性非特異性炎癥，全球患病人數(shù)多，控制哮喘發(fā)作需花費(fèi)大量人力物力。為盡最大可能解除患者痛苦，構(gòu)建疾病動(dòng)物模型，研究哮喘的發(fā)病機(jī)制十分必要。以往認(rèn)為過(guò)敏原誘導(dǎo)Thl/Th2應(yīng)答失衡致氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是哮喘的重要病理特點(diǎn)，此類(lèi)患者對(duì)激素治療效果敏感?，F(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建的模型也多以致嗜酸性粒細(xì)胞升高為主。此類(lèi)模型常用構(gòu)建方法為分別在第I大和第14天腹腔注射雞卵蛋白致敏，在第28、29,30連續(xù)3天，每天30分鐘-I小時(shí)I %卵蛋白液霧化激發(fā)，第32天處死，收集相關(guān)標(biāo)本。
然而，人們發(fā)現(xiàn)一類(lèi)患者使用激素治療效果不佳，癥狀得不到有效控制。研究發(fā)現(xiàn)，此類(lèi)患者氣道炎癥以中性粒細(xì)胞為主，嗜酸性粒細(xì)胞輕度增高甚至不增高；外周血除了Th2細(xì)胞的增高，還有Thl7細(xì)胞的增高，且增加的幅度更大；相應(yīng)細(xì)胞因子IL-4/IL-17的ELISA結(jié)果也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)。據(jù)此提出靜息型T細(xì)胞在接收樹(shù)突狀細(xì)胞處理、提呈的相關(guān)抗原刺激后向Thl7細(xì)胞方向偏振，誘導(dǎo)哮喘患者氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞募集?，F(xiàn)有技術(shù)雖能成功構(gòu)建相關(guān)哮喘模型，但共有三次致敏，分別在第0、7、14天，在第21天激發(fā)，連續(xù)兩周，建模時(shí)間較長(zhǎng)，且鼻內(nèi)滴入脂多糖量過(guò)大，不能排除氣道損傷引起中性粒細(xì)胞增多的可能，不符合哮喘是以過(guò)敏原誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答失衡的發(fā)病機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，從哮喘的疾病特點(diǎn)對(duì)模型進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)，縮短激發(fā)和致敏時(shí)間。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案一種構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，其特征在于，包括步驟一、在第I天和第7天向非人哺乳動(dòng)物腹腔注射有效量的含雞卵蛋白和氫氧化鋁凝膠的PBS溶液，同時(shí)從非人哺乳動(dòng)物咽喉壁緩慢滴加有效量的含雞卵蛋白和脂多糖的PBS溶液；步驟二、從第13天到第15大連續(xù)三天霧化含雞卵蛋白的PBS溶液，對(duì)非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行抗原的呼吸道致敏。優(yōu)選的是，所述構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法中，同時(shí)構(gòu)建的模型還包括只在腹腔注射等量的含雞卵蛋白和氫氧化鋁凝膠的PBS溶液的嗜酸性粒細(xì)胞哮喘模型組以及在腹腔注射等量的含氫氧化鋁凝膠的PBS溶液的正常對(duì)照組，前者為含雞卵蛋白的PBS溶液激發(fā)，后者為PBS溶液激發(fā)。優(yōu)選的是，所述構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法中，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠。
優(yōu)選的是，所述構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法中，從小鼠咽喉壁滴加含100 μ g雞卵蛋白和O. I μ g含脂多糖的PBS溶液，共50 μ L，使小鼠慢慢將PBS溶液吸入肺部，滴加時(shí)用移液槍分次吸取滴加，每次10 μ L ;向腹腔注射含100 μ g雞卵蛋白和100 μ L氫氧化鋁凝膠的PBS溶液，共200 μ L。優(yōu)選的是，所述構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法中，所述步驟2)中的霧化用的含雞卵蛋白的PBS溶液濃度為I %。優(yōu)選的是，所述構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法中，麻醉小鼠的麻醉劑為濃度4%水合氯醛，劑量為O. 08 O. lml/10g。本發(fā)明實(shí)施例所提供的技術(shù)方案，加入了以前從未使用過(guò)的氣道致敏方法，即從小鼠咽喉壁將含雞卵蛋白和脂多糖的PBS溶液緩慢滴入氣道，且有效地控制了用量，排除了氣道損傷引起中性粒細(xì)胞增多的可能，符合哮喘是以過(guò)敏原誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答失衡的發(fā)病機(jī)制。本發(fā)明在最后一次抗原激發(fā)24小時(shí)后，處死小鼠，并從血清IgE水平、氣道高反應(yīng) 性、浸潤(rùn)到氣道中炎癥細(xì)胞的類(lèi)型及數(shù)量和肺組織效應(yīng)T細(xì)胞偏振情況等方面將此模型與嗜酸性粒細(xì)胞哮喘模型組和正常對(duì)照組模型進(jìn)行了對(duì)比評(píng)價(jià)，因Thl7細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)致使氣道中性粒細(xì)胞增高的非人哺乳動(dòng)物哮喘模型構(gòu)建成功。


圖I為本發(fā)明所述的構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法的流程示意圖；圖2為各組小鼠肺組織氣道炎癥情況(HE，X 200)，A圖為正常對(duì)照組，B圖為嗜酸性粒細(xì)胞哮喘模型組，C圖為中性粒細(xì)胞哮喘模型組；
具體實(shí)施例方式為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要的附圖作簡(jiǎn)單的介紹。本發(fā)明提供了一種構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，排除了氣道損傷引起中性粒細(xì)胞增多的可能，縮短了激發(fā)和致敏時(shí)間。本發(fā)明實(shí)施例提供的一種構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，包括步驟一、在第I天和第7天向非人哺乳動(dòng)物腹腔注射有效量的含雞卵蛋白和氫氧化鋁凝膠的PBS溶液，同時(shí)從非人哺乳動(dòng)物咽喉壁緩慢滴加有效量的含雞卵蛋白和脂多糖的PBS溶液；步驟二、從第13天到第15大連續(xù)三大霧化含雞卵蛋白的PBS溶液，對(duì)非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行抗原的呼吸道致敏。本方法的具體實(shí)施步驟為將實(shí)驗(yàn)所需BALB/c小鼠稱(chēng)重，并用麻醉劑麻醉小鼠；將小鼠四肢用活結(jié)固定于簡(jiǎn)易操作臺(tái)上，并套牙固定小鼠頸部；將操作臺(tái)豎立，用消毒后的無(wú)菌平鑷夾出小鼠舌頭，使其歪向一側(cè)，充分暴露口腔；在第I天和第7天從小鼠咽喉壁緩慢滴加含100 μ g雞卵蛋白和O. I μ脂多糖的PBS溶液，共50 μ L，使小鼠慢慢將PBS溶液吸入肺部；將小鼠腹外側(cè)部消毒后，在第I天和第7天向腹腔注射含100 μ g雞卵蛋白和100 μ L氫氧化鋁凝膠的PBS溶液，共200 μ L ;將小鼠放回鼠籠中，側(cè)臥，同時(shí)刨除小鼠口鼻周?chē)鷫|料，防止堵塞呼吸道窒息；將小鼠放入密閉容器中，從第13天到第15天連續(xù)三天用霧化儀霧化含雞卵蛋白的PBS溶液。所述的構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，同時(shí)構(gòu)建的模型還包括只在腹腔注射等量的含雞卵蛋白和氫氧化鋁凝膠的PBS溶液的嗜酸性粒細(xì)胞哮喘模型組以及在腹腔注射等量的含氫氧化鋁凝膠的PBS溶液的正常對(duì)照組，前者為含雞卵蛋白的PBS溶液激發(fā)，后者為PBS溶液激發(fā)。所述的構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠。所述的構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，從小鼠咽喉壁滴加含100 μ g雞卵蛋白和O. I μ g脂多糖的PBS溶液，共50 μ L，使小鼠慢慢將PBS溶液吸入肺部，滴加時(shí)用移液槍分次吸取滴加，每次10 μ L ;向腹腔注射含100 μ g雞卵蛋白和100 μ L氫氧化鋁凝膠的PBS 溶液，共 200 μ L。 所述的構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，所述步驟2)中的霧化用的含雞卵蛋白的PBS溶液濃度為I %。所述的構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，麻醉小鼠的麻醉劑為濃度4%水合氯醛，劑量為O. 08 O. lml/10g。在最后一次抗原攻擊24小時(shí)后，處死小鼠，檢測(cè)其血清IgE水平、氣道高反應(yīng)性、浸潤(rùn)到氣道中炎癥細(xì)胞的類(lèi)型及數(shù)量和肺組織效應(yīng)T細(xì)胞偏振情況等方面情況。表I為各組模型的血清ELISA結(jié)果、灌洗液相關(guān)細(xì)胞因子濃度比較，其中，Thl細(xì)胞分泌的特異細(xì)胞因子為IFN-Y，Th2細(xì)胞分泌的特異細(xì)胞因子為IL-5，Thl7細(xì)胞分泌的特異細(xì)胞因子為IL-17。反應(yīng)中性粒細(xì)胞炎癥程度的炎癥因子為T(mén)NF-a和IL_8。本方法構(gòu)建的非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的炎癥細(xì)胞中性粒細(xì)胞顯著增高，且具有較高的雞卵蛋白相關(guān)性血清IgE水平。表I血清ELISA結(jié)果、灌洗液相關(guān)細(xì)胞因子濃度比較
組別IFN r IL-5 IL-17 雞卵蛋白-IgE TNF-a IL-8
ιΚ常對(duì)照組低于不限 1.75 5.94 低于下限 49.47 低于下限 嗜酸性粒模型組 444.17 3.53 42 U52.0562 49 隊(duì)T下限
屮性粒模型組 1042.4 7.752 56.1610.51 296.39 36.08表2為各組肺功能Penh值增長(zhǎng)倍數(shù)比較，分5個(gè)乙酰膽堿濃度測(cè)定Penh值，并與正常對(duì)照組比較計(jì)算增長(zhǎng)倍數(shù)[R(測(cè))-R(基)]/R(基)。與嗜酸性粒細(xì)胞哮喘模型組比較，中性粒細(xì)胞哮喘模型組在濃度12mg/mL已有顯著的氣道高反應(yīng)性，在濃度25mg/mL時(shí)氣道高反應(yīng)性更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表2各組肺功能Penh值增長(zhǎng)倍數(shù)比較(η = 12, χ ±s )
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，其特征在于，包括 步驟一、在第I天和第7天向非人哺乳動(dòng)物腹腔注射有效量的含雞卵蛋白和氫氧化鋁凝膠的PBS溶液，同時(shí)從非人哺乳動(dòng)物咽喉壁緩慢滴加有效量的含雞卵蛋白和脂多糖的PBS溶液； 步驟二、從第13天到第15天連續(xù)三天霧化含雞卵蛋白的PBS溶液，對(duì)非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行抗原的呼吸道致敏。
2.如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，其特征在于，同時(shí)構(gòu)建的模型還包括只在腹腔注射等量的含雞卵蛋白和氫氧化鋁凝膠的PBS溶液的嗜酸性粒細(xì)胞哮喘模型組以及在腹腔注射等量的含氫氧化鋁凝膠的PBS溶液的正常對(duì)照組，前者為含雞卵蛋白的PBS溶液激發(fā)，后者為PBS溶液激發(fā)。
3.如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠。
4.如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，其特征在于，從小鼠咽喉壁滴加含100 μ g雞卵蛋白和O. I μ g脂多糖的PBS溶液，共50 μ L，使小鼠慢慢將PBS溶液吸入肺部，滴加時(shí)用移液槍分次吸取滴加，每次10 μ L ;向腹腔注射含100 μ g雞卵蛋白和100 μ L氫氧化鋁凝膠的PBS溶液，共200 μ L。
5.如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，其特征在于，所述步驟2)中的霧化用的含雞卵蛋白的PBS溶液濃度為I %。
6.如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，其特征在于，麻醉小鼠的麻醉劑為濃度4%水合氯醛，劑量為O. 08 O. lml/10go
全文摘要
本發(fā)明提供了一種構(gòu)建非人哺乳動(dòng)物哮喘模型的方法，包括步驟一、在第1天和第7天向非人哺乳動(dòng)物腹腔注射有效量的含雞卵蛋白和氫氧化鋁凝膠的PBS溶液，同時(shí)從非人哺乳動(dòng)物咽喉壁緩慢滴加有效量的含雞卵蛋白和脂多糖的PBS溶液；步驟二、從第13天到第15天連續(xù)三天霧化含雞卵蛋白的PBS溶液，對(duì)非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行抗原的呼吸道致敏。上述方法成功構(gòu)建了氣道以中性粒細(xì)胞增高的非人哺乳動(dòng)物的哮喘模型，排除了氣道損傷引起中性粒細(xì)胞增多的可能，縮短了建模時(shí)間。
文檔編號(hào)A61K38/38GK102895657SQ20121039032
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者程曉明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院