一株l-鳥氨酸合成菌的構建及其應用方法
【專利摘要】本發(fā)明敲除鈍齒棒桿菌(Corynebacteriumcrenatum)SYPA5-5中編碼鳥氨酸乙酰轉移酶(Ornithinecarbamoyltransferase，OTC)的argF基因，對獲得的重組菌株進行發(fā)酵產L-鳥氨酸的研究，屬于生物【技術領域】。首先，構建argF基因內缺失片段(△argF)，連接至pK18mobsacB中獲得重組質粒pK18mobsacB△argF，將其電轉入SYPA5-5中，經兩次同源重組，篩選獲得重組菌株SYPA5-5△argF。其次，考察不同營養(yǎng)條件對重組菌株生長及L-鳥氨酸積累的影響，發(fā)現(xiàn)添加0.3g/LL-精氨酸可滿足SYPA5-5△argF的生長及L-鳥氨酸積累所需，利用糖質原料，發(fā)酵96h，L-鳥氨酸產量可達21.5g/L，糖酸轉化效率為0.17g(L-ornithine)/g(glucose)。
【專利說明】一株L-鳥氨酸合成菌的構建及其應用方法
【技術領域】
[0001]敲除純齒棒桿菌iCorynebacteriumcrenatundSWkf^中編碼鳥氨酸乙酸轉移酶(Ornithine carbamoyl transferase, 0TC)的基因，并對獲得的重組菌株進行發(fā)酵產L-鳥氨酸的研究，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]L-鳥氨酸(L-ornithine)為非蛋白質氨基酸，是尿素循環(huán)的重要中間代謝產物，因具有重要的生理功能而廣泛應用于食品、醫(yī)藥及化工領域。微生物發(fā)酵法有節(jié)能環(huán)保、易提取分離等優(yōu)點，具有重要的工業(yè)化應用價值。
[0003]實現(xiàn)微生物發(fā)酵法生產氨基酸的關鍵在于高產菌株的選育。代謝工程作為理性育種的技術手段被廣泛應用于工業(yè)微生物的改造。目前，該技術已應用于L-鳥氨酸高產菌株的構建。Lee YJ 等構建的大腸桿菌 W3110 ( AargF AargR Apro^ Δ speV, ParaB-ar^-214)在添加谷氨酸的條件下發(fā)酵，可積累13.2 mg/g (dry cell weight) L-鳥氨酸；Jiang LY等構建的谷氨酸棒桿菌ATCC13032 ( Δ argV Δ argR ΔproV> Δ spe^)，經生長偶聯(lián)的菌株馴養(yǎng)后，可積累17.2 g/L L-鳥氨酸。但上述L-鳥氨酸生產菌株仍存在產量不高或攜帶外源質粒等問題，限制了其工業(yè)化應用。
[0004]純齒棒桿菌SYPA5-5是本研究室經過多級誘變篩選獲得的一株L-精氨酸高產菌株，利用葡萄糖為碳源，搖瓶發(fā)酵96 h可積累約30 g/L L-精氨酸。L-精氨酸的生物合成是以L-谷氨酸為前體，先通過5步酶促反應生成L-鳥氨酸；再經鳥氨酸氨甲酰轉移酶( Ornithine carbamoyltransferase,0TC)將L-鳥氨酸轉化為L-瓜氨酸；最后，在精胺琥拍酸合成酶(Argininosuccinate synthase, ASS)和精胺琥拍酸裂解酶(Argininosuccinase,ASL)催化下合成L-精氨酸。前期研究表明，SYPA5-5發(fā)酵生產L-精氨酸的過程中，中間代謝物L-鳥氨酸的積累量較低。本研究以SYPA5-5為出發(fā)菌株，敲除其編碼鳥氨酸氨甲酰轉移酶的基因阻斷L-鳥氨酸進一步合成L-精氨酸的途徑，構建了能夠積累L-鳥氨酸的重組菌株SYPA5-5 Λ ar^F，并研究了其發(fā)酵性能，為實現(xiàn)采用糖質原料直接發(fā)酵生產上述氨基酸奠定了基礎。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供合成L-鳥氨酸的鈍齒棒桿菌iCorynebacterium crena turn)SYPA5-5 的構建及發(fā)酵生產L-鳥氨酸的方法。該菌株是利用SYPA5-5為出發(fā)菌株，以自殺質粒pK18mohsacB對其基因進行敲除后獲得,在添加300 mM L-精氨酸條件下，利用糖質原料發(fā)酵96 h，積累21.5 g/L L-鳥氨酸，該菌株已經保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存號為CGMCCN0.8637，保存日期為2013年12月25日。本發(fā)明提供的方法屬于基金項目:國家863資助項目(N0.2012AA022102)的研究內容。具體發(fā)明方案如下:
1.重組菌株SYPA5-5 Δ argV的構建以SYPA5-5基因組DNA為模板，分別以F1/F2、F3/F4為引物，擴增argF上、下游片段，通過crossover PCR擴增獲得基因內缺失片段(Λ ar^F)。將獲得的Λ 連入pK18mohsacB質粒得到重組質粒pK18mohsacB arg?。將重組質粒電轉化入SYPA5-5感受態(tài)細胞中，經兩次同源重組，對獲取的轉化子，提取基因組，進行PCR擴增并送至上海生工測序。
[0006]引物序列如下:
【權利要求】
1.構建一株利用糖質原料發(fā)酵大量積累L-鳥氨酸的菌株的方法，其特征為:出發(fā)菌株分類命名為純齒棒桿菌iCorynebacterium crenaturn) SYPA5-5 I^arg?,已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌株保存號為CGMCC N0.8637，保存日期為2013年12月25日。
2.權利要求1中所述的方法，其特征為:利用高產L-精氨酸的鈍齒棒桿菌{Corynebac teri um crena turn) SYPA5-5為出發(fā)菌株，以pK18mohsacB質粒對其編碼鳥氨酸乙酰轉移酶(Ornithine carbamoyl transferase, OTC)的a/yF基因進行敲除,篩選獲得的重組菌株可積累L-鳥氨酸。
3.利用糖質原料發(fā)酵大量積累L-鳥氨酸的方法，其特征為: (1)種子活化:將斜面保存的菌種劃線于肉湯斜面中，30°C靜置培養(yǎng)24h ;肉湯培養(yǎng)基組分(g/L):葡萄糖20;蛋白胨10;牛肉膏10 ;酵母粉5 ;NaCl 5 ;瓊脂粉20 ;pH 7.0~7.2 ;121 V高壓蒸汽滅菌20 min ； (2)搖瓶種子:將活化后的種子，挑取一環(huán)接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，30°C120 rpm往復式搖床培養(yǎng)12-16 h，至OD562nm約為15 ;種子培養(yǎng)基組分(g/L):葡萄糖30 ;玉米漿20 ；(NH4)2SO4 20 ；KH2PO41 ；MgS04.7H20 0.5 ;尿素 1.5 ；ρΗ 7.0 ~7.2 ；121 °C 高壓蒸汽滅菌 20m in ； (3)搖瓶發(fā)酵:將液體種子按5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C120 rpm往復式搖床培養(yǎng)96 h,發(fā)酵至24 h補加50 g/L葡萄糖；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L):葡萄糖(分消)100 ;酵母粉 10 ； (NH4)2SO4 50 ；KH2PO41.5 ；MgS04.7H20 0.5 ；FeS04.7H20 0.02 ；MnSO4.H2O0.02;生物素 8 XlO-5 ;L-組氨酸 5Χ10-4 ;CaC03 30 ；pH 7.0 ~7.2; 115 °C高壓蒸汽滅菌 7min。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征為:添加適量L-精氨酸以有利于菌體的生長及L-鳥氨酸的積累。
【文檔編號】C12N1/21GK104031933SQ201410191782
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月8日 優(yōu)先權日:2014年5月8日
【發(fā)明者】許正宏, 竇文芳, 史勁松, 趙芹芹, 羅玉常, 張曉梅, 耿燕, 劉雪 申請人:江南大學