與結(jié)直腸炎惡性轉(zhuǎn)變相關(guān)的miRNA標(biāo)志物和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種與結(jié)直腸炎惡性轉(zhuǎn)變相關(guān)的miRNA標(biāo)志物，該標(biāo)志物為miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p和miR-150-5p的組合。還提供了一種上述miRNA標(biāo)志物的引物。還提供了一種上述miRNA標(biāo)志物在制備直腸癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。還提供了一種直腸癌早期診斷試劑盒。本發(fā)明提供的與結(jié)直腸炎惡性轉(zhuǎn)變相關(guān)的miRNA標(biāo)志物miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-150-5p對結(jié)直腸癌進(jìn)行早期篩查具有操作簡單、高特異性、高靈敏性的特點(diǎn)。
【專利說明】與結(jié)直腸炎惡性轉(zhuǎn)變相關(guān)的miRNA標(biāo)志物和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種與結(jié)直腸炎惡性轉(zhuǎn)變相關(guān)的miRNA標(biāo)志物對直腸癌早期篩查的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)直腸癌是第三常見的惡性疾病和癌癥致死的第二主要原因。就如其他惡性疾病一樣，基因因素是導(dǎo)致結(jié)直腸癌形成的重要原因，但是，只有20%的結(jié)直腸癌病例可以追溯到家族性基因變異。事實(shí)上，大部分的散發(fā)性結(jié)直腸癌和環(huán)境因素密切相關(guān)，最常見的抑癌基因APC的突變導(dǎo)致了 Apc/GSK3 β /Axin復(fù)合物的破壞，從而激活了 Wnt/ β -catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Wnt/ β -catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活不僅促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞的增殖，也抑制了其向腺窩底部的遷移 和凋亡。典型的“結(jié)直腸癌發(fā)生的基因途徑”已經(jīng)被充分的研究，環(huán)境因素導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生的最新機(jī)制和慢性炎癥有關(guān)，稱為腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌(CAC)。近幾年來隨著中國人的飲食和生活方式的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)生率迅速增高，而且大部分的結(jié)直腸癌病例和慢性腸炎相關(guān)。臨床上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌往往伴隨著慢性腸炎疾病，例如克羅恩病，潰瘍性腸炎。流行病學(xué)和臨床研究表明，在伴隨慢性腸炎30年后，潰瘍性腸炎增加了 18-20%的腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)病率，而克羅恩病增加了 8%的發(fā)病率。在小鼠模型中，注射致癌物azoxymethane (AOM)和慢性腸炎誘導(dǎo)物DSS會(huì)導(dǎo)致多發(fā)的腸腫瘤，但是如果沒有炎癥的存在，則需要注射多倍劑量的AOM并需要更長時(shí)間才能導(dǎo)致腫瘤的形成。這些臨床和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CAC是典型的炎癥致癌。但是，不像Apc/Wnt/β -catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，腸炎相關(guān)的結(jié)腸直腸癌的發(fā)病機(jī)制，特別是腸炎惡性轉(zhuǎn)變的機(jī)制尚不清楚，主要是因?yàn)槿鄙賱?dòng)態(tài)研究的合適模型。小腸上皮組織的杯狀細(xì)胞能夠分泌一層黏液蛋白，這層黏液蛋白能夠保護(hù)上皮組織免受機(jī)械的和化學(xué)的損傷，以及炎癥因素的損害。這種黏液蛋白主要是由Muc2基因所編碼。已有研究表明，杯狀細(xì)胞的減少和Muc2的表達(dá)降低在潰瘍性腸炎和結(jié)直腸癌中非常常見。MUC2對于維持腸道穩(wěn)態(tài)非常重要，將小鼠的Muc2基因敲除后，腸上皮細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡都發(fā)生了改變，最重要的是，Muc2敲除小鼠能夠自發(fā)地導(dǎo)致小腸、大腸和直腸腫瘤的發(fā)生。而研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與慢性炎癥相關(guān),與Wnt/ β-catenin信號通路無關(guān)。Muc2敲除引起的炎癥促進(jìn)了 Apc突變小鼠的腫瘤發(fā)生，而且在Muc2敲除小鼠中，周期依賴性激酶抑制物P21WAF1的表達(dá)降低促進(jìn)了腫瘤的形成。我們更深入的研究發(fā)現(xiàn)，Muc2敲除小鼠在出生后3個(gè)月以內(nèi)會(huì)自發(fā)形成慢性腸炎，其組織病理特點(diǎn)與人的潰瘍性腸炎類似。在3個(gè)月之后，Muc2-/-小鼠會(huì)形成結(jié)腸和直腸腫瘤。因此，3個(gè)月可能是慢性腸炎發(fā)展為結(jié)直腸癌的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。所以Muc2-/-小鼠可以作為一種動(dòng)態(tài)研究慢性腸炎惡性轉(zhuǎn)變形成結(jié)直腸癌的理想模型。為了揭示腸炎惡性轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制，我們分離了 Muc2-/_小鼠的腸上皮細(xì)胞來做miRNA，我們在腸炎惡性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了一些異常表達(dá)的miRNA。我們在人的腸炎和結(jié)直腸癌組織中對上述的一些miRNA做了驗(yàn)證，有趣的是，這些表達(dá)降低的miRNA在小鼠組織中同樣表達(dá)降低，并且和一些細(xì)胞因子的表達(dá)增高相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)預(yù)示著表觀改變可能在腸炎惡性轉(zhuǎn)變中起著重要的作用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明的目的是提供一種與結(jié)直腸炎惡性轉(zhuǎn)變相關(guān)的miRNA標(biāo)志物和試劑盒。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種與結(jié)直腸炎惡性轉(zhuǎn)變相關(guān)的miRNA標(biāo)志物，該標(biāo)志物為 miR-138-5p、miR-145_5p、miR-146a_5p 和 miR-150_5p 的組合。以上四種 miRNA在Muc2-/_小鼠模型的慢性腸炎惡性轉(zhuǎn)變過程中表達(dá)明顯降低，在人腸炎組織及結(jié)直腸癌組織中表達(dá)也明顯降低，說明其與慢性腸炎惡性轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。
[0005]本發(fā)明還提供一種上述miRNA標(biāo)志物的引物，該引物為:
[0006]miR-138-5p 的正向引物序列為:5’ -TGGAGCTGGTGTTGTGAATC-3’，如 SEQ ID NO:1所示；
[0007]miR-145-5p 的 正向引物序列為:5’-GGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3’，如 SEQ ID NO:2 所示；
[0008]miR-146a-5p 的正向引物序列為:5’ -TTCGGTGAGAACTGAATTCCA-3’，如 SEQ ID NO:3所示；
[0009]miR-150-5p 的正向引物序列為:5’-CCGGGTCTCCCAACCCTTGTA_3’，如 SEQ ID NO:4所示；
[0010]通用反向引物序列為:5’ -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3，，如 SEQ ID NO: 5 所示。
[0011 ] 本發(fā)明還提供一種上述miRNA標(biāo)志物在制備直腸癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。具體地，通過檢測被試者結(jié)直腸組織中的四種miRNA的含量，并與正常水平相比較來對患者的病情發(fā)展做出預(yù)判，以此來指導(dǎo)臨床治療。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，使用定量PCR的方法來檢測被試者結(jié)直腸組織中的四種miRNA含量。
[0012]優(yōu)選的，上述miRNA標(biāo)志物的引物在制備直腸癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明還提供一種直腸癌早期診斷試劑盒，試劑盒含有上述miRNA標(biāo)志物的引物。
[0014]優(yōu)選的，該試劑盒還包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑。
[0015]優(yōu)選的，該試劑盒包括組織總RNA提取試劑、總RNAWpoly(A)試劑、RT-PCR試劑、定量PCR試劑。
[0016]優(yōu)選的，所述RT-PCR試劑中包括RT-引物:
[0017]hsa-miR-138:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCGGCCT-3’ ；
[0018]hsa-miR-145:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGGGAT-3’ ；
[0019]hsa-miR-146a:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA-3，；
[0020]hsa-miR-150:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACTGG-3’ ；
[0021]內(nèi)參 SN0RD44:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTagtcag_3，；
[0022]所述定量PCR試劑中包括序列:
[0023]通用反向引物:5’ -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3，；
[0024]通用Taqman 探針:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAATTT/3 IABkFQ。[0025]本發(fā)明的有益效果:
[0026]本發(fā)明提供的與結(jié)直腸炎惡性轉(zhuǎn)變相關(guān)的miRNA標(biāo)志物miR-138_5p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-150-5p對結(jié)直腸癌進(jìn)行早期篩查具有操作簡單、高特異性、高靈敏性的特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1 Muc2_/_小鼠腸上皮miRNA array聚類分析結(jié)果；
[0028]圖2 Muc2+/+和Muc2-/_小鼠的腸上皮細(xì)胞因子表達(dá)水平；
[0029]圖3在Muc2+/+和Muc2-/_小鼠的腸上皮細(xì)胞中驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA ；
[0030]圖4 miR-138-5p在16對結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平；
[0031]圖5 miR-145-5p在16對結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平；
[0032]圖6 miR-146a-5p在16對結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平；
[0033]圖1 miR-150-5p在16對結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平；
[0034]圖8 miR-138-5p在6對結(jié)腸炎組織中的表達(dá)水平；
[0035]圖9 miR-145-5p在6對結(jié)腸炎組織中的表達(dá)水平；
[0036]圖10 miR-146a-5p在6對結(jié)腸炎組織中的表達(dá)水平；
[0037]圖11 miR-150-5p在6對結(jié)腸炎組織中的表達(dá)水平。
【具體實(shí)施方式】
[0038]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0039]實(shí)施例1結(jié)腸炎相關(guān)的癌模型Muc2基因敲除小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜
[0040]小鼠的腸上皮細(xì)胞的收集:選擇3月齡的Muc2+/+和Muc2-/_，每組包括四只小鼠，將小鼠處死，取結(jié)腸洗凈，縱向剖開，各取一段置于20ml冰PBS ;將組織移入37°C 15mMEDTA30ml中；37°C振蕩，220rpm, 30min,充分振蕩，去除腸組織；4°C離心5000rpm, 5min ;先棄去上清，5ml冷PBS重懸細(xì)胞,分裝于1.5mlEP管中；4°C離心,3000rpm, 5min ;棄去上清，EP管開蓋置于液氮中；取出后開蓋置于_80°C過夜,次日將EP管蓋上。
[0041]總RNA的提取:按照操作手冊用Trizol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)提取總RNA0
[0042]miRNA array(表達(dá)譜):實(shí)驗(yàn)操作由芝加哥大學(xué)基因研究所實(shí)施。
[0043]聚類分析結(jié)果如圖1所示:21個(gè)miRNA下調(diào),70個(gè)miRNA上調(diào)(changefold>2or<0.5 ；T<0.01,p value<0.05, q value<0.05)。
[0044]實(shí)施例2Muc2小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)、差異表達(dá)miRNA的驗(yàn)證
[0045]小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞RNA提取與實(shí)施例1中方法相同；
[0046]利用qRT-PCR檢測細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)體系:正向引物(20μπι)0.15 μ 1，反向引物(20μL?)0.15μ l，cDNA0.7μ 1，Η209 μ 1，熒光染料 SYBR Green (2X) 10 μ I ;反應(yīng)條件:50°C 2min，95°C 2min ;變性 95°C 15sec，退火 / 延伸 60°C lmin，共 40 個(gè)循環(huán)。
[0047]細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平如圖2所示:與對照相比，Muc2_/_小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞中幾種細(xì)胞因子IL-6、COX-2、IL-10、TNF α、IL-1 β表達(dá)水平明顯上升。
[0048] IL-6:[0049]正向引物:TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC，
[0050]反向引物:TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC；
[0051]COX-2:
[0052]正向引物:TGAGCAACTATTCCAAACCAGC，
[0053]反向引物:GCACGTAGTCTTCGATCACTATC；
[0054]IL-10:
[0055]正向引物:GCTCTTACTGACTGGCATGAG，
[0056]反向引物:CGCAGCTCTAGGAGCATGTG；
[0057]IL-1 β:
[0058]正向引物:GCAACTGTTCCTGAACTCAACT，
[0059]反向引物:ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT；
[0060]TNF α:
[0061]正向引物:CCCTCACA CTCAGATCATCTTCT，
[0062]反向引物:GCTACGACGTGGGCTACAG；
[0063]IKK β:
[0064]正向引物:CTGAAGATCGCCTGTAGCAAA，
[0065]反向引物:TCCATCTGTAACCAGCTCCAG；
[0066]GAPDH:
[0067]正向引物:TCTGGAAAGCTGTGGCGTGAT，
[0068]反向引物:GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG。
[0069]為了驗(yàn)證小鼠miRNA array的結(jié)果，選擇15個(gè)miRNA利用熒光定量PCR技術(shù)來驗(yàn)證，如圖 3 所不:mmu_miR-146a、mmu-miR-138、mmu-miR-5123、mmu_miR-196b、mmu-miR-5099、mmu-miR-150、mmu-miR-145、mmu_miR-27a、mmu_miR-23a 表達(dá)下調(diào)；mmu-miR-705、mmu-miR-760_3p、mmu-miR-1962、mmu_miR-669c、mmu-miR-3104_5p、mmu-miR-5132表達(dá)上調(diào),突光定量PCR的結(jié)果與miRNA array的結(jié)果一致。
[0070]mmu-miR-146a-5p 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA ；
[0071 ]定量正向引物:TTCGGTGAGAACTGAATTCCA ；
[0072]mmu-miR-138-5p 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCGGCCT ；
[0073]定量正向引物:TGGAGCTGGTGTTGTGAATC；
[0074]mmu-miR-5123 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACACC ；
[0075]定量正向引物:TGGTGTAGATCCATATGCCAT；
[0076]mmu-miR-196b-5p 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCCAAC ；
[0077]定量正向引物:TTCGGTAGGTAGTTTCCTGTT；
[0078]mmu-miR-5099 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGGAGCA ；[0079]定量正向引物:TGTCGGTTAGATCGATGTGG；
[0080]mmu-miR-150-5p 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACTGG ；
[0081 ]定量正向引物:CGGTCTCCCAACCCTTGTA ；
[0082]mmu-miR-145a-5p 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGGGAT ；
[0083]定量正向引物:GGGTCCAGITTTCCCAGGA；
[0084]mmu-miR-27a-3p 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGCGGAA ；
[0085]定量正向引物:TTCGGTTCACAGTGGCTAAG；
[0086]mmu-miR-23a-3p 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGGAAAT ；
[0087]定量正向引物:TCGGATCACATTGCCAGGG；
[0088]mmu-miR-705 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGCCCAC ；
[0089]定量正向引物: TGGGGTGGGAGGTGGGG；
[0090]mmu-miR-760-3p 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCCCAC ；
[0091 ]定量正向引物:CGGCGGCTCTGGGTCTG ；
[0092]mmu-miR-1962 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTATGTGT ；
[0093]定量正向引物:TGAGAGGCTGGCACTGGG；
[0094]mmu-miR-669c-5p 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTACACAC ；
[0095]定量正向引物:TTCGGATAGTTGTGTGTGGAT；
[0096]mmu-miR-3104-5p 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGAGGG ；
[0097]定量正向引物:TAGGGGGCAGGAGCCGGAG；
[0098]mmu-miR-5132-5p 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCTGAG ；
[0099]定量正向引物:GGGCGTGGGGTGGTGGA；
[0100]內(nèi)參 snoRNA202 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAAITITITITITTCATCAG ；
[0101 ]定量正向引物:GTACTTTTGAACCCTTTTCCAT ；
[0102]定量通用反向引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGT；
[0103]定量通用Taqman 探針:56_FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAAITT/3 IABkFQ。
[0104]實(shí)施例3人結(jié)腸癌組織標(biāo)本收集
[0105]16對結(jié)直腸癌組織、6對結(jié)腸腸炎組織及其配對正常組織皆從新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院和新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院收集，標(biāo)本儲(chǔ)存于-80°C環(huán)境中。[0106]實(shí)施例4RNA提取
[0107]按照操作手冊步驟用Trizol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)提取冰凍的結(jié)腸癌及其鄰近正常結(jié)腸組織的 RNA。用 A-Plus? Poly(A) Polymerase Tailing Kit (CELLSCRIPT,INC)按操作手冊對miRNA進(jìn)行加polyA。
[0108]實(shí)施例5通過qRT-PCR對四個(gè)miRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測
[0109]為了檢測來自結(jié)腸癌模型鼠中差異表達(dá)的miRNA是否有臨床意義，我們選擇了四個(gè)miRNA:即miR-138、miR-145、miR-146a、miR-150，在臨床病人標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證。
[0110]使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo SCIE NTIFIC, USA)按操作手冊對加poly (A)的miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
[0111]使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Applied Biosystem Inc.)對miRNA進(jìn)行定量分析。定量的反應(yīng)體系:GoTaq Hot Start Colorless Master MixlO μ I,上游引物 0.4 μ I,下游引物0.4 μ I,probe0.5 μ I, diluted cDNA2 μ I, RNase-free water6.7 μ I。反應(yīng)條件:95°C 2min ；變性95°C 10s，退火/延伸60°C 30s，共40個(gè)循環(huán)。
[0112]所使用的引物如下 :
[0113]hsa-miR-138 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCGGCCT ；hsa-miR-138 定量正向引物:TGGAGCTGGTGTTGTGAATC。
[0114]hsa-miR-145 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGGGAT ；hsa-miR-145 定量正向引物:GGGTCCAGITTTCCCAGGA。
[0115]hsa-miR-146a 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA ；hsa-miR-146a 定量正向引物:TTCGGTGAGAACTGAATTCCA
[0116]hsa-miR-150 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACTGG ；hsa-miR-150 定量正向引物:CCGGGTCTCCCAACCCTTGTA
[0117]內(nèi)參 SN0RD44 逆轉(zhuǎn)錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAAITITITITITTagtcag ;內(nèi)參 SN0RD44 定量正向引物:TGGCCTGGATGATGATAAGCA。
[0118]定量通用反向引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGT；
[0119]定量通用Taqman 探針:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAAITT/3 IABkFQ。
[0120]結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中4個(gè)miRNA的表達(dá)結(jié)果如圖4_7所示:與正常組織相比，16個(gè)癌組織中miR-138、miR-145、miR_146a、miR-150的總體表達(dá)水平分別減少了
3.37,3.39,2.56,4.99 倍(Ρ〈0.001)。16 個(gè)癌組織中 miR-138 和 miR-150 的表達(dá)都是降低的，15個(gè)癌組織中miR-145和miR_146a的表達(dá)是降低的。
[0121]結(jié)腸炎組織與正常結(jié)腸組織中4個(gè)miRNA的差異表達(dá)結(jié)果如圖8_11所示:這4個(gè)miRNAs在人的結(jié)腸炎組織中的表達(dá)也是下調(diào)的，因此，這幾個(gè)miRNA可能參與結(jié)腸炎的惡性轉(zhuǎn)化。
[0122]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、【具體實(shí)施方式】及試驗(yàn)，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種與結(jié)直腸炎惡性轉(zhuǎn)變相關(guān)的miRNA標(biāo)志物，其特征在于，該標(biāo)志物為miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p 和 miR-150_5p 的組合。
2.一種如權(quán)利要求1所述的miRNA標(biāo)志物的引物，其特征在于，該引物為: miR-138-5p 的正向引物序列為:5’ -TGGAGCTGGTGTTGTGAATC-3’ ； miR-145-5p 的正向引物序列為:5’ -GGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3’ ； miR-146a-5p 的正向引物序列為:5’ -TTCGGTGAGAACTGAATTCCA-3’ ； miR-150-5p 的正向引物序列為:5’ -CCGGGTCTCCCAACCCTTGTA-3’ ； 通用反向引物序列為:5’ -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
3.權(quán)利要求1所述的miRNA標(biāo)志物在制備直腸癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的miRNA標(biāo)志物的引物在制備直腸癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種直腸癌早期診斷試劑盒，其特征在于，試劑盒含有權(quán)利要求2所述的miRNA標(biāo)志物的引物。
6.根據(jù)權(quán)利要 求5所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括PCR反應(yīng)常用的酶和試 劑。
【文檔編號】C12N15/11GK103966328SQ201410191812
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】鮑永華, 楊萬才, 郭永臣, 李澤信, 薛會(huì)朝, 朱紹輝, 徐紅偉, 游焜, 韓榮飛, 賈慧婕, 李凱, 王倩 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院