多形漢遜酵母重組菌株及其在紫杉醇生物合成中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種多形漢遜酵母重組菌株及其在紫杉醇生物合成中的應(yīng)用，運用低能離子注入介導(dǎo)紅豆杉基因組總DNA轉(zhuǎn)化酵母獲得一株產(chǎn)紫杉醇的多形漢遜酵母(Hansenula?polymorpha)重組菌株CGMCC?No.8999，本發(fā)明實現(xiàn)了利用重組酵母菌進(jìn)行生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)突破，為解決紫杉醇來源短缺、保護(hù)我國紅豆杉植物資源及其可持續(xù)發(fā)展提供新途徑。
【專利說明】多形漢遜酵母重組菌株及其在紫杉醇生物合成中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得產(chǎn)紫杉醇的轉(zhuǎn)基因酵母重組菌領(lǐng)域，具體涉及利用低能離子注入介導(dǎo)紅豆杉基因組總DNA在酵母菌中遺傳轉(zhuǎn)化獲得的多形漢遜酵母重組菌株及其在紫杉醇生物合成中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是當(dāng)今世界公認(rèn)的廣譜、療效確切的天然抗癌藥物，其分子結(jié)構(gòu)是由漿果赤霉素III (baccatinIII)以及連接在13位碳上的苯丙氨酸衍生物構(gòu)成的三環(huán)二 萜類生物堿。紫杉醇是目前人們所了解的唯一一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物，細(xì)胞接觸紫杉醇后在細(xì)胞內(nèi)積累大量的微管，而這些微管的積累干擾了細(xì)胞的各種功能，特別是使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期，從而阻斷了細(xì)胞的正常分裂。1992年，美國食品藥品管理局(FDA)正式批準(zhǔn)紫杉醇上市，用于治療卵巢癌和乳腺癌。此后，臨床上相繼發(fā)現(xiàn)紫杉醇對結(jié)腸癌、直腸癌、膀胱癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌，以及對肺癌、惡性黑色素癌和肉瘤等均表現(xiàn)出一定療效，紫杉醇已成為國際抗腫瘤的主流藥物之一。
[0003]目前，紫杉醇主要是通過從紅豆杉原料中提取紫杉醇或其中間體的方法獲得。值得注意的是，紅豆杉成樹一般需要100-250年，加之紫杉醇在樹皮中的含量較低(平均含量約0.015% )，生產(chǎn)Ikg紫杉醇大概需要7000kg，相當(dāng)于2000-2500棵成年紅豆杉。由于臨床上對紫杉醇的需求量日益增加，導(dǎo)致對紅豆杉過度開發(fā)，致使天然紅豆杉面臨匱乏與枯竭，加之引種馴化困難、人工栽培周期長、活性組分產(chǎn)量低，使得傳統(tǒng)的從紅豆杉植株中直接提取紫杉醇的方式受到極大的限制和挑戰(zhàn)。
[0004]因此，紅豆杉屬植物的資源問題已經(jīng)引起各國環(huán)保專家和政府的高度重視，我國已將紅豆杉列為一級珍稀瀕危，相當(dāng)于“植物中的大熊貓”，嚴(yán)禁砍伐。另外，紫杉醇的分子結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，分子中有眾多的功能基團(tuán)和立體化學(xué)特征。盡管早在1994年紫杉醇的全化學(xué)合成就獲得了成功，但是由于其反應(yīng)步驟多，需大量使用手性試劑，反應(yīng)條件極難控制，制備成本十分昂貴，難以適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
[0005]現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)因其在尋求紫杉醇新型藥源方面具有獨特優(yōu)勢，逐漸成為當(dāng)今國際生藥學(xué)界的研究熱點之一。然而，目前紫杉醇生物合成途徑及其相關(guān)基因尚未闡明清楚。
[0006]近年來，在植物天然產(chǎn)物生物合成基因信息及生物合成途徑尚未闡明前，Lu等通過Ar+和N+注入介導(dǎo)麻黃基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母，獲得遺傳穩(wěn)定酵母工程菌，麻黃堿和偽麻黃堿產(chǎn)量分別為18.85mg/L和4.llmg/L。Jin等利用低能離子注入介導(dǎo)甘草基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母，獲得了遺傳穩(wěn)定的酵母工程菌，其五環(huán)三萜苷類物質(zhì)甘草酸的最高產(chǎn)量達(dá)114.49mg/L0
[0007]目前，國外尚未見利用低能離子注入介導(dǎo)藥用植物基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)藥用有效成分的重組菌的研究報道，在遺傳改造酵母生物合成紫杉醇方面國內(nèi)外都尚未見報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種多形漢遜酵母重組菌株及其在紫杉醇生物合成中的應(yīng)用。
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案。
[0010]一種多形漢遜酵母重組菌株，該重組菌株的分類命名為多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)，所述重組菌株保藏于CGMCC，保藏編號為CGMCC N0.8999。
[0011]所述重組菌株的篩選方法包括以下步驟:
[0012]I)運用低能離子注入介導(dǎo)紅豆杉基因組DNA轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母出發(fā)菌株；
[0013]2)重組菌株初篩:將經(jīng)過步驟I)處理后的出發(fā)菌株涂布于YPD固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，挑取新鮮菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)發(fā)酵后，采用香草醛反應(yīng)和FeCl3試驗對重組菌株的發(fā)酵液進(jìn)行分析，鑒定發(fā)酵液中是否存在紫杉醇；
[0014]3)將經(jīng)過定性方法初篩得到的重組菌株進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)，利用薄層層析和高效液相色譜對其發(fā)酵液進(jìn)行分析，進(jìn)一步篩選鑒定重組菌株。
[0015]所述出發(fā)菌株為多形漢遜酵母H.polymorpha DL-1 (來源為ATCCN0.26012)。 [0016]所述低能離子注入采用低能N+作為注入離子，最佳注入劑量為1.5X IO16~2.5X 1016ions/cm2，最佳注入能量為15~25KeV，脈沖時間為5~IOs,間隔時間為5~IOs,真空度為1.5~2.0XlO-3Pa0
[0017]所述重組菌株的發(fā)酵方法包括以下步驟:于37°C、轉(zhuǎn)速為200r/min下培養(yǎng)72~120h。
[0018]所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為液體無機(jī)培養(yǎng)基，發(fā)酵中同時流加0.5%的甘油水溶液，流速為12.5mL/h。
[0019]上述多形漢遜酵母重組菌株(CGMCC N0.8999)在紫杉醇生物合成中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0021]本發(fā)明通過低能離子注入技術(shù)介導(dǎo)紅豆杉基因組DNA在出發(fā)菌株中隨機(jī)轉(zhuǎn)化，獲得一株多形漢遜酵母重組菌株，該重組菌株能夠有效地生物合成紫杉醇，具有易于高密度發(fā)酵、產(chǎn)物易于分離提取的優(yōu)點，為紫杉醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新途徑，為解決紫杉醇藥源短缺問題提供了新思路、新方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為發(fā)酵產(chǎn)物TLC分析圖譜，其中，1:陰性對照酵母菌株(低能離子注入后用不含紅豆杉基因組DNA的TE緩沖液溫育、洗脫)發(fā)酵液樣品，2:重組菌株發(fā)酵液樣品，3:紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品。
[0023]圖2為發(fā)酵產(chǎn)物HPLC圖譜，其中，A:紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品，B:陰性對照酵母菌株發(fā)酵液樣品，C:重組菌株發(fā)酵液樣品。
[0024]圖3為重組菌株的發(fā)酵圖譜。
[0025]圖4為重組菌株的遺傳穩(wěn)定性圖譜。
【具體實施方式】[0026]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
[0027]本發(fā)明以H.polymorpha DL-1為出發(fā)菌株(來源為ATCC N0.26012)，利用低能離子輻照注入介導(dǎo)紅豆杉基因組DNA對出發(fā)菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過篩選獲得產(chǎn)紫杉醇重組菌株，并進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性和相應(yīng)的發(fā)酵試驗。
[0028](一 )培養(yǎng)基
[0029]液體無機(jī)培養(yǎng)基的組成:丙三醇19g，(NH4) 2S046g, K2HPO40.24g，MgSO4.7H201.4g，CaCl20.38g，NaCl0.6g，NaNO30.58g，鐵鹽溶液0.2mL，硫胺素鹽酸鹽溶液lmL，PTM微量元素溶液lmL，用水定容至1L，pH為6.5 ;
[0030]其中各溶液配料如下:
[0031]鐵鹽溶液=FeCl3.6H2030g，用水溶解并定容至IL ；
[0032]硫胺素鹽酸鹽溶液:硫胺素鹽酸鹽4g，用水溶解并定容至IL ；
[0033]PTM 微量元素溶液:ΚΙ0.lg，Na2MoO4.2Η200.2g，MnSO4.H2O0.303g，CuSO4.5Η200.04g, ZnSO4.7Η200.4g，用水溶解并定容至 IL0
[0034]Yro有機(jī)固體培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L,瓊脂 20g/L, pH 為 6.5。
[0035]( 二)篩選方法
[0036]I)萜類物質(zhì)檢測
[0037]香草醛反應(yīng):取SOOmL發(fā)酵液，100°C下濃縮發(fā)酵液至5mL(即得濃縮發(fā)酵液)后，加入甲醇IOmL萃取，過濾萃取液。取濾液lmL，加入5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))香草醛濃硫酸溶液
0.5mL，加熱2min，觀察溶液顏色變化，呈現(xiàn)淡紫色的為陽性。
[0038]FeCl3試驗:用進(jìn)樣針吸取樣品在濾紙上點多個樣點，噴以3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))FeCl3水溶液，觀察樣點顏色變化，出現(xiàn)紅色斑點的為陽性。
[0039]2)薄層層析(TLC)定性檢測:分別將5μ L濃縮發(fā)酵液和紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品在GF254硅膠薄層板上點樣，在展開劑氯仿-甲醇(V/V，90:10)中展開，結(jié)束后在紫外燈下觀察，記錄斑點，并計算其Rf值。
[0040]3) HPLC定量檢測:取發(fā)酵液800mL，100°C下濃縮發(fā)酵液至5mL (即得濃縮發(fā)酵液)后，加甲醇IOmL萃取，過濾萃取液，濾液以0.45 μ m微孔濾膜過濾后用于HPLC法測定紫杉醇的含量；HPLC色譜條件為:色譜柱為化學(xué)鍵合型十八烷基柱(SciC18色譜柱)；Pump:K-1001 ；Detecter:K_1501 ;流動相:甲醇-水(V/V,68:32);柱溫:25°C。
[0041](三)重組以及篩選流程
[0042]I)提取紅豆杉基因組DNA:取陜西當(dāng)?shù)禺a(chǎn)紅豆杉新鮮葉片50g，用液氮迅速研磨至粉末后，將其裝入50mL的離心管中；接著迅速將3mL預(yù)熱的CTAB提取液(2%CTAB，
1.4MNaCl，0.02MEDTA，0.lMTris-HCl，0.2%巰基乙醇，pH8.0)加入到裝有粉末的 50mL 離心管中；之后放入65°C水浴鍋中，保溫30~60min (期間輕搖5次)后,加入3~4mL氯仿-異戊醇(24:1)，輕搖混勻至乳白色后，置于4°C、I 1000rpm離心15min ;取上清液并加入0.6倍體積的異丙醇，搖勻后，置于4°C、IlOOOrpm離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇漂洗2次，放置于超凈工作臺中吹干得紅 豆杉基因組DNA。最后加入ImLTris-EDTA(pH8.0)緩沖液溶解基因組DNA，并用紫外分光光度計測其濃度，放入4°C冰箱保存。
[0043]2)低能離子注入菌膜:將本實驗室保藏的出發(fā)菌株(H.polymorpha DL-1)于37°C、在YPD有機(jī)固體培養(yǎng)基上活化12h后，挑取菌落接種到液體無機(jī)培養(yǎng)基中，并于37°C、110r/min轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)16h得菌液A，取適量菌液A稀釋至濃度為1.0 X 107CFU/mL得菌體稀釋液，取0.1mL菌體稀釋液均勻涂布于直徑90mm的無菌平皿中央，無菌風(fēng)吹干制成菌膜，然后置于離子注入機(jī)真空靶室進(jìn)行N+注入，注入能量為20KeV，劑量為2.0 X 1016ions/cm2,脈沖時間6s,間隔時間IOs,真空度為1.5 X IO^3Pa0
[0044]3)固體培養(yǎng):經(jīng)過步驟2)后，用2mL含有紅豆杉基因組DNA的Tris-EDTA緩沖液(TE，pH8.0)浸泡離子注入后的菌膜，然后于37°C溫育2h后用移液器進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并用無菌刮鏟將菌全部刮下得菌液B，分別取0.1mL菌液B均勻涂布于YPD有機(jī)固體培養(yǎng)基后于37 °C培養(yǎng)72h。
[0045]4)初篩:經(jīng)過步驟3)后，將培養(yǎng)獲得的菌落轉(zhuǎn)接入試管中進(jìn)行液體培養(yǎng)(37°C、110rpm/min培養(yǎng)120h),然后于10000r/min離心10min收集發(fā)酵液進(jìn)行檢測分析。職類物質(zhì)的檢測主要采用香草醛反應(yīng)和FeCl3試驗。首先利用香草醛反應(yīng)對重組菌株的發(fā)酵液進(jìn)行分析，觀察樣品液的顏色變化(陽性結(jié)果為淡紫色)。然后，再利用FeCl3試驗對上述出現(xiàn)淡紫色的重組菌株的發(fā)酵液進(jìn)一步分析，觀察是否出現(xiàn)紅色斑點(陽性結(jié)果為出現(xiàn)紅色斑點)。上述兩種陽性反應(yīng)結(jié)果表明重組菌株的發(fā)酵液中存在萜類化合物，可作為后續(xù)分析的初篩重組菌株。
[0046]5)定性、定量檢測:將初篩重組菌株接種于含IOmL液體無機(jī)培養(yǎng)基的試管中，并于37°C、110r/min下培 養(yǎng)12h得種子培養(yǎng)液，以體積為5 %的接種量將種子培養(yǎng)液接種于含IOOmL液體無機(jī)培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，然后于110r/min、37°C下培養(yǎng)90h，然后于7000r/min離心10min，離心得到的菌體用蒸餾水沖洗兩次后于85°C烘干至恒重進(jìn)行稱重分析，離心得到的上清液用于產(chǎn)物定性、定量檢測，主要采用薄層層析(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。
[0047]薄層層析法定性鑒定:分別用毛細(xì)管將5μ L的初篩重組菌株濃縮發(fā)酵液、陰性對照酵母菌株的濃縮發(fā)酵液及紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品點于薄層板上，然后將薄層板在展開劑氯仿-甲醇(V/V，90:10)中進(jìn)行展開。結(jié)果如圖1所示，初篩重組菌株濃縮發(fā)酵液在與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品相對應(yīng)的位置上出現(xiàn)同樣斑點，其Rf值為0.435，與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品Rf值(0.438)非常接近，而陰性對照酵母菌株的濃縮發(fā)酵液在該處未出現(xiàn)斑點，表明初篩重組菌株發(fā)酵過程有新物質(zhì)合成。
[0048]HPLC法定量鑒定:分別將初篩重組菌株濃縮發(fā)酵液、陰性對照酵母菌株的濃縮發(fā)酵液及紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖2所示，保留時間為20.441min處初篩重組菌株濃縮發(fā)酵液中出峰(圖2C)，與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品出峰(圖2A)的保留時間20.550min基本一致，而陰性對照酵母菌株的濃縮發(fā)酵液在該處未出峰，表明初篩重組菌株具有生物合成紫杉醇的能力。通過上述步驟，最終本發(fā)明篩選得到了一株重組菌株DL-781，本發(fā)明篩選獲得的重組菌株的分類命名為多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha),該重組菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏日期為2014年4月3日；保藏編號為CGMCC N0.8999。
[0049](四)重組菌株的發(fā)酵及紫杉醇分離提取
[0050]重組菌株(CGMCC N0.8999)的發(fā)酵工藝:采用5L全自動發(fā)酵罐對篩選出來的重組菌株(CGMCC N0.8999)進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇，重組菌株經(jīng)種子培養(yǎng)(參照上述種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)條件)后以5% (體積比)的接種量接種于液體無機(jī)培養(yǎng)基中，于37°C、轉(zhuǎn)速為200r/min下進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵120h，發(fā)酵中同時流加0.5% (w/v，IOOmL水中含0.5g甘油)的甘油水溶液，流速為12.5mL/h，發(fā)酵60h后，每隔12h取發(fā)酵液500mL，測定酵母細(xì)胞生物量和紫杉醇。結(jié)果如圖3所示，菌體濃度隨著培養(yǎng)時間的增加不斷升高，培養(yǎng)96h后細(xì)胞生物量達(dá)到最高為39.92g/L，接著進(jìn)入生長平穩(wěn)期；紫杉醇從72h開始出現(xiàn)，并隨著時間延長，產(chǎn)量隨之增長，108h時產(chǎn)量達(dá)到最高，達(dá)1.106mg/L。
[0051]紫杉醇分離純化:依據(jù)上述發(fā)酵工藝，將重組菌株(CGMCC N0.8999)進(jìn)行高密度發(fā)酵12011，于6011、7211、8411，9611和120h分別取500mL發(fā)酵液進(jìn)行分離純化檢測分析。具體為將發(fā)酵液500mL經(jīng)過12000r/min離心10min后，將上清液于80°C濃縮至10mL，采用H60大孔樹脂對紫杉醇進(jìn)行分離。將濃縮后的上清液配成體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇-水(甲醇與水的體積比為50:50)的溶液作為上樣液，流速為1.5mL/min上樣，再用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇水溶液作洗脫液，流速為0.5mL/min洗脫。利用HPLC進(jìn)行定量分析表明，樣品中紫杉醇回收率達(dá)85%。
[0052](五)重組菌株的遺傳穩(wěn)定性[0053]將重組菌株(CGMCC N0.8999)活化后接種于含有500mL液體無機(jī)培養(yǎng)基的2000mL三角瓶中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)(37°C、160r/min)，傳代培養(yǎng)10代測定重組菌株的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果如圖4所示，表明傳代培養(yǎng)過程中重組菌株發(fā)酵液中紫杉醇含量基本不變，傳代培養(yǎng)10代后紫杉醇含量為1.081mg/L，相比于第一代重組菌株的紫杉醇含量(1.106mg/L)降低了
1.8 %，說明該重組菌株遺傳穩(wěn)定。
[0054]總之，本發(fā)明利用低能離子注入技術(shù)轉(zhuǎn)化酵母構(gòu)建產(chǎn)紫杉醇重組酵母菌，微生物發(fā)酵生物合成紫杉醇具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短、不受自然氣候影響、節(jié)約土地、胞外產(chǎn)物分離提取簡單等優(yōu)點，這為解決紫杉醇來源短缺問題、保護(hù)紅豆杉科植物資源并實現(xiàn)其可持續(xù)發(fā)展提供了新途徑。
【權(quán)利要求】
1.一種多形漢遜酵母重組菌株，其特征在于:該重組菌株的分類命名為多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha),所述重組菌株保藏于CGMCC,保藏編號為CGMCC N0.8999。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種多形漢遜酵母重組菌株，其特征在于:所述重組菌株的發(fā)酵方法包括以下步驟:于37°C、轉(zhuǎn)速為200r/min下培養(yǎng)72~120h。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種多形漢遜酵母重組菌株，其特征在于:所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為液體無機(jī)培養(yǎng)基，發(fā)酵中同時流加0.5%的甘油水溶液，流速為12.5mL/h。
4.一種如權(quán)利要求1所述多形漢遜酵母重組菌株在紫杉醇生物合成中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/19GK103923848SQ201410175122
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】錢衛(wèi)東, 趙德志, 蔡長龍, 毛培宏, 王婷, 陳雪峰, 施春陽 申請人:陜西科技大學(xué)