一株漢遜德巴利酵母菌株及其發(fā)酵制備3-羥基丙酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株漢遜德巴利酵母菌株，所述的漢遜德巴利酵母菌株為漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hansenii.) IS451，保藏號為：CGMCC No.11893。該菌株發(fā)酵制備3?羥基丙酸的方法，按如下方法制備：將IS451菌株接種于斜面培養(yǎng)基中進行活化，再接入種子培養(yǎng)基，恒溫振蕩器中培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)期，制得IS451菌株種子液；將培養(yǎng)好的IS451菌株種子液按照體積比為10%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH至6.0；恒溫振蕩器中培養(yǎng)，發(fā)酵時間5天，制得發(fā)酵液；檢測發(fā)酵液中3?羥基丙酸含產(chǎn)量達48.96 g/L，比文獻報道微生物發(fā)酵生產(chǎn)3?羥基丙酸含量高出3倍多，具有廣泛的應用前景。CGMCC No.1189320151218
【專利說明】
一株漢遜德巴利酵母菌株及其發(fā)酵制備3-羥基丙酸的方法
技術(shù)領域
[0001]本發(fā)明涉及一株漢遜德巴利酵母菌株及其發(fā)酵制備3-羥基丙酸的方法，屬于生物化工及發(fā)酵工程領域。
【背景技術(shù)】
[0002]受世界石油資源、價格、環(huán)保和全球氣候變化等的影響，開發(fā)生物基資源已成為許多國家提高資源能源安全、減排溫室氣體、應對氣候變化的重要措施。3-羥基丙酸(3-hp)是近年來興起的一種重要的化學中間體，3-hp具有羥基和羧基兩種官能團，是很多光學活性物質(zhì)的前體，是一種重要的平臺化合物，其產(chǎn)量直接影響著許多高附加值化學品的生產(chǎn)。3-hp可以作為生產(chǎn)丙二酸、I，3_丙二醇(PDO)、丁二酸，特種聚酯和丙烯酸的原料，還可以制備多種重要精細化工產(chǎn)品。目前，被美國能源部列為最具開發(fā)潛力的化工產(chǎn)品之一。傳統(tǒng)制備3-hp是化學合成法，如鄰鹵代醇與氰化鉀作用生成的3-輕基腈，通過水解或Reformatsky反應制得。通過鉑金催化3—羥基丙醛氧化生產(chǎn)3-hp及其鹽的工藝。使用固體酸催化劑ZSM5zeol He水合丙烯酸生產(chǎn)3-hp。采用化學合成法生產(chǎn)，難度較大，且產(chǎn)品分離純化較復雜，生產(chǎn)成本高。
[0003]相比之下，生物方法可以有效地避免這些不利因素，具有成本低、條件溫和等特點。因此，用生物方法制備3-hp，特別是基因工程菌法已成為現(xiàn)代國際上最注目的研究熱點之一。Cargill-Dow公司開發(fā)了利用基因工程菌表達丙氨酸2，3_氨基變位酶，以碳水化合物生產(chǎn)3-hp的工藝。韓國學者近年來對生物法生產(chǎn)3-hp進行了研究:在重組大腸桿菌中表達丙二酰-CoA還原酶、乙酰-CoA脫羧酶、生物素酶以及轉(zhuǎn)氫酶基因，構(gòu)建的基因工程菌可以利用葡萄糖為底物產(chǎn)生1.2 mmol/L的3_hp;構(gòu)建了以甘油為底物的重組大腸桿菌，表達甘油脫水酶和乙醛脫氫酶基因，3-hp產(chǎn)量為0.58 g/L;另外通過敲除甘油脫氫酶以及過表達乙醛脫氫酶基因，重組菌的3-hp產(chǎn)量為2.07 g/L。國內(nèi)江南大學采用類似的思路構(gòu)建了重組大腸桿菌，以甘油為底物，3-hp產(chǎn)量為4.92 g/L，其他有關(guān)生物法生產(chǎn)3-hp的報道還很少。
[0004]由于構(gòu)建基因工程菌涉及到多種基因，并且這些基因在宿主細胞中的穩(wěn)定性、酶的活性表達以及細胞代謝流量調(diào)控等在實際生產(chǎn)中面臨著巨大挑戰(zhàn)，仍有許多技術(shù)問題有待解決。目前報道的能夠利用甘油生產(chǎn)3-hp的天然菌較少，產(chǎn)量較低。已知的可發(fā)酵生產(chǎn)3-hp的野生菌株主要有:Han-senuamiso、Fusarium meri smoides、Candida rugosa、Byssochlamys sp.、Rhodococcus eryt-hropolis LG12和Klebsiella terrigena等。其中，李冰和裴疆森從自然環(huán)境中篩選可代謝產(chǎn)生3-hp的微生物菌株土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)可以以甘油為唯一碳源生產(chǎn)3_hp，產(chǎn)酸能力為1% (10 g/L)，初次實現(xiàn)野生菌種從甘油直接轉(zhuǎn)化生成3-hp。
[0005]范俊英選育得到一株3-HP高效合成菌株，他們以采集的土壤及糞便樣品為研究材料，從中篩選得到一株能夠利用丙酸發(fā)酵生產(chǎn)3-HP的酵母Y-1l，經(jīng)生理生化鑒定及18S rDNA序列分析，初步確定篩選的菌株為Candida sp.(假絲酵母)。再以Y_11為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外-亞硝基胍-60Co γ復合誘變，進一步篩選得到了突變性狀穩(wěn)定且可遺傳的高產(chǎn)菌株5-13Β，該菌株3-!^的產(chǎn)量為11.78 g/L，是出發(fā)菌株的2.46倍。這一結(jié)果將微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-ΗΡ的研究提高到新的水平。在如此豐富的微生物資源庫中，由于自然環(huán)境及其它理化條件的差異，仍有很多能產(chǎn)生3-羥基丙酸的微生物未被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在分離到的還只是滄海一粟。因此，產(chǎn)3-羥基丙酸的微生物菌株還需進一步的發(fā)現(xiàn)和研究。
[0006]國際上發(fā)達的國家已經(jīng)實現(xiàn)了生物基轉(zhuǎn)化3-hp的產(chǎn)業(yè)化，且作為生物基平臺生產(chǎn)其它重要精細化工品，已被廣泛應用于醫(yī)藥、生物材料、功能性材料、生物燃料和其它精細化工品等行業(yè)，成為國民經(jīng)濟生產(chǎn)中不可缺少的重要原材料。在國際上，采用微生物轉(zhuǎn)化和工程菌合成3-hp已成主流技術(shù)，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-hp可有效的避免化學合成法所帶來的不利因素，且具有生產(chǎn)周期短，原料豐富，綠色環(huán)保，生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢，可以生產(chǎn)經(jīng)濟價值較高的化學中間體。不斷地進行現(xiàn)有技術(shù)的改進和創(chuàng)新，解決生產(chǎn)中的環(huán)境保護、降低生產(chǎn)成本和擴大產(chǎn)業(yè)化規(guī)模等已成為當今該技術(shù)領域中的研究重點。
[0007]篩選新的3-羥基丙酸產(chǎn)生菌，可豐富生物發(fā)酵法制備3-羥基丙酸菌株的種類，為生物化工和生物發(fā)酵的研究和應用提供依據(jù)，為構(gòu)建3-hp高效工程菌提供新的資源，造福人類，解決能源安全等問題都具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明為構(gòu)建3-羥基丙酸(3-hp)高效工程菌提供新的微生物，具體提供了一株漢遜德巴利酵母菌株，所述的漢遜德巴利酵母菌株為漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyce shanseni1.) IS451，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所;保藏日期:2015年12月18日；保藏號為:CGMCC N0.11893。
[0009]—種如上述所述的漢遜德巴利酵母菌株發(fā)酵制備3-羥基丙酸的方法，按如下方法制備:
步驟I)將漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451菌株接種于斜面培養(yǎng)基中進行活化，30°C恒溫培養(yǎng)24h，取2環(huán)斜面IS451菌株，即用接種環(huán)2次點接斜面菌株；所述的斜面培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖20.00 8/1，酵母浸膏10.00 g/L，蛋白胨 20.00 g/L，瓊脂粉20.00 g/L ο
[0010]再接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL，恒溫振蕩器中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，在30 °C下培養(yǎng)48h，培養(yǎng)至對數(shù)期，制得IS451菌株種子液；
所述的種子培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖，20.00 g/L;酵母浸膏，10.00 g/L；(NH4)2SO4，10.00 g/L；KH2PO4 ,5.00 g/L； K2HPO4,2.00 g/L；MgSO4.7 H2O ,1.00 g/L；FeSO4.7 H2O ,0.03 g/L；TES 5 mL；
步驟2)將步驟I)培養(yǎng)好的IS451菌株種子液按照體積比為10%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH至6.0 ；培養(yǎng)基裝液量為100mL/250mL，恒溫振蕩器中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，30°C，發(fā)酵時間5天，制得發(fā)酵液；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖25.00- 35.00 g/L;酵母膏10.00 g/L5KH2PO4 ,5.00 g/L；K2HPO4 ,2.00 g/L； (NH4)2SO4 ,10.00-25.00 g/L；MgSO4.7H20 ,1.00g/L；FeSO4.7 H20,0.03 g/L;丙酸，10.00-25.00 g/L;甘油，5.00-15.00 g/L;TES，5 mL；步驟3)檢測步驟2)制得的發(fā)酵液中3-羥基丙酸含量；
上述步驟中，所述的TES中各組分及其用量為:HC1，3.65 g/L；H3BO4,0.30 g/L;CuCl2.6H20，0.20 g/L；ZnSO4.7Η20,0.10 g/L；MnSO4 ,0.03 g/L；NaMoO4.2KH2P04,0.03 g/L；NiCl2.6H20,0.02 g/L；CuSO4.5H20,0.01 g/L。
[0011]所述的步驟2)中發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分及其用量進一步優(yōu)化為:葡萄糖30.00g/L；酵母膏 10.00 g/L；KH2PO4,5.00 g/L；K2HPO4,2.00 g/L; (NH4)2SO4,15.00 g/L；MgSO4.7H20,
1.00g/L；FeSO4.7 H20,0.03 g/L;丙酸，15.00 g/L;甘油，10.00 g/L;TES，5 mL；
所述的 TES 中各組分及其用量為:HC1，3.65 g/L ； H3BO4,0.30 g/L; CuCl2.6H20，0.20g/L；ZnSO4.7H20,0.10 g/L；MnSO4 ,0.03 g/L；NaMoO4.2KH2P04,0.03 g/L;NiCl2.6H2O，0.02 g/L；CuSO4.5H20,0.01 g/L。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
本發(fā)明有益效果:
本發(fā)明從果園土壤及人類糞便中篩選出一株高產(chǎn)3-羥基丙酸的漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451，該菌株適應能力較強，繁殖快，生產(chǎn)周期短;具有發(fā)酵培養(yǎng)原料豐富多樣，價廉的同時還環(huán)保，同時能夠連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢;在最優(yōu)培養(yǎng)方案下，該菌株發(fā)酵產(chǎn)3-羥基丙酸的量高達48.96 g/L，比文獻報道微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸含量高出3倍多，該菌株具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0012]圖1是漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451菌株的細胞形態(tài)圖；
圖2是漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451菌株菌落形態(tài)；
圖3是漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451菌株的PCR擴增結(jié)果；
圖4是漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位分析；
圖5是3-羥基丙酸標品HPLC圖；
圖6是本實施例2發(fā)酵條件下漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451產(chǎn)3-羥基丙酸含量的HPLC圖；
圖7是本實施例3發(fā)酵條件下漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451產(chǎn)
3-羥基丙酸含量HPLC圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法和效果作進一步說明。
[0014]實施例1:漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451菌株的分離篩選與純化
漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451菌株的樣品米集:主要來源于果園采集回來的土壤以及獲取的人類糞便樣品中分離得到。
[0015]其篩選分離的方法為:將從果園采集回來的土壤以及獲取的人類糞便少量樣品分別浸泡于無菌生理鹽水中，靜置12 h;12 h后將菌懸液進行梯度稀釋，其梯度稀釋濃度依次為I O-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9;稀釋后的菌懸液，待轉(zhuǎn)移； 配制丙酸含量(V/ν)為0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%的篩選培養(yǎng)基，并用pH計調(diào)節(jié)pH值為6.0，滅菌后，倒平板，每個平板篩選培養(yǎng)基的量控制在10 mL，冷卻后即為篩選平板；
用移液槍分別吸取0.2 mL稀釋后的菌懸液接種在已冷卻的篩選平板上，并用滅過菌的涂布棒在篩選平板表面輕輕涂布使得樣品分布均勻，每個菌懸液稀釋梯度涂布在不同丙酸含量的篩選平板上；
將已接入菌種稀釋液的篩選平板放在30°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h，觀察微生物生長情況;為進一步得到目的菌株，需要采取劃線分離的方法。將恒溫倒置培養(yǎng)的平板取出，在無菌環(huán)境下，用接種環(huán)挑取其中的單菌落于上述篩選平板上劃線，然后繼續(xù)培養(yǎng)，重復此操作3到5次，每次培養(yǎng)2 d左右，直到出現(xiàn)單一菌落為止。
[0016]所述的篩選培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.00，酵母浸膏10.00，(NH4)2SO4 10.0OjKH2PO4
5.00,K2HPO42.00,MgSO4.7 H2O 1.00,FeSO4.7 H2O 0.03,TES 5 mL。
[0017]所述的斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.00，酵母浸膏10.00，蛋白胨20.00，瓊脂粉
20.00。
[0018]TES(微量元素溶液 g/L):HCl 3.65,H3BO4 0.30, CuCl2.6H2O 0.20, ZnSO4.7H200.10,MnSO4 0.03,NaMoO4.2 KH2PO4 0.03,NiCl2.6H2O 0.02,CuSO4.5Η20 0.01ο
[0019]該菌株顯微鏡下可見菌株菌體為球狀，見圖1;在基礎平板上培養(yǎng)菌落呈現(xiàn)灰白色，為突起球形、表面軟而濕潤，容易挑起，邊緣整齊，見圖2。
[0020]其生理生化特征為:碳源同化葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉;氮源同化硫酸銨，硝酸鉀，硝酸銨;不能同化尿素;適合此酵母菌生長的PH范圍是4.0-6.0，最適生長溫度為30°C。
[0021]經(jīng)過檢測得該菌株18S rDNA序列，如序列表中SEQ ID N0.1所示。
[0022]通過18S rDNA序列分析，PCR擴增圖見圖3，形態(tài)觀察以及生理生化鑒定，確定IS451菌為漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.)，圖4為菌株Debaryomyceshanseni1.1S451的系統(tǒng)發(fā)育樹地位分析。
[0023]實施例2:在最優(yōu)發(fā)酵條件下，Debaryomyces hanseni1.1S451菌株高產(chǎn)3_輕基丙酸情況
所述的漢遜德巴利酵母菌株發(fā)酵制備3-羥基丙酸的方法，按如下方法制備:
步驟I)將漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451菌株接種于斜面培養(yǎng)基中進行活化，30°C恒溫培養(yǎng)24h，取2環(huán)斜面IS451菌株，即用接種環(huán)2次點接斜面菌株；所述斜面培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖20.00 8/1，酵母浸膏10.00 g/L，蛋白胨
20.00g/L，瓊脂粉20.00 g/L ο
[0024]再接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL，恒溫振蕩器中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，在30 °C下培養(yǎng)48h，培養(yǎng)至對數(shù)期，制得IS451菌株種子液；
所述的種子培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖，20.00 g/L;酵母浸膏，10.00 g/L；(NH4)2SO4，10.00 g/L；KH2P04 ,5.00 g/L； K2HPO4,2.00 g/L；MgSO4.7 H2O ,1.00 g/L；FeSO4.7 H2O ,0.03 g/L；TES 5 mL；
所述的 TES 中各組分及其用量為:HC1，3.65 g/L ； H3BO4,0.30 g/L; CuCl2.6H20，0.20g/L；ZnSO4.7H20,0.10 g/L；MnSO4 ,0.03 g/L；NaMoO4.2KH2P04,0.03 g/L;NiCl2.6H2O，0.02 g/L；CuSO4.5H20,0.01 g/L。
[0025]步驟2)將步驟I)培養(yǎng)好的IS451菌株種子液按照體積比為10%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH至6.0 ；培養(yǎng)基裝液量為100111172501^，恒溫振蕩器中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min ,30°C,發(fā)酵時間5天，制得發(fā)酵液；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖30.00 8/1^酵母膏10.00 g/L;ΚΗ2Ρ04，5.00 g/L；K2HPO4,2.00 g/L； (NH4)2SO4jIS-OO g/L；MgSO4.7Η20,1.00 g/L；FeSO4.7 H20,0.03 g/L;丙酸，15.00 g/L;甘油，10.00 g/L;TES，5 mL；
所述的 TES 中各組分及其用量為:HC1，3.65 g/L ； H3BO4,0.30 g/L; CuCl2.6H20，0.20g/L；ZnSO4.7H20,0.10 g/L；MnSO4 ,0.03 g/L；NaMoO4.2KH2P04,0.03 g/L;NiCl2.6H2O，0.02 g/L；CuSO4.5H20,0.01 g/L。
[0026]步驟3)檢測步驟2)制得的發(fā)酵液中3-羥基丙酸含量;用高效液相色譜法(色譜柱:Ecosile C18柱(250 mmX4.6 mm, 5 μπι);流動相:3%甲醇，用H3PO4調(diào) pH至2.0;檢測條件:紫外檢測器210 nm，柱溫35°C，流速0.8 mL/ min，進樣量20 yL)檢測步驟2發(fā)酵液中3-羥基丙酸的含量。此時，Debaryomyces hanseni1.1S451菌株發(fā)酵后3_輕基丙酸的含量達到48.96 g/L ο 3-羥基丙酸標品HPLC圖見圖5，本實施例制備的3-羥基丙酸含量，其HPLC圖，見圖6。
[0027]實施例3:在一般發(fā)酵條件下，Debaryomyces hanseni1.1S451菌株產(chǎn)3_輕基丙酸情況
所述的漢遜德巴利酵母菌株發(fā)酵制備3-羥基丙酸的方法，按如下方法制備:
步驟I)將漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451菌株接種于斜面培養(yǎng)基中進行活化，30°C恒溫培養(yǎng)24h，取2環(huán)斜面IS451菌株，即用接種環(huán)2次點接斜面菌株；所述斜面培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖20.00 8/1，酵母浸膏10.00 g/L，蛋白胨20.00 g/L，瓊脂粉20.00 g/L ο
[0028]再接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL，恒溫振蕩器中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，在30 °C下培養(yǎng)48h，培養(yǎng)至對數(shù)期，制得IS451菌株種子液；
所述的種子培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖，20.00 g/L;酵母浸膏，10.00 g/L；(NH4)2SO4，10.00 g/L；KH2P04 ,5.00 g/L； K2HPO4,2.00 g/L；MgSO4.7 H2O ,1.00 g/L；FeSO4.7 H2O ,0.03 g/L；TES 5 mL。
[0029]步驟2)將步驟I)培養(yǎng)好的IS451菌株種子液按照體積比為10%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH至6.0 ；培養(yǎng)基裝液量為100111172501^，恒溫振蕩器中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min ,30°C,發(fā)酵時間5天，制得發(fā)酵液；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖35.00 g/L;酵母膏10.00 g/L；KH2PO4,5.00 g/L；K2HP04 ,2.00 g/L； (NH4)2SO4 ,10.00 g/L；MgSO4.7H20 ,1.00 g/L；FeSO4.7H20，0.03 g/L;丙酸，10.00 g/L;甘油，5.00 g/L;TES，5 mL；
所述的 TES 中各組分及其用量為:HC1，3.65 g/L ； H3BO4,0.30 g/L; CuCl2.6H20，0.20g/L；ZnSO4.7H20,0.10 g/L；MnSO4 ,0.03 g/L；NaMoO4.2KH2P04,0.03 g/L;NiCl2.6H2O，
0.02 g/L；CuSO4.5H20,0.01 g/L。
[0030]步驟3)檢測步驟2)制得的發(fā)酵液中3-羥基丙酸含量;用高效液相色譜法(色譜柱:Ecosile C18柱(250 mmX4.6 mm, 5 μπι);流動相:3%甲醇，用H3PO4調(diào) pH至2.0;檢測條件:紫外檢測器210 nm，柱溫35°C，流速0.8 mL/ min，進樣量20 yL)檢測步驟2發(fā)酵液中3-羥基丙酸的含量。此時，Debaryomyces hanseni1.1S451菌株發(fā)酵后3_輕基丙酸的含量達到36.39 g/L; 3-羥基丙酸標品HPLC圖見圖5;本實施例制備的3-羥基丙酸含量，其HPLC圖，見圖7。
【主權(quán)項】
1.一株漢遜德巴利酵母菌株，其特征在于:所述的漢遜德巴利酵母菌株為漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451，保藏號為:CGMCC N0.1189302.—種如權(quán)利要求1所述的漢遜德巴利酵母菌株發(fā)酵制備3-羥基丙酸的方法，其特征在于:按如下方法制備: 步驟I)將漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hanseni1.) IS451菌株接種于斜面培養(yǎng)基中進行活化，30°C恒溫培養(yǎng)24h，取2環(huán)斜面IS451菌株，即用接種環(huán)2次點接斜面菌株； 所述的斜面培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖20.00 8/1，酵母浸膏10.00 g/L，蛋白胨20.00 g/L，瓊脂粉20.00 g/L; 再接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL，恒溫振蕩器中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，在30 °C下培養(yǎng)48h，培養(yǎng)至對數(shù)期，制得IS451菌株種子液； 所述的種子培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖，20.00 g/L;酵母浸膏，10.00 g/L；(NH4)2SO4，10.00 g/L；KH2PO4 ,5.00 g/L； K2HPO4,2.00 g/L；MgSO4.7 H2O ,1.00 g/L；FeSO4.7 H2O ,0.03 g/L；TES 5 mL； 步驟2)將步驟I)培養(yǎng)好的IS451菌株種子液按照體積比為10%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH至6.0 ；培養(yǎng)基裝液量為100mL/250mL，恒溫振蕩器中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，30°C，發(fā)酵時間5天，制得發(fā)酵液； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖25.00- 35.00 g/L;酵母膏10.00 g/L5KH2PO4 ,5.00 g/L；K2HPO4 ,2.00 g/L； (NH4)2SO4 ,10.00-25.00 g/L；MgSO4.7H20 ,1.00g/L；FeSO4.7 H20,0.03 g/L;丙酸，10.00-25.00 g/L;甘油，5.00-15.00 g/L;TES，5 mL； 步驟3)檢測步驟2)制得的發(fā)酵液中3-羥基丙酸含量； 上述步驟中，所述的TES中各組分及其用量為:HC1，3.65 g/L；H3BO4,0.30 g/L;CuCl2.6H20，0.20 g/L；ZnSO4.7Η20,0.10 g/L；MnSO4 ,0.03 g/L；NaMoO4.2KH2P04,0.03 g/L；NiCl2.6H20,0.02 g/L；CuSO4.5H20,0.01 g/L。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的漢遜德巴利酵母菌株發(fā)酵制備3-羥基丙酸的方法，其特征在于:所述的步驟2)中發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分及其用量為:葡萄糖30.00 g/L;酵母膏10.00 g/L5KH2PO4,5.00 g/L；K2HP04,2.00 g/L ； (NH4)2SO4,15.00 g/L； MgSO4.7Η20,1.00 g/L；FeSO4.7 H20,0.03 g/L;丙酸，15.00 g/L;甘油，10.00 g/L;TES，5 mL； 所述的TES中各組分及其用量為:HC1，3.65 g/L；H3BO4,0.30 g/L;CuCl2.6Η20，0.20 g/L;ZnS04.7H20，0.10 g/L；MnSO4 ,0.03 g/L；NaMoO4.2KH2P04,0.03 g/L;NiCl2.6H20，0.02g/L；CuSO4.5H20,0.01 g/Lo
【文檔編號】C12N1/16GK105861341SQ201610238663
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月18日
【發(fā)明人】王陶, 儲淵明, 李文, 董玉瑋, 高明俠, 張傳麗, 陳宏偉
【申請人】徐州工程學院