一種同管檢測htlv-i和htlv-ii前病毒的引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒I型和II型前病毒的引物和方法，包括檢測HTLV-I前病毒的特異性引物及探針和檢測HTLV-II前病毒的特異性引物及探針，并在同一PCR管中按合理的濃度比加入上述兩種引物及探針，并通過已優(yōu)化的Real-timePCR反應(yīng)條件對樣本進(jìn)行檢測。本檢測方法在血清學(xué)變化之前即可檢測是否有HTLV感染，大幅度縮短了窗口期，同時(shí)相對于常規(guī)的血清學(xué)檢測方法具有檢測周期短，特異性高，準(zhǔn)確度高，靈敏度高，條件依賴少，污染風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)點(diǎn)。檢測結(jié)果有助于監(jiān)測患者HTLV前病毒載量的變化及限制HTLV病毒的傳播。
【專利說明】—種同管檢測HTLV-1和HTLV-1 I前病毒的引物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種同管檢測HTLV-1和HTLV-1I前病毒的引物和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人類T 淋巴細(xì)胞白血病病毒(Human T-cell lymphotropic virus, HTLV)是 1980年美國人Gallo首先從皮膚型T細(xì)胞淋巴瘤患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一種人類逆轉(zhuǎn)錄病毒，按基因組學(xué)及血清學(xué)反應(yīng)可分為I型(HTLV-1)和2型(HTLV-1I)。該病毒為球型顆粒，內(nèi)部由RNA核蛋白及圍繞在外的20面體蛋白衣殼組成，最外層具有包膜結(jié)構(gòu)，表面鑲嵌有糖蛋白。目前全世界大約1000到2000萬人感染HTLV病毒，而在我國的北京、廣西、江西、新疆、柳州、合肥和四川等10多個(gè)省市已發(fā)現(xiàn)了 HTLV感染病例，同時(shí)某些沿海地區(qū)也出現(xiàn)了局部小規(guī)模流行。
[0003]HTLV感染細(xì)胞主要通過細(xì)胞間感染的方式，游離病毒顆粒是沒有感染能力的。HTLV感染細(xì)胞與未感染細(xì)胞建立突觸，進(jìn)而使病毒蛋白和RNA染色體組進(jìn)入靶細(xì)胞。通過逆轉(zhuǎn)錄酶使病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時(shí)這種前病毒DNA被整合到宿主細(xì)胞，最終引起成人T細(xì)胞白血病、熱帶痙攣性癱瘓及其他相關(guān)神經(jīng)疾病的產(chǎn)生。
[0004]HTLV病毒的傳播途徑主要有輸血傳播、母乳傳播及性傳播三種，而迄今有效的治療藥物和預(yù)防性疫苗尚未研制成功。因此，唯一積極的控制辦法就是及時(shí)發(fā)現(xiàn)HTLV感染者，并采取措施切斷其傳播途徑。
[0005]目前較為常用的檢測方法是采用ELISA法檢測HTLV抗體，其它還有間接免疫熒光法、蛋白印跡試驗(yàn)及重組免疫印記等。但研究顯示并非所有的HTLV感染者都會(huì)產(chǎn)生抗體，且血液標(biāo)本中尚存在單細(xì)胞感染，因此血清學(xué)檢測存在一些假陽性和假陰性問題，特異性較差，無法很好地解決上述問題。本檢測方法在血清學(xué)變化之前即可檢測是否有HTLV感染，大幅度縮短了窗口期，同時(shí)相對于常規(guī)的血清學(xué)檢測方法具有檢測周期短，特異性高，準(zhǔn)確度高，靈敏度高，條件依賴少，污染風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)點(diǎn)。檢測結(jié)果將有助于臨床篩選，監(jiān)測患者HTLV前病毒載量的變化及限制HTLV病毒的傳播。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測HTLV-1和HTLV-1I前病毒的引物，包括檢測HTLV-1前病毒的特異性引物(SEQ NOl和SEQ N02)及探針(SEQ N03)和檢測HTLV-1I前病毒的特異性引物(SEQ N04和SEQ N05)及探針(SEQ N06)，其中:
(i)檢測HTLV-1前病毒的特異性引物及探針:
SEQ NOl: CCCATTGGCTCCTGTGAAAG ；
SEQ N02: TTGAGACAGCGCCACGAAC ；
SEQ N03 JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(?)檢測HTLV-1I前病毒的特異性引物及探針:SEQ N04: TTGCCATACCTGTCAAACCATC ；
SEQ N05: CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC ；
SEQ N06:FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
[0007]進(jìn)一步地，在檢測HTLV-1和HTLV-1I前病毒時(shí)，所述的引物同時(shí)被使用，并被放置在同一個(gè)反應(yīng)管中。
[0008]進(jìn)一步地，在總反應(yīng)體積為25ul時(shí)，引物和探針的使用量為:引物SEQ NOU SEQNO 2、SEQ N04、SEQ NO 5 各 0.6ul、探針 SEQ N03 和 SEQ NO 6 各 0.3 ul。
[0009]進(jìn)一步地，所述的引物參與的反應(yīng)程序?yàn)?5°C 5min預(yù)變性；95°C 15s，59°C 35s循環(huán)40次。
[0010]本發(fā)明還提供一種同管檢測HTLV-1和HTLV-1I前病毒的方法，包括:
(1)提取樣本中的DNA；
(2)以步驟(1)中的DNA作為模板，在同一PCR管同時(shí)加入檢測HTLV-1前病毒的引物及探針和檢測HTLV-1I前病毒的引物及探針，并通過Real-time PCR反應(yīng)對樣本進(jìn)行檢測，其中:
(i)檢測HTLV-1前病毒的特異性引物及探針:
SEQ NOl: CCCATTGGCTCCTGTGAAAG ；
SEQ N02: TTGAGACAGCGCCACGAAC ；
SEQ N03 JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(?)檢測HTLV-1I前病毒的特異性引物及探針:
SEQ N04: TTGCCATACCTGTCAAACCATC ；
SEQ N05: CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC ；
SEQ N06:FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA ；
(3)根據(jù)結(jié)果來分析樣本是否感染HTLV病毒。
[0011]進(jìn)一步地，Real-timePCR 的反應(yīng)體系為 25ul，包括 2*qPCR MIX 12.5ul、引物 SEQNOU SEQ NO 2、SEQ N04、SEQ NO 5 各 0.6ul、探針 SEQ N03 和 SEQ NO 6 各 0.3 ul、滅菌水
7.5ul、DNA 模板 2 ul。
[0012]進(jìn)一步地，Real-timePCR 反應(yīng)程序?yàn)?95°C 5min 預(yù)變性；95°C 15s，59°C 35s 循環(huán)40次。
[0013]進(jìn)一步地，對檢測結(jié)果分析包括:若樣本產(chǎn)生一條擴(kuò)增曲線，且CT值< 38，則樣本為HTLV陽性，且根據(jù)相對應(yīng)的探針，可判斷樣本所感染的HTLV基因型；若樣本未產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，則判定樣本為陰性。
[0014]有益效果:目前較為常用的檢測方法有是ELISA法、間接免疫熒光法、蛋白印跡試驗(yàn)及重組免疫印記等。但并非所有的HTLV感染者都會(huì)產(chǎn)生抗體，且血液標(biāo)本中尚存在單細(xì)胞感染，因此血清學(xué)檢測存在一些假陽性和假陰性問題，特異性較差，無法很好地解決上述問題，而檢測HTLV的核酸檢測方法主要是常規(guī)的PCR法，但操作繁瑣且容易出現(xiàn)假陽性。本發(fā)明的同管檢測方法采用Real-time PCR，在血清學(xué)變化之前即可檢測是否有HTLV感染，大幅度縮短了窗口期，同時(shí)相對于常規(guī)的血清學(xué)檢測和PCR法具有檢測周期短，特異性高，準(zhǔn)確度高，靈敏度高，條件依賴少，污染風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)點(diǎn)。檢測結(jié)果將有助于臨床篩選，監(jiān)測患者HTLV前病毒載量的變化及限制HTLV病毒的傳播。【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是同管real-time PCR檢測體系擴(kuò)增產(chǎn)生的兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線(質(zhì)粒梯度為
10、102、103、104、105、106copies/ul),其中 HTLV-1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 Slope 為-3.41, R2 % 0.996 ；HTLV-1I標(biāo)準(zhǔn)曲線Slope為-3.35, R2 % 0.995。根據(jù)Slope及R2值說明本發(fā)明的同管Real-time體系擴(kuò)增效果理想,最低下限均可達(dá)10 copies/ul。
[0016]圖2是同管real-time PCR檢測體系擴(kuò)增兩種10 copies/ul質(zhì)粒的結(jié)果。
[0017]圖3是樣本A的同管Real-time PCR檢測結(jié)果。由于只產(chǎn)生一條擴(kuò)增曲線，且對應(yīng)探針SEQ N03，CT值< 38。因此A樣本為HTLV-1型。
[0018]圖4是樣本B的同管Real-time PCR檢測結(jié)果。由于只產(chǎn)生一條擴(kuò)增曲線,且對應(yīng)探針SEQ N06, CT值< 38。因此B樣本為HTLV-1I型。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0020]實(shí)施例1 一種同管檢測HTLV-1和HTLV-1I前病毒的引物和試劑盒
用于檢測HTLV-1和HTLV-1I前病毒的引物，包括檢測HTLV-1前病毒的特異性引物(SEQ NOl和SEQ N02)及探針(SEQ N03)和檢測HTLV-1I前病毒的特異性引物(SEQ N04和SEQ N05)及探針(SEQ N06)，其中:
(i)檢測HTLV-1前病毒的特異性引物及探針:
SEQ NOl: CCCATTGGCTCCTGTGAAAG ；
SEQ N02: TTGAGACAGCGCCACGAAC ；
SEQ N03 JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(?)檢測HTLV-1I前病毒的特異性引物及探針:
SEQ N04: TTGCCATACCTGTCAAACCATC ；
SEQ N05: CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC ；
SEQ N06:FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
[0021]在同一 PCR管中加入上述兩種引物及探針，并通過Real-time PCR反應(yīng)條件對樣本進(jìn)行檢測。
[0022]用于檢測HTLV-1和HTLV-1I前病毒的試劑盒，包括DNA提取試劑、PCR擴(kuò)增體系，所述PCR擴(kuò)增體系包括用于檢測HTLV-1和HTLV-1I前病毒的引物，包括檢測HTLV-1前病毒的特異性引物及探針和檢測HTLV-1I前病毒的特異性引物及探針，其中:
(i)檢測HTLV-1前病毒的特異性引物及探針:
SEQ NOl: CCCATTGGCTCCTGTGAAAG ；
SEQ N02: TTGAGACAGCGCCACGAAC ；
SEQ N03 JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(?)檢測HTLV-1I前病毒的 特異性引物及探針:
SEQ N04: TTGCCATACCTGTCAAACCATC ；SEQ N05: CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC ；
SEQ N06:FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA
實(shí)施例2 —種同管檢測HTLV-1和HTLV-1I前病毒的方法
一種同管檢測HTLV-1和HTLV-1I前病毒的方法包括:
(1)提取樣本中的DNA；
(2)以步驟(1)中的DNA作為模板，在同一PCR管中按合理的濃度比同時(shí)加入檢測HTLV-1前病毒的引物及探針和檢測HTLV-1I前病毒的引物及探針，并通過Real-time PCR反應(yīng)對樣本進(jìn)行檢測，其中:
(i)檢測HTLV-1前病毒的特異性引物及探針:
SEQ NOl:CCCATTGGCTCCTGTGAAAG ；
SEQ N02: TTGAGACAGCGCCACGAAC ；
SEQ N03 JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(?)檢測HTLV-1I前病毒的特異性引物及探針:
SEQ N04: TTGCCATACCTGTCAAACCATC ；
SEQ N05: CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC ；
SEQ N06:FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
[0023](3)根據(jù)Real-time PCR結(jié)果來分析樣本是否感染HTLV病毒。
[0024]采用常規(guī)的酚-氯仿提取樣本血液DNA。
[0025]PCR擴(kuò)增方法如下:
一例樣本的總 Real-time PCR 體系為 25ul:包括 2*qPCR MIX 12.5ul、引物 SEQ NOUSEQ NO 2,SEQ N04、SEQ NO 5 各0.6ul、探針 SEQ N03 和 SEQ NO 6 各0.3 ul、滅菌水 7.5ul、DNA 模板 2 ul。
[0026]Real-time PCR 反應(yīng)程序:95°C 5min 預(yù)變性；95°C 15s，59°C 35s 循環(huán) 40 次。
[0027]對樣本檢測結(jié)果分析:若樣本產(chǎn)生一條擴(kuò)增曲線，且CT值< 38，則樣本為HTLV陽性，且根據(jù)相對應(yīng)的探針，可判斷樣本所感染的HTLV基因型；若樣本未產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，則判定樣本為陰性。
[0028]使用該檢測方法中的引物及探針(SEQ NOU SEQ N02、SEQ N03、SEQ NO 4、SEQN05、SEQ N06)進(jìn)行樣本檢測，發(fā)現(xiàn)其相比于現(xiàn)有技術(shù)具有檢測周期短，特異性高，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，條件依賴少，污染風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)也可檢測出10 copies/ul HTLV-1及HTLV-1I，說明本方法具有較好的靈敏度。
[0029]實(shí)施例3:靈敏度測定
分別將重組的HTLV-1質(zhì)粒和HTLV-1I質(zhì)粒梯度稀釋(質(zhì)粒梯度為10、ΙΟ2、ΙΟ3、104、105、106copies/ul)作為模板,依照本發(fā)明所述方法進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。圖1是同管real-time PCR檢測體系擴(kuò)增產(chǎn)生的兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線(質(zhì)粒梯度為10、ΙΟ2、ΙΟ3、ΙΟ4、105、106copies/ul)，其中 HTLV-1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 Slope 為-3.41，R2 為 0.996 ；HTLV-1I 標(biāo)準(zhǔn)曲線 Slope為-3.35，R2為0.995。根據(jù)Slope及R2值說明本發(fā)明的同管Real-time體系擴(kuò)增效果理想，最低下限均可達(dá)10 copies/ul。
[0030]圖2是同管real-time PCR檢測體系擴(kuò)增兩種lOcopies/ulHTLV-Ι質(zhì)粒和HTLV-1I質(zhì)粒的結(jié)果。[0031 ] 實(shí)施例4:臨床樣本檢測
取2份臨床標(biāo)本A和B，經(jīng)本發(fā)明所述方法完成Real-time PCR檢測，檢測結(jié)果如圖3和4所示。
[0032]圖3是樣本A的同管Real-time PCR檢測結(jié)果。由于只產(chǎn)生一條擴(kuò)增曲線，且對應(yīng)探針SEQ N03，CT值< 38。因此A樣本為HTLV-1型。
[0033]圖4是樣本B的同管Real-time PCR檢測結(jié)果。由于只產(chǎn)生一條擴(kuò)增曲線,且對應(yīng)探針SEQ N06, CT值< 38。因此B樣本為HTLV-1I型。
[0034] 利用本發(fā)明所述方法檢測臨床樣本A和B的結(jié)果與ELISA試劑盒比較，兩種方法的結(jié)果完全一樣。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物，包括檢測HTLV-I前病毒的特異性引物(SEQ NOl和SEQ N02)及探針(SEQ N03)和檢測HTLV-1I前病毒的特異性引物(SEQN04 和 SEQ N05)及探針(SEQ N06)，其中: (i)檢測HTLV-1前病毒的特異性引物及探針:
SEQ NOl:CCCATTGGCTCCTGTGAAAG ；
SEQ N02: TTGAGACAGCGCCACGAAC ；
SEQ N03 JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(?)檢測HTLV-1I前病毒的特異性引物及探針:
SEQ N04: TTGCCATACCTGTCAAACCATC ；
SEQ N05: CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC ；
SEQ N06:FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，在檢測HTLV-I和HTLV-II前病毒時(shí)，所述的引物同時(shí)被使用，并被放置在同一個(gè)反應(yīng)管中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，在總反應(yīng)體積為25ul時(shí)，引物和探針的使用量為:引物 SEQ NOU SEQ NO 2、SEQ N04、SEQ NO 5 各 0.6ul、探針 SEQ N03 和 SEQ NO 6各 0.3 Ul0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述的引物參與的反應(yīng)程序?yàn)?5°C5min預(yù)變性；95°C 15s，59°C 35s 循環(huán) 40 次。
5.一種同管檢測HTLV-I和HTLV-II前病毒的方法，其特征在于包括: (1)提取樣本中的DNA； (2)以步驟⑴中的DNA作為模板，在同一PCR管同時(shí)加入檢測HTLV-1前病毒的引物及探針和檢測HTLV-1I前病毒的引物及探針，并通過Real-time PCR反應(yīng)對樣本進(jìn)行檢測，其中: (i)檢測HTLV-1前病毒的特異性引物及探針:
SEQ NOl: CCCATTGGCTCCTGTGAAAG ；
SEQ N02: TTGAGACAGCGCCACGAAC ；
SEQ N03 JOE-TCTCGGACTTTTGCATGGCCTCTCC-TAMARA
(?)檢測HTLV-1I前病毒的特異性引物及探針:
SEQ N04: TTGCCATACCTGTCAAACCATC ；
SEQ N05: CTGAAGAACGGCGCTGATAGTC ；
SEQ N06:FAM-CTTCTCCGGTGCGGTTTCCGTCT-TAMARA ； (3)根據(jù)結(jié)果來分析樣本是否感染HTLV病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，Real-timePCR的反應(yīng)體系為25ul，包括2*qPCR MIX 12.5ul、引物 SEQ NOU SEQ NO 2、SEQ N04、SEQ NO 5 各 0.6ul、探針 SEQ N03和 SEQ NO 6 各 0.3 ul、滅菌水 7.5ul、DNA 模板 2 ul。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，Real-timePCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C 5min預(yù)變性；95°C 15s，59°C 35s 循環(huán) 40 次。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，對檢測結(jié)果分析包括:若樣本產(chǎn)生一條擴(kuò)增曲線，且CT值≤ 38，則樣本為HTLV陽性，且根據(jù)相對應(yīng)的探針，可判斷樣本所感染的HTLV基因型；若樣本未產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，則判定樣本為陰性。
【文檔編號】C12N15/11GK103898239SQ201410084487
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】陳奕磊, 黎洪奮, 王淑一 申請人:上海艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司