菜豆耐低磷脅迫重要基因PvSPX1的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程和生物【技術領域】，具體涉及菜豆耐低磷脅迫重要基因PvSPX1的應用。本發(fā)明公開了菜豆中一個低磷誘導表達的基因PvSPX1的功能和應用，該基因的表達受外源磷濃度的調(diào)控。在菜豆離體毛根中超量表達該基因，還能增強一系列低磷響應基因的表達，并且該基因的表達受轉(zhuǎn)錄因子PvPHR1的正調(diào)控；該基因的功能研究對于解析豆科作物適應低磷脅迫的分子機理有著深遠的研究意義。
【專利說明】菜豆耐低磷脅迫重要基因PvSPXI的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程和生物【技術領域】，具體涉及菜豆耐低磷脅迫重要基因PvSPXl的應用。
【背景技術】
[0002]磷是植物生長必需的營養(yǎng)元素之一，參與了植物體內(nèi)眾多的生理生化反應和新陳代謝，是維持植物生命活動的關鍵物質(zhì)。但是，土壤中的磷肥極容易被土壤固定，從而難以被植物吸收和利用，造成磷肥利用效率低，低磷效已經(jīng)成為限制作物生長和產(chǎn)量提高的主要因素(Vance et al., 2003; Richardson et al., 2009)。研究表明，植物在長期進化中形成了一套應對低磷脅迫的機制，如:改變根的形態(tài)構型(Liao et al.，2001; Liao etal., 2004);增加氫離子和有機酸的釋放(Wang et al., 2010; Tian et al., 2012);增加酸性磷酸酶的分泌和提高根際酸性磷酸酶活力(Liang et al.，2010)等。研究表明，這些生理機制由磷信號網(wǎng)絡調(diào)控，一系列低磷響應基因參與其中。
[0003]以往的研究表明，在磷信號網(wǎng)絡中，含SPX結(jié)構域的蛋白被認為是重要的調(diào)控因子。SPX蛋白家族包含SPX結(jié)構域，其成員在磷信號傳導網(wǎng)絡中的功能陸續(xù)被報道。在擬南芥中和在磷信號傳導網(wǎng)絡中處于下游，分別正調(diào)控和負調(diào)控一些低磷誘導基因(Duan et al.，2008)。此外，J的敲除突變體主根縮短，地上部磷濃度增加，根部磷濃度降低，表明參與調(diào)控了根的形態(tài)和磷的動態(tài)平衡(Duan et al.，2008)。最近的研究表明，水稻OsSPXl是磷信號網(wǎng)絡中的負調(diào)控因子，抑制了 0smR2對0sPT2的正調(diào)控作用(Liu et al., 2010)。同時，也參與了磷動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。實驗證明，在磷充足情況下，過量表達的植株生長矮小，并且在葉部出現(xiàn)磷中毒斑點(Wang etal., 2009a; Wang et al., 2009b)。
[0004]H iPhaseolus vulgaris.L.)是重要的豆科作物之一，同時也是重要的食用豆類之一，占全球食用豆產(chǎn)量的50%(張曉艷等，2007)。菜豆原產(chǎn)于美洲，是當?shù)氐闹匾Z食作物；菜豆營養(yǎng)價值也很高，不僅富含蛋白質(zhì)，還含有多種維生素和微量元素(王鵬等，2009)。另外，菜豆還是一種高鉀、高鎂和低鈉食品，是調(diào)節(jié)膳食結(jié)構的優(yōu)質(zhì)食品(張曉艷等，2007;王鵬等，2009)。隨著生物技術的發(fā)展，關于模式植物擬南芥和水稻中的磷信號傳導網(wǎng)絡的研究已經(jīng)逐漸清晰，但豆科作物的磷信號網(wǎng)絡卻鮮有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有豆科作物磷信號網(wǎng)絡研究和應用技術的不足，提供一種菜豆耐低磷脅迫重要基因的應用。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn):
本發(fā)明通過實驗研究發(fā)現(xiàn):菜豆耐低磷脅迫重要基因不僅影響了菜豆根系的生長和菜豆根系周圍的磷濃度，而且超量表達該基因，還能增強一系列低磷響應基因，如 PvPHTl, PvPHT2, Pv4, PvPAPl, PvPAP2, PvPAP3, PvPAP4, PvPAP5, PvPS2:l 和PvLPRl-1ike基因的表達，并且該基因的表達受轉(zhuǎn)錄因子的正調(diào)控。
[0007]因此，本發(fā)明提供了菜豆耐低磷脅迫重要基因在制備促進植物適應酸性土壤制劑中的應用。優(yōu)選地，所述植物為雙子葉豆科植物；更優(yōu)選地，所述雙子葉豆科植物為菜豆。
[0008]本發(fā)明還提供了菜豆耐低磷脅迫重要基因在制備增加植物根部磷濃度的制劑中的應用。優(yōu)選地，所述植物為雙子葉豆科植物；更優(yōu)選地，所述雙子葉豆科植物為菜豆。
[0009]本發(fā)明還提供了菜豆耐低磷脅迫重要基因在制備加強PvPHT2,Pv4, PvPAPl, PvPAP2, PvPAP3, PvPAP4, PvPAP5,和 / 或基因表達的制劑中的應用。
[0010]本發(fā)明還提供了菜豆耐低磷脅迫重要基因在制備抑制基因表達的制劑中的應用。
[0011]其中，所述基因的表達受轉(zhuǎn)錄因子/的正調(diào)控。
[0012]本發(fā)明有益效果:
PvSPXl基因所屬的5ΚΤ基因家族在擬南芥和水稻等雖已被克隆及報道，但其在豆科作物磷信號網(wǎng)絡方面的生物學功能并不清楚。本發(fā)明的基因?qū)Σ硕垢瞪L和磷濃度有顯著的影響，這對闡明5KT基因在豆科作物適應酸性土壤低磷脅迫的生物學功能有著
重要意義。
[0013]本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn):菜豆耐低磷脅迫重要基因不僅影響了菜豆根系的生長和菜豆根系周圍的磷濃度，而且超量表達該基因，還能增強一系列低磷響應基因，如 PvPHTl, PvPHT2, Pv4, PvPAPl, PvPAP2, PvPAP3, PvPAP4, PvPAP5, PvPS2:l 和PvLPRl-1ike基因的表達，并且該基因的表達受轉(zhuǎn)錄因子的正調(diào)控；該基因的功能研究對于解析豆科作物適應低磷脅迫的分子機理有著深遠的研究意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1.PvSPXl融合GFP蛋白在洋蔥表皮細胞的亞細胞定位分析；圖中第一排為轉(zhuǎn)化空載體的洋蔥表皮質(zhì)壁分離前后；緊接著第二排是轉(zhuǎn)化載體的洋蔥表皮質(zhì)壁分離前后；圖為共聚焦顯微鏡下觀察拍攝GFP和-β〒的熒光信號；標尺=50 Mm。
[0015]圖2.不同磷濃度對PvSPXl基因表達的影響；圖A為根部PvSPXl基因的相對表達量；圖B為葉部基因的相對表達量；數(shù)據(jù)采用四次重復的平均值和標準誤；不同字母表示顯著水平/X0.05時，差異顯著。
[0016]圖3.PvSPXl響應低磷脅迫的時空表達模式；圖A為葉部基因的相對表達量；圖B為根部基因的相對表達量；數(shù)據(jù)采用四次重復的平均值和標準誤；不同字母表示顯著水平/X0.05時，差異顯著。
[0017]圖4.PvSPXl在轉(zhuǎn)基因毛根的表達量檢測；用定量PCR檢測基因表達微-PvSPXl表示過量表達的轉(zhuǎn)基因毛根；CK表示轉(zhuǎn)化空載體的轉(zhuǎn)基因株系；數(shù)據(jù)采用四次重復的平均值和標準誤；星號表示基因的相對表達量在過量表達株系和對照之間差異性比較(t-檢驗);**: 0.001^7<0.010
[0018]圖5.過量表達對轉(zhuǎn)基因毛根鮮重和磷濃度的影響；圖A為對照和過量表達PvSPXl轉(zhuǎn)基因毛根在高低磷條件下的表型，標尺=I Cm ;圖B為菜豆毛根在高低磷處理下的鮮重；圖C為菜豆毛根在高低磷處理下的磷濃度；數(shù)據(jù)采用三次重復的平均值和標準誤；星號表示同一性狀中過量表達和對照之間差異性比較(t-檢驗)；*: p<0.05;**: 0.001^7<0.01 ；ns:差異不顯著微-PvSPXl表示過量表達的毛根；CK表示轉(zhuǎn)化空載體的對照菜豆毛根。
[0019]圖6.菜豆毛根在高低磷處理下的形態(tài)和根毛區(qū)比例；圖A為菜豆毛根在高低磷處理下的圖像；圖B為高低磷處理下根毛區(qū)占側(cè)根百分比；每個重復選取10條側(cè)根作進一步分析微-PvSPXl表示過量表達的毛根，CK表示轉(zhuǎn)化空載體的對照菜豆毛根；星號表示顯著水平/X0.05時，差異顯著；ns:差異不顯著。
[0020]圖7.PvSPXl下游基因在對照和過量表達轉(zhuǎn)基因毛根中的表達；圖A為PvPHT2、PvPHTU在對照和過量表達轉(zhuǎn)基因毛根中的相對表達量；圖 B 為 PvPAP3、PvPAP4、PvPAP5、PvLPRl-like、PvPDR2~like 在對照和過量表達轉(zhuǎn)基因毛根中的相對表達量；0X-1和0X-2表示兩個過量表達的轉(zhuǎn)基因菜豆毛根株系；CK表示轉(zhuǎn)化空載體的對照菜豆毛根；數(shù)據(jù)采用四次重復的平均值和標準誤；星號表示下游基因的相對表達量在過量表達毛根株系和對照之間差異性比較(t_ 檢驗)p<S).05; **: 0.001</7<0.01; ***: p<S).0Ol0
[0021]圖8.PvSPXl在對照和超量表達轉(zhuǎn)基因毛根中的表達微-PvPHRl-l、Ol-PvPHRl-2, 0X-/V/%K7-J表示三個過量表達的轉(zhuǎn)基因菜豆毛根株系；CK表示轉(zhuǎn)化空載體的對照菜豆毛 根；數(shù)據(jù)采用四次重復的平均值和標準誤；星號表示基因的相對表達量在過量表達毛根株系和對照的平均值之間差異性比較(t-檢驗)；**:0.0014〈0.01。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設備為本【技術領域】常規(guī)試劑和設備。
[0023]實施例1
發(fā)明人在前期的研究中已經(jīng)克隆得到了菜豆耐低磷脅迫重要基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示；該基因編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO:2所示。
[0024]1.載體的構建
過量表達載體的構建:以菜豆基因型G19833低磷cDNA為模板，用基因特異引物-PYL-F (SEQ ID NO: 3)和-pYL-R (SEQ ID NO:4)擴增出的編碼區(qū)片段，反應條件為94°C，4分鐘；94°C，45秒；58°C，45秒；72°C，I分鐘；35個循環(huán)。將所得片斷插入pMD18-T載體，在16°C連接一小時后轉(zhuǎn)化DH10B，12小時后將陽性克隆搖菌，抽提得到重組質(zhì)粒。用BernH I和#々/ I雙酶切重組質(zhì)粒和pYLRNAi載體，回收酶切片段，將目的基因片段和載體片段用連接試劑盒在16°C進行連接反應，兩小時后轉(zhuǎn)化DH10B，12小時后將陽性克隆搖菌，送樣測序無誤后抽提質(zhì)粒在_20°C保存待用。
[0025]SEQ ID NO:3:GGATCCTATGAAATTCGG
SEQ ID NO:4:ACGCGTTTACTTGGCTGTCTGTTCC
亞細胞定位分析表達載體的構建:以菜豆基因型G19833低磷cDNA為模板，用基因特異引物A^SKO-GFP-F (SEQ ID NO:5)和A^SdZZ-GFP-R (SEQ ID NO:6)擴增出除去終止密碼子的PvSPXl編碼區(qū)片段，反應條件為94°C，4分鐘；94°C，45秒；58°C，45秒；72°C，I分鐘；35個循環(huán)。將所得片斷插入連接到PMD18-T載體，在16°C連接一小時后轉(zhuǎn)化DH10B，12小時后將陽性克隆搖菌，抽提得到重組質(zhì)粒。用油a I取BamH I雙酶切重組質(zhì)粒和pBEGFP載體，回收酶切片段，將目的基因片段和載體片段用連接試劑盒在16°C進行連接反應，兩小時后轉(zhuǎn)化DH10B，12小時后將陽性克隆搖菌，送樣測序無誤后抽提質(zhì)粒在_20°C保存待用。
[0026]SEQ ID NO:5:TCTAGATATGAAATTCGGAAAGAGTC
SEQ ID NO:6:GGATCCCGCTTGGCTGTCTGTTCCAG
2.亞細胞定位及其基因表達模式分析
(I )PvSPXl亞細胞定位分析:通過基因槍轉(zhuǎn)化法，將裝載A^SdZZ-GFP載體和pBEGFP空載體導入洋蔥表皮細胞進行瞬時表達。然后用共聚焦顯微鏡觀察洋蔥表皮細胞的GFP熒光信號。結(jié)果如圖1所示。由結(jié)果可知，-GFP的熒光主要分布于細胞核中，說明蛋白定位于細胞核中。
[0027](2 ) PvSPXl基因的表達模式分析 不同磷濃度對PvSPXl基因表達的影響:
挑選種皮無破損，大小均一的菜豆G19833種子,用3%過氧化氫(H2O2)表面消毒一分鐘，隨后用去離子水沖洗2次，用1/4 Hoagland營養(yǎng)液浸泡半小時，進行紙培催芽。5天后，轉(zhuǎn)移到分別含500 μ MUOO μΜ、50 μ M和5 μ M KH2PO4的營養(yǎng)液。試驗中所用營養(yǎng)液配方為1/2 Hoagland營養(yǎng)液配方，-P處理用K2SO4補充全營養(yǎng)液中KH2PO4的K元素。樣品處理10天后收取RNA樣品和生理指標測定樣品，收樣部位分為地上部和根部，提取根部和葉部RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進一步用定量PCR檢測PvSPXl的表達模式。
[0028]熒光定量PCR參照TAKARA公司(日本)SYBR Green定量試劑盒說明書的方法進行，用 Rotor-Gene 3000 qRT-PCR 系統(tǒng)(Corbett Research,澳大利亞)運行。將 cDNA樣品稀釋100倍作為實時定量PCR反應模板，選取四個待測基因一定會表達的cDNA原液稀釋4倍作為I倍標樣制作標準曲線。20 μ L反應體系為，2X SYBR Green PCR master mix10 μ L，Mili_Q水6.4 yL, 10 μ M正反向引物各0.8 μ L，稀釋的cDNA模板2 μ L0反應程序為95 °C變性I min，然后94 V 15 s，60 V 15 s，72 V 30 s，進行40次循環(huán)。用Real-Time Analysis Software 6.0 (Corbett Research,澳大利亞)計算分析每個樣品的表達量。菜豆的看家基因處’-辦子(SEQ ID NO: 7)取EF-1a-R (SEQ ID NO: 8)作為內(nèi)參。
基因的定量引物為(SEQ ID NO:9)與(SEQ ID NO: 10)。
[0029]SEQ ID NO:7:TGAACCACCCTGGTCAGATT
SEQ ID NO:8:TCCAGCATCACCATTCTTCA
SEQ ID NO:9:GGCAACTCCCCAAGCTGAG
SEQ ID NO:10:AAACCACCCATCTGCAGCG
結(jié)果如圖2所示，隨著磷濃度的增加，的相對表達量逐漸降低，的相對表達量在營養(yǎng)液中的磷濃度為5 μΜ時達到最大值，并隨著磷濃度的增加而逐漸降低。當營養(yǎng)液的磷濃度達到500 μΜ時，幾乎檢測不到的表達。說明受低磷脅迫而增強表達。
[0030]不同低磷處理時間對基因表達的影響:挑選種子，進行表面消毒和紙培催芽，具體操作如上所述。5天后，幼苗轉(zhuǎn)移到1/2Hoagland營養(yǎng)液，生長7天后，幼苗轉(zhuǎn)入含5 μ M KH2PO4的低磷營養(yǎng)液，按試驗設計在塑料面包箱中盛入營養(yǎng)液，蓋上聚苯乙烯泡沫板，將幼苗用海綿條固定在聚苯乙烯泡沫板相應的孔中。樣品分別于低磷處理0、4和8天后收取RNA樣品和生理指標測定樣品，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進一步用定量PCR檢測的表達模式。熒光定量PCR檢測方法同步驟(2)所述。
[0031]結(jié)果如圖3所示，的表達量在低磷處理第四天的葉部顯著增加，的轉(zhuǎn)錄水平在低磷處理第八天的根部和葉部顯著上升，達到檢測時間段的最高值。這些結(jié)果表明PvSPXl能較早地對低磷脅迫作出響應。
[0032]實施例2
1.轉(zhuǎn)基因材料的獲得
將構建好的超量表達載體質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599。挑取陽性克隆接種于相應抗性的YEP培養(yǎng)液，25°C，200 rpm搖菌16小時。用沾有菌液的解剖刀切去胚根，留約3 mm胚軸，將子葉連帶胚軸用沾菌液的解剖刀縱切，用沾菌液的刀口在子葉節(jié)和胚軸輕輕點幾下。子葉切口朝上置于濕潤的滅菌濾紙上，25°C光照培養(yǎng)。3天后將子葉轉(zhuǎn)移到毛根誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)。毛根長出后，將長度大于I cm的毛根切下轉(zhuǎn)移到毛根生長培養(yǎng)基，每星期繼代一次。
[0033]2.轉(zhuǎn)基因材料的檢測
轉(zhuǎn)基因毛根的檢測:轉(zhuǎn)基因毛根經(jīng)潮霉素抗性篩選后，提取該轉(zhuǎn)基因系植株的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進一步用定量PCR檢測超量表達基因的效果。菜豆看家基因處Wa作為參照基因，相對表 達量為目的基因的表達量與看家基因表達量的比值?？醇一虻臋z測引物為SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的檢測引物為SEQ ID NO:9和SEQID NO:10。
[0034]反應體系:包含10 μΜ 上下游引物各 0.6 μ?, 2 X SYBR Green PCR master mix 10μ?，然后用Mil1-Q水補足20 μ?。PCR反應程序為:95 V I分鐘；95 V 15秒，58 V 15秒，72 V 30秒，擴增35個循環(huán)。
[0035]PvSPXl在轉(zhuǎn)基因毛根的表達量檢測如圖4所示，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因毛根中已經(jīng)被顯著地超量表達。
[0036]3.轉(zhuǎn)基因植物中過量表達的功能分析 Cl)過量表達對轉(zhuǎn)基因毛根生長的影響
在磷濃度處理的實驗時，每皿接種約0.2 g鮮重的毛根到+P(l.25 mM KH2PO4)或者-P (O μ M KH2PO4)的MS培養(yǎng)基。每星期繼代一次，生長14天后收樣。毛根鮮重用萬分之一天平測量。每個處理有四個獨立的生物學重復。
[0037]轉(zhuǎn)基因毛根用顯微鏡(LEICA，德國)觀察，用LEICA DFC 480相機進行拍照(LEICA,德國)。轉(zhuǎn)基因毛根的單條側(cè)根掃描后用Win-Rhizo軟件(R6gent Instruments,加拿大)分析根長，每皿取不少于10條側(cè)根。根毛區(qū)標準為I mm根長內(nèi)不少于10條根毛。
[0038]過量表達對轉(zhuǎn)基因毛根鮮重和磷濃度的影響如圖5所示，過量表達的轉(zhuǎn)基因毛根的生物量在高磷和低磷條件下分別降低了 60%和40%，此結(jié)果表明過量表達PvSPXl能顯著抑制根系生長。此外，過量表達的轉(zhuǎn)基因毛根的磷濃度在高磷和低磷條件下分別比對照增加47%和33%，表明是顯著增加根部磷濃度的重要基因。
[0039]菜豆毛根在高低磷處理下的形態(tài)和根毛區(qū)比例如圖6所示，低磷處理下，所有毛根的根毛區(qū)比例都超過80%。但在高磷處理下，CK的根毛區(qū)比例降低超過50%。但是，過量綠PvSPXl的轉(zhuǎn)基因毛根的根毛生區(qū)比例不受增加磷的影響。以上結(jié)果表明，超量表達PvSPXl能增加高磷時根毛區(qū)的比例，PvSPXl參與調(diào)控了低磷脅迫下根系形態(tài)的改變，以適應低磷脅迫。
[0040](2)過量表達對低磷響應基因表達的影響
收獲生長14天后的轉(zhuǎn)基因毛根，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進行低磷響應基因表達量的定量PCR檢測。選取11個低磷響應基因iPSI)作為候選基因，包括PvPHTl (菜豆高親和磷轉(zhuǎn)運子，參與磷吸收，TC27368)，PvPHT2{菜豆低親和磷轉(zhuǎn)運子，參與地上部和根部磷的轉(zhuǎn)運，TC30856)，Pv4{與At4同源，參與調(diào)控地上部和根部磷的轉(zhuǎn)運，CV536419)，五個紫色酸性磷酸酶/^故沒、PvPAP3, PvPAP4 和 /^/W^(BAD05166、CAA04644、AC025293、AAF60317 和 ADK56125)，PvPS2:l (蛋白磷酸酶，EF472460)，PvLPRl-HkeiAtLPRl功能缺失的突變體產(chǎn)生對磷脅迫不敏感，長根的表型，F(xiàn)E710903)和PvPDR2~like ipdr2突變體對低磷脅迫超敏感,產(chǎn)生更短的根，并且在低磷情況下比野生型有更高的磷濃度，TC44308)。
[0041]結(jié)果表明，作57嘆7加強PvPHT2, Pv4, PvPAPl, PvPAP2, PvPAP3,PvPAP4, PvPAP5, PvPS2:l PvLPRl-1ike 的表達，并且負調(diào)控了 PvPDR2_like 基因的表達(圖7)。該結(jié)果表明，在磷信號網(wǎng)絡中是一個正調(diào)控因子，在低磷時
的表達增強，進而通過增強下游基因的表達，加強對低磷脅迫的適應性。
[0042](3 )過量表達PvHIRI對PvSPXl表達的影響 為進一步分析在磷信號網(wǎng)絡中的作用，本實驗在菜豆毛根中過量表達了并通過qRT-PCR技術，分析了 PvPHRl與PvSPXl在轉(zhuǎn)錄水平上的互作關系。結(jié)果顯示，過量表達能顯著增強基因在轉(zhuǎn)基因毛根中的表達，表明在磷信號網(wǎng)絡中處于飛澉，哽PvPHRl的正調(diào)控，初步確定了基因在磷信號網(wǎng)絡中
的位置(圖8)。
【權利要求】
1.菜豆耐低磷脅迫重要基因在制備促進植物適應酸性土壤制劑中的應用。
2.菜豆耐低磷脅迫重要基因在制備增加植物根部磷濃度的制劑中的應用。
3.菜豆耐低磷脅迫重要基因PvSPXl在制備加強PvPHTl，PvPHT2,Pv4, PvPAPl，PvPAP2, PvPAP3,PvPAP4,PvPAP5, PvPS2:l 和 / 或PvLPRl-like 基因表達的制劑中的應用。
4.菜豆耐低磷脅迫重要基因在制備抑制基因表達的制劑中的應用。
5.根據(jù)權利要求1~4中任一項所述的應用，其特征在于，所述基因的表達受轉(zhuǎn)纖子PvPHRl的正調(diào)控。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述植物為雙子葉豆科植物。
7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，所述雙子葉豆科植物為菜豆。
【文檔編號】C12N15/82GK103789342SQ201410004568
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權日:2014年1月6日
【發(fā)明者】田江, 廖紅, 姚祝芳 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學