專(zhuān)利名稱(chēng)：水稻磷饑餓信號(hào)抑制基因OsSPX1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磷代謝調(diào)控因子^6PJ7的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻(O;;mm"wL.)是我國(guó)主要糧食作物之一。磷是植物生長(zhǎng)所必需的大量營(yíng)養(yǎng) 元素之一，磷元素對(duì)水稻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)具有重要意義。
磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育的大量必需元素，在許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中也起到了關(guān)鍵作用，研究 表明磷脅迫信號(hào)在植物中有特異的調(diào)控途徑(Rubio et al., 2001; Hou et al.， 2005)。
由于磷素(P043-， HP042-， H2P04-)在酸性與堿性土壤中的強(qiáng)烈固定作用，使得 土壤中可以被植物吸收利用的有效磷濃度要大大低于其它大量元素，在大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng) 中，土壤有效磷〈0uM，這一濃度要比植物組織器官中的有效磷濃度(5-20mM)低幾個(gè)數(shù) 量級(jí)(Raghothama， 1999)。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了各種適應(yīng)磷脅迫的機(jī)制，包括根 系發(fā)生與根構(gòu)型適應(yīng)，生理代謝適應(yīng)以及與菌類(lèi)共生等等，以此來(lái)提高對(duì)可溶性磷的吸收 和利用效率以及對(duì)固定態(tài)磷的吸收能力。但在作物中(包括水稻)，這種磷脅迫適應(yīng)機(jī)制 的分子途徑還了解不多。
在酵母旦YG1、 2H081和人類(lèi)^PR1蛋白中發(fā)現(xiàn)一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，定名為SPX結(jié)構(gòu)域。 編碼以上三種蛋白的基因參與G蛋白耦聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，并與磷信號(hào)緊密相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基因C^SilW及其在調(diào)控磷信號(hào)中的作用，發(fā)現(xiàn) 并證明了對(duì)抑制水稻磷饑餓信號(hào)具有重要作用的基因O^PX/的功能。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種水稻磷饑餓信號(hào)抑制基因6te5PX/編碼的蛋 白質(zhì)，其具有SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還同時(shí)提供了編碼上述蛋白質(zhì)的基因&5^Z/，其具有SEQIDNO: l所示的核 苷酸序列。
本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了上述基因&5PZ7的用途，用于在植物中模擬磷饑餓信號(hào)。
3作為本發(fā)明的基因&57lO的用途的改進(jìn)，用于提高植物對(duì)磷酸鹽的吸收速率。 作為本發(fā)明的基因&5"尸i7的用途的進(jìn)一步改進(jìn)，植物為水稻。
作為本發(fā)明的基因6fe5Pi7的用途的進(jìn)一步改進(jìn)，以As5Pi7的cDNA片段作為目標(biāo)基因、 以35SpCAMBIA1301作為載體，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因超量表達(dá)，將該基因轉(zhuǎn)入水稻中。 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的-
本發(fā)明利用0^尸義7的cDNA片段作為目標(biāo)基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因超量表達(dá)，將該基因轉(zhuǎn) 入水稻品種日本晴，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出有效磷水平和全磷水平極顯著提高的現(xiàn)象。
磷饑餓信號(hào)抑制基因負(fù)責(zé)植物體內(nèi)磷信號(hào)調(diào)控，對(duì)植物磷元素代謝有重要意義。發(fā)明 人對(duì)水稻基因組及基因注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析[TIGR (hUp:〃菌.tigr.org) ，KOME (http:〃cdna01.dna.affrc.go.iD/cDNA/)]，發(fā)現(xiàn)了水稻中一個(gè)包含SPX domain的基因；水稻 基因組中有若干個(gè)包含SPX結(jié)構(gòu)域的基因，申請(qǐng)人將其中SPX結(jié)構(gòu)域保守程度最高的基因， 命名為(^S尸i7基因。可根據(jù)GeneBank公布的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以水稻日本晴葉 的cDNA為模板，擴(kuò)增得到asS尸;O的全長(zhǎng)cDNA。經(jīng)測(cè)序確定其實(shí)際的cDNA序列，并與網(wǎng) 上公布的cDNA序列和基因組序列用DNAstar的MegAlign軟件比對(duì)分析，以確定其內(nèi)含子 和外顯子的結(jié)構(gòu)。
ft95"尸J7全長(zhǎng)基因組序列為4556bp，全長(zhǎng)cDNA為888bp (如SEQ ID NO: 1所示)， 編碼295個(gè)氨基酸(如SEQ ID NO: 2所示)。該基因包括3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子。本發(fā) 明是通過(guò)PCR方法，從日本晴OsS戶(hù)JO基因的cDNA里擴(kuò)增出一段cDNA干涉的靶序列，使 用干涉載體構(gòu)建方法，最后連接到超量表達(dá)載體35SpCAMBIA1301上。再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化， 在水稻品種日本晴中，超量表達(dá)這個(gè)基因RNAi片段，干涉OW尸Ji7基因的表達(dá)。在轉(zhuǎn)基 因T2代植株中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株中的有效磷和全磷水平都顯著高于野生型植株。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
(1) 本發(fā)明證明了一個(gè)磷饑餓信號(hào)抑制基因OsSPX7的具體作用。申請(qǐng)人在水稻品種 曰本晴中，干涉磷饑餓信號(hào)抑制基因OMilW表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基 因植株地上部中的有效磷水平和全磷水平都顯著高于野生型植株轉(zhuǎn)基因植株中地上部的 有效磷濃度為51.16 nmol Pi/mg FW，是野生型植株的2. 9倍；轉(zhuǎn)基因植株中地上部的全磷 濃度為412.6 nmol P/g DW，是野生型植株的1. 9倍。
(2) 本發(fā)明首次證明了作為水稻中磷饑餓信號(hào)抑制基因OsSPX/的功能，為水稻遺傳 育種或選育磷高效的基因型提供了新的思路。
4(3)本發(fā)明中應(yīng)用的基因可以為水稻等未谷類(lèi)作物以及其它作物的磷元素代謝研究提
供支持。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
圖1是pUCm-T載體示意圖2是pBSSK-in載體酶切位點(diǎn)示意圖3是35S-1300載體酶切位點(diǎn)示意圖。
具體實(shí)施例方式
磷代謝調(diào)控因子負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)植物體內(nèi)磷代謝網(wǎng)絡(luò)，對(duì)植物磷元素代謝有重要意義。申請(qǐng) 人用擬南芥AtSPXl (At5g20150)蛋白序列做blastp
(http:〃rice.plantbiology.msu. edu/blast. shtml)分析，在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)了 AtSPXl 的同源基因L0C—0s06g40120，命名為0sSPXl。根據(jù)Rice Genome Annotation Project公布 的CDS序列設(shè)計(jì)引物，以水稻日本晴葉的cDNA為模板，擴(kuò)增得到^^尸Z/的全長(zhǎng)cDNA。 經(jīng)測(cè)序確定其實(shí)際的cDNA序列，并與網(wǎng)上公布的cDNA序列和基因組序列用DNAstar的 MegAlign軟件比對(duì)分析，以確定其內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)。全長(zhǎng)基因組序列為 4556p， CDS序列為888bp (如SEQIDNO: 1所示)，編碼295個(gè)氨基酸(如SEQIDNO: 2所示)。該基因包括3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子。
本發(fā)明是通過(guò)PCR方法，以水稻品種日本晴的cDNA為模板，擴(kuò)增得到6fe57^7干涉目 的片段。通過(guò)多個(gè)載體轉(zhuǎn)換，把該片段連接到超表達(dá)載體質(zhì)粒35SpCAMBIA1301 (本實(shí)驗(yàn) 改造的載體，能用于基因的超表達(dá)，后面詳細(xì)說(shuō)明了改造過(guò)程)。用農(nóng)桿菌(EHA105由澳 大禾U亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室提供，參見(jiàn)New v4gra6acfeWw/w helper plasmids for gene transfer to plants, 1993， Transgenic Res 2:208-218)介導(dǎo)的方法，在水稻品種日本晴中干涉 基因表達(dá)。觀察轉(zhuǎn)基因植株后代(T2代)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)有效磷和全磷水平顯著上升。
以下實(shí)施例子進(jìn)一步定義本發(fā)明，并描述了分離As5"尸i7基因，遺傳轉(zhuǎn)化，以及磷酸 鹽最大吸收速率測(cè)定方法，有效磷與全磷含量的測(cè)定方法。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施事 例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況 下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實(shí)施例l: fl 57li7基因確定和序列的獲得
申請(qǐng)人用擬南芥AtSPXl (At5g20150)蛋白序列做blastp(http:〃麗.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)分析，在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)了 ^tSPJ7的同源基因 AK072067，命名為fl^尸Z7。根據(jù)GeneBank公布的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以水稻日本 晴葉的cDNA為模板，擴(kuò)增得到^5PJ7的全長(zhǎng)cDNA。經(jīng)測(cè)序確定其實(shí)際的cDNA序列，并 與網(wǎng)上公布的cDNA序列和基因組序列用DNAstar的MegAlign軟件比對(duì)分析，以確定其內(nèi) 含子和外顯子的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2:干涉表達(dá)載體的構(gòu)建
先在pBSSK-in中插入兩個(gè)方向相反的目的片段，然后再將含有目的片段和intron的 片段切下，連入超表達(dá)載體pCAMBIA1301中。步驟如下
1. PCR擴(kuò)增出fl^尸J7基因的一段cDNA干涉的靶序列，不加酶切位點(diǎn)。
2. 將PCR產(chǎn)物與T載體連接，連接好的質(zhì)粒分別用/^t力5湖W/以及尸W 5"W /酶 切得到兩片段。
3. 兩片段(sense,antisense)—同連入pBSSK-in載體，分兩步進(jìn)行。(尸W/與7Vfei/是 同尾酶)，pBSSK-in先用尸W/, 5湖z^/酶切，連上一個(gè)片段后，再yfej'厶&7/酶切， 連另一片段。
4. 用fec厶5^/將兩片段以及intron切下，連入相同酶切的over的35S-1300載體中。
實(shí)施例3:干涉表達(dá)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)
包含Os5PJ/基因干涉耙序列的片段連接到載體35SpCAMBIA1301上后，采用農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的方法，得到轉(zhuǎn)基因的水稻植株，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因具體步驟如下
將得到的正確克隆的質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌(EHA105由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室提供， 參見(jiàn)New爿gro6a"en'ww helper plasmids for gene transfer to plants, 1993， Transgenic Res 2:208-218)介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入到水稻品種日本晴中，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、 篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、煉苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌(EHA105) 介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人報(bào)道的方法(參見(jiàn)Efficient transformation of rice， (2ryz3 sstira ， mediated by y4gi"(96a"erj'咖and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA， 1994， Plant Journal 6:271-282)基礎(chǔ)上 進(jìn)行優(yōu)化。
本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述 (1)試劑和溶液縮寫(xiě)
本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫(xiě)表示如下6-BA
6(6-BenzylaminoPurine， 6-節(jié)基腺嘌呤);CN (Carbenicillin，羧節(jié)青霉素);KT (Kinetin，激動(dòng)素)；NAA(N即thalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic
acid,吲哚乙酸);2， 4-D (2， 4-Dichlorophenoxyacetic acid， 2, 4-二氯苯氧乙酸);
AS (Acetosringone,乙酰丁香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪
蛋白);HN (Hygromycin B，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞砜);
N6max (N6大量元素成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元
素成分溶液)；MSmix (MS微量元素成分溶液) (2)溶液配方
1) N6培養(yǎng)基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10X)配制) 硝酸鉀(KN03) 28. 3克 磷酸二氫鉀(KH2P04) 4.0克
硫酸銨((NH4)2S04) 4.63克 硫酸鎂(MgS04 7H20) 1.85克 氯化鈣(CaCl2 2H20) 1.66克 將上述試劑逐一溶解，然后用蒸熘水定容至1000毫升。
2) N6培養(yǎng)基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制 碘化鉀(KI) 0. 08克
硼酸(H3B03) 0. 16克
硫酸錳(MnS04 4H20) 0. 44克
硫酸鋅(ZnS04 7H20) 0. 15克
將上述試劑在20-25攝氏度下溶解并用蒸餾水定容至1000毫升。
3) 鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)
將3.73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA 2H20)和2. 78克FeS(V 7仏0分別溶解，混 合并用蒸餾水定容至1000毫升，至70'C溫浴2小時(shí)，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 4) 維生素貯存液(按照100X濃縮液配制)
煙酸(Nicotinic acid) 0. l克
維生素B1 (Thiamine HC1) 0. l克
維生素B6 (Pyridoxine HC1) 0. l克
甘氨酸(Glycine) 0. 2克
7肌醇(Inositol) 10克 加蒸餾水定容至1000毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 5) MS培養(yǎng)基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X濃縮液配制)
硝酸銨(NH4N03) 16. 5克
硝酸鉀 19.0克
磷酸二氫鉀 1.7克
硫酸鎂 3.7克
氯化鈣 4.4克
將上述試劑在20-25。C溫度下溶解，并用蒸餾水定容至1 OOO毫升。
6) MS培養(yǎng)基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X濃縮液配制) 硫酸錳(MnS04 4H20) 2.23克
硫酸鋅(ZnS04 7H20 ) 0 . 86克
硼酸(H3B03) 0. 62克
碘化鉀(KI) 0. 083克
鉬酸鈉(Na2Mo04 2H20 ) 0. 02 5克
硫酸銅(CuS04 5H20 ) 0. 00 2 5克
氯化鈷(CoCl2' 6H20) 0.0025克
將上述試劑在20-25°C溫度下溶解，并用蒸餾水定容至1 OOO毫升。
7) 2,4-D貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解 完全后定容至100毫升，于20-25。C溫度下保存。
8) 6-BA貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解 完全后定容至100毫升，20-25。C溫度保存。
9) 萘乙酸(NM)貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解 完全后定容至100毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 10) 吲哚乙酸(IM )貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解
8完全后定容至ioo毫升，4t:保存?zhèn)溆谩?br> 11) 葡萄糖貯存液(0.5克/毫升)的配制
秤取葡萄糖125克，然后用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?br> 12) AS貯存液的配制
秤取AS 0.392克，加入DMSO IO毫升溶解，分裝至l. 5毫升離心管內(nèi)，4。C保存?zhèn)溆谩?br> 13) 1N氫氧化鉀IC存液
秤取氫氧化鉀5.6克，用蒸餾水溶解定容至100毫升，20-25'C溫度保存?zhèn)溆谩?(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方 1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基
N6max母液(取已經(jīng)制備好的10X濃縮液，下同) IOO毫升 N6mix母液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升 Fe2+EDTA貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)IO毫升 維生素貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升
2, 4-D貯存液(取上述制備好的) 2. 5毫升
脯氨酸(Proline) 0. 3克
CH 0.6克
蔗糖 30克
Phytagel 3克
加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到 50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常規(guī)方法滅菌(12rC下滅菌25分鐘，下述 的培養(yǎng)基滅菌方法與本培養(yǎng)基的滅菌方法相同)。
2)繼代培養(yǎng)基
N6max母液(10X) IOO毫升
N6mix母液(100X) IO毫升
Fe2+EDTA JC存液(100X) IO毫升
維生素貯存液(100X) IO毫升
2, 4-D貯存液 2. O毫升
脯氨酸 0.5克
9CH 0.6克
蔗糖 30克 Phytagel 3克
加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到50 毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。 3)預(yù)培養(yǎng)基
N6麗母液(10X)
N6mix母液(100X)
Fe2+EDTA t!:存液(100X)
維生素貯存液(100X)
2， 4-D貯存液
CH
蔗糖
瓊脂粉
12. 5毫升 1.25毫升
2. 5毫升 2.5毫升 0. 75毫升 0. 15克
5克 1.75克
加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。 使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培 養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。
4)共培養(yǎng)基 N6max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe2+EDTA Jt存液(100X) 維生素貯存液(100X) 2, 4-D貯存液 CH 蔗糖 瓊脂粉
12. 5毫升 1.25亳升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 75毫升 0.2克 5克
1.75克
加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。 使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升ASIC存液，分裝倒入培 養(yǎng)皿中(25毫升/每皿)。
105)懸浮培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 5毫升
N6mix母液(100X) 0. 5毫升
Fe2+EDTA lt存液(100X) 0. 5毫升
維生素貯存液(100X) l毫升
2， 4-D IC存液 0. 2毫升
CH 0.08克
蔗糖 2克
加蒸餾水至100毫升，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個(gè)100毫升的三角瓶中，封口，按上 述方法滅菌。
使用前加入l毫升無(wú)菌葡萄糖貯存液和100微升AS貯存液。
6)選擇培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 25毫升
N6mix母液(100X) 2. 5毫升
Fe2+EDTA IC存液(100X) 2. 5毫升
維生素貯存液(100X) 2.5毫升
2， 4-D貯存液 0. 625毫升
CH 0. 15克
蔗糖 7.5克
瓊脂粉 1.75克
加蒸餾水至250毫升，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口，按上述方法滅菌。 使用前溶解培養(yǎng)基，加入250微升HN (50毫克/毫升)和400微升CN (250毫克/毫升) 分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。(注第一次選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為400毫 克/升，第二次及以后選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為250毫克/升)。
7)預(yù)分化培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 25毫升
N6mix母液(100X) 2. 5毫升
Fe2+EDTA JJt存液(100X) 2. 5毫升
維生素貯存液(100X) 2.5毫升6-BA貯存液 0. 5毫升
KT貯存液 0. 5毫升
NAA貯存液 50微升
IAA貯存液 50微升
CH 0. 15克
蔗糖 7.5克
瓊脂粉 1.75克
加蒸餾水至250毫升，1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口，按上述方法滅菌。 使用前溶解培養(yǎng)基，250微升HN (50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫升)，分裝倒 入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。
8)分化培養(yǎng)基
N6max母液(10X) IOO毫升
N6mix母液(100X) IO毫升
Fe2+EDTA ]C存液(100X) IO毫升
維生素貯存液(100X) IO毫升
6-BA貯存液 2毫升
KT貯存液 2毫升
NAA Jt存液 0. 2毫升
IAA lt存液 0. 2毫升
C H l克
蔗糖 30克
Phytagel 3克
加蒸餾水至900毫升，1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. 0。
煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上
述方法滅菌。
9)生根培養(yǎng)基
MSmax母液(10X) 50毫升
MSmix母液(100X) 5毫升
Fe2+EDTA |￡存液(100X) 5毫升
12維生素貯存液(100X) 5毫升 蔗糖 20克 Phytagel 3克 加蒸餾水至900毫升，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。
煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方 法滅菌。
(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟(EHA105由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室提供) 4. 1愈傷誘導(dǎo)
1) 將成熟的日本晴水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯化 汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；
2) 用滅菌水洗種子4-5次；
3) 將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；
4) 將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25土rC。 4. 2愈傷繼代
挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，
溫度25土rc。
4. 3預(yù)培養(yǎng)
挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25土1。C。
4. 4農(nóng)桿菌培養(yǎng)
1) 在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基(LA培養(yǎng)基的配制參照J(rèn).薩姆布魯克等，分子 克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，2002，北京)上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌 f朋7。5 (該菌株來(lái)自CAMBIA公司公開(kāi)使用的農(nóng)桿菌菌株)兩天，溫度28。C;
2) 將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28t:搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。 4. 5農(nóng)桿菌侵染
1) 將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅好菌的瓶子內(nèi)；
2) 調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD咖0. 8-1. 0;
3) 將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；
4) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20
13°C。
4. 6愈傷洗漆和選擇培養(yǎng)
1) 滅菌水洗滌愈傷至看不見(jiàn)農(nóng)桿菌；
2) 浸泡在含400毫克/L羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；
3) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；
4) 轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周。 4.7分化
1) 將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上于黑暗處培養(yǎng)5-7天；
2) 轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26。C。 4.8生根
1)剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根； 然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。
4.9移栽
洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保 持水分濕潤(rùn)。
轉(zhuǎn)化粳稻品種日本晴，得到轉(zhuǎn)基因單株T。代植株。用southern檢測(cè)拷貝數(shù)，用 northern檢測(cè)基因在植物體內(nèi)的表達(dá)量。在利用GUS染色的方法找到純合植株，最終得 到單拷貝、超表達(dá)的純合植株，并且進(jìn)行繁殖，得到L和T2代轉(zhuǎn)基因植株。
實(shí)施例4: Os57^7干涉轉(zhuǎn)基因植株的功能鑒定
測(cè)定了 T2代轉(zhuǎn)基因植株有效磷濃度和全磷濃度，發(fā)現(xiàn)T2代轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因植株和其對(duì)
應(yīng)的野生型植株相比，有效磷濃度和全磷濃度顯著高于野生型對(duì)照。這同時(shí)也證明了干涉 該基因表達(dá)可以通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化來(lái)大大提高對(duì)磷酸鹽的累積。
1、有效磷濃度的測(cè)定方法 樣品處理方法步驟如下-
1. 將新鮮植株先用自來(lái)水洗滌，在用蒸餾水沖洗，然后用吸水紙擦干。
2. 取0.5克鮮樣用液氮研磨成粉末，在4'C放置(冰上或者冰箱)至樣品凍融，加入lml 10免(w/v)的高氯酸(PCA)研磨均勻。
3. 勻漿液用5M(w/v)的高氯酸(PCA)稀釋10倍，于冰上放置30分鐘。
4. 于4"， 10000g離心10分鐘，上清液用于有效磷含量的測(cè)定(鉬銻抗法，詳見(jiàn)全磷測(cè)定方法)。
5. 取2ml工作溶液與lml樣品上清液混合，于4(TC溫育20分鐘。
6. 反應(yīng)液在冰上冷卻后，于820nm可見(jiàn)光波長(zhǎng)下測(cè)定吸收值。如樣品濃度過(guò)高，應(yīng)適當(dāng) 稀釋?zhuān)蛊銸D值落在標(biāo)線的線性范圍內(nèi)。
磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
1. 磷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制(60ppm P):溶解0.230g磷酸二氫銨(NH4H2P04)于100ml蒸餾水 中，即得600 ppmP的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將600 ppmP的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液用提取劑稀釋10倍， 得60ppmP的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將60ppmP的標(biāo)準(zhǔn)磷溶液用提取劑稀釋?zhuān)謩e制成0. 6、 1. 2、 2. 4、 3. 6、 4. 8和6ppmP的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。提取劑用10%(w/v)的高氯酸和5%(w/v)的高氯酸按體 積比l:9混合配制。用提取劑與工作溶液的反應(yīng)液作空白。
3. 所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如下表1所示(2. 5ml石英比色皿，光程lcm， BACKMAN DU460分光光度 計(jì))
表l、植物有效磷測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線
配制標(biāo)液體 積所需母液體 積PPM終濃度PPM (稀釋3倍)0D820
1 ml10 10.60.20. 1625
1 ml20 11. 20.40. 3256
1 ml40 12.40.80. 6808
1 ml60 13.61.21.0128
1 ml80 14,81.61.3637
1 ml100 16.02.01. 7171
Y=0. 8634X-0. 0151 R2=0.9999 (Y=0D820， X=PPM Pi) 植物有效磷(Pi)含量(mg Pi/g FW)WD值"V/m^ (V2/V1)*C OD值一換算后待測(cè)液中磷的質(zhì)量濃度(PPM: mg/L)
V —樣品制備溶液的ml數(shù)，即樣品所加提取劑的體積(此為O.OIL) m —樣品鮮重(g)(根據(jù)實(shí)際稱(chēng)得的質(zhì)量計(jì)算)
VI —吸取反應(yīng)所用體積(lml) V2 —反應(yīng)液總體積數(shù)(3ml)
15C 一樣品的稀釋倍數(shù)(如果樣品濃度過(guò)高，需稀釋至lml后再反應(yīng)) 2、全磷濃度的測(cè)定方法
1. H2S04-他02消煮稱(chēng)取植物樣品0. 3 0. 5 g (準(zhǔn)至0. 0002 g)放入100 ml消煮管中， 加入1 ml蒸餾水濕潤(rùn)，加入4 ml濃，分兩次各加入2 ml，每次加入后搖勻，待反 應(yīng)結(jié)束后，置于消煮爐上加熱消煮，待H2S04發(fā)白煙，溶液成褐色時(shí)，停止加熱，(一 般18(TC， 30min， 270。C， 30min， 360°C, 30min)，冷卻至瓶壁不燙手，加入論2ml， 繼續(xù)加熱消煮約5 10min，冷卻，再加入H202 2 ml消煮，如此反復(fù)至溶液呈無(wú)色或 清亮后(一般加H2O2總量約8~10 ml)，再繼續(xù)加熱5 10min，以除盡剩余的他02。 冷卻，定容。樣品做空白試驗(yàn)。
2. 吸取0.50 1.00ml消煮液于10離心管中，加少量水稀釋?zhuān)?滴二硝基酚指示劑， 滴加6 mol /L NaOH溶液中和至剛呈黃色，再加入0. 5 mol /L稀硫酸溶液調(diào)節(jié)至黃 色剛剛褪去，然后加入鉬銻抗顯色劑1. OOml，加水定容，加蓋搖勻。室溫下放置30mim， 700nm比色。(大量樣品可用酶標(biāo)儀測(cè)定)做空白，以空白溶液為參比調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)。
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確吸取5 mg/L P標(biāo)準(zhǔn)工作溶液O、 0.5、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 8ml，分別 放入50ml容量瓶中，加水至30ml，同上步驟顯色并定容，即得0、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.8mg/L P標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，與待測(cè)液同時(shí)測(cè)定，讀取吸光度。 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程。
全P%=c(P) XVl/mX (V3/V2) X 10-4
式中c(P)——從回歸方程求得的顯色液中磷濃度，tng/L
V3——顯色液體積，ml
V2——吸取測(cè)定的消煮液體積，ml
VI——消煮液定容體積，ml
ra-f爾樣量，g
表2、本發(fā)明克隆的^svSPi7基因千涉轉(zhuǎn)基因T2單株的表現(xiàn)
^ 尸J/轉(zhuǎn)基因 植株葉片野生型葉片6feSFi7轉(zhuǎn)基因 植株根野生型根
有效磷濃度(nmol Pi/rag FW)51.16±7.90**17.42±2.325.42±1.25*3.45±0.29
全磷濃度(nmol P/mg DW)415.6±45.5**215.7±46.9189.5±8.2*
16注釋^表示T2代轉(zhuǎn)基因和野生型植株性狀間t測(cè)驗(yàn)，具有1%顯著性水平上有差異；*表 示T2代轉(zhuǎn)基因和野生型植株性狀間差異t測(cè)驗(yàn)，具有5。/。顯著性水平上有差異。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明 不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表
SEQIDNO: 1
atgaagtttg gaaagagcct gagtagccaa atcgtggaga cgctcccgga gtggcgggac 60 aagttcttgt cgtacaagga tctcaagaag cggctcaagc tgattggtgg gggtgggggt 120 ggggaggaga ggcaggcgaa gcgggcacgc gttgcagcgg atggcggcga ggaggaggcc 180 gccgccgcgg cgatgacgcc cgaggaggcg ggcttcatgc ggctcctgga ggccgagctc 240 gacaagttca actccttctt cgtcgagaag gaggaggaat acatcatccg ccagaaggag 300 ctgcaggaca gggtggcgag ggcggcgggg agggagtcga aggaggagct gatgcgggtg 360 cgcaaggaga tcgtcgactt ccatggcgag atggtgctgc tcgagaacta cagcgccctc 420 aactacaccg gattagttaa gattctcaag aagtatgaca agaggactgg ggctctgate 480 cgtctgcctt tcatccagaa agtgctacag cagcctttct tcaccactga cctcctgtac 540 aagcttgtga aacagtgtga ggccatgctg gaccagcttc taccateaaa cgaactgtct 600 gtatcgagtg aagatgggag aggcgatagc actaacgagg acaagccttc gaatcccagt 660 tcatecttgg ttaatggtgg cactattcca gagttagatg agatcgagta catggaaagc 720 atgtatatga agggcacggt cgcggcgctt aggtctctga aggagatccg aagcggaagc 780 tctactgtta gtgcattctc attaccacct ctccagggcg acagttcgcc agaggagcag 840 caggaactgt ggaataagat tccggtgatt gagcaggccg ccaaatga 888
SEQ ID NO:
Met Lys Phe Gly Lys Ser Leu Ser Ser Gin lie Val Glu Thr Leu 15
Pro Glu Trp Arg Asp Lys Phe Leu Ser Tyr Lys Asp Leu Lys Lys 30
Arg Leu Lys Leu lie Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Arg Gin 45
Ala Lys Arg Ala Arg Val Ala Ala Asp Gly Gly Glu Glu Glu Ala 60
Ala Ala Ala Ala Met Thr Pro Glu Glu Ala Gly Phe Met Arg Leu 75
Leu Glu Ala Glu Leu Asp Lys Phe Asn Ser Phe Phe Val Glu Lys 90
Glu Glu Glu Tyr He lie Arg Gin Lys Glu Leu Gin Asp Arg Val 105
Ala Arg Ala Ala Gly Arg Glu Ser Lys Glu Glu Leu Met Arg Val 120
Arg Lys Glu He Val Asp Phe His Gly Glu Met Val Leu Leu Glu 135
Asn Tyr Ser Ala Leu Asn Tyr Thr Gly Leu Val Lys lie Leu Lys 150Lys Tyr Asp Lys Arg Thr Gly Ala Leu lie Arg Leu Pro Phe lie 165
Gin Lys Val Leu Gin Gin Pro Phe Phe Thr Thr Asp Leu Leu Tyr 180
Lys Leu Val Lys Gin Cys Glu Ala Met Leu Asp Gin Leu Leu Pro 195
Ser Asn Glu Leu Ser Val Ser Ser Glu Asp Gly Arg Gly Asp Ser 210
Thr Asn Glu Asp Lys Pro Ser Asn Pro Ser Ser Ser Leu Val Asn 225
Gly Gly Thr He Pro Glu Leu Asp Glu lie Glu Tyr Met Glu Ser 240
Met Tyr Met Lys Gly Thr Val Ala Ala Leu Arg Ser Leu Lys Glu 255
lie Arg Ser Gly Ser Ser Thr Val Ser Ala Phe Ser Leu Pro Pro 270
Leu Gin Gly Asp Ser Ser Pro Glu Glu Gin Gin Glu Leu Trp Asn 285
Lys lie Pro Val lie Glu Gin Ala Ala Lys 295
19
權(quán)利要求
1、一種水稻磷饑餓信號(hào)抑制基因OsSPX1編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2、 一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因fts5PJ厶其特征在于所述基因具有SEQID NO: l所示的核苷酸序列。
3、 如權(quán)利要求2所述基因&57li7的用途，其特征是用于在植物中模擬磷饑餓信號(hào)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因ft^尸i7的用途，其特征是用于提高植物對(duì)磷酸鹽的吸收速率。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的基因&571W的用途，其特征是所述植物為水稻。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因ft95PJ7的用途，其特征是通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)以O(shè)s67in 的cDNA片段作為目標(biāo)基因、以35SpCAMBIA1301作為載體，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因超量表達(dá)，將該基因轉(zhuǎn) 入水稻中。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻磷饑餓信號(hào)抑制基因OsSPX1編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了編碼上述蛋白質(zhì)的基因OsSPX1，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了上述基因OsSPX1的用途用于在植物中模擬磷饑餓信號(hào)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101497659SQ200910096458
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2009年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月9日
發(fā)明者平 吳, 壽惠霞, 創(chuàng) 王, 黃紅杰 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)