專利名稱：新的人線粒體基質(zhì)gtp:amp磷酸轉(zhuǎn)移酶、其編碼序列及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人線粒體基質(zhì)GTPAMP磷酸轉(zhuǎn)移酶的cDNA序列以及該序列編碼的多肽。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法，以及這些多核苷酸和所述多肽的用途。
眾所周知，在生物體中，能量代謝是由磷酸核苷酸來作為中轉(zhuǎn)站的，比如常見的(ATP/ADP/AMP、GTP/GDP)。它們可以把各種能量反應(yīng)中產(chǎn)生的能量，通過核苷酸的磷酸化轉(zhuǎn)移過來，貯藏于高能磷酸鍵中，然后可以在需要的反應(yīng)中釋放出來，并以核苷酸去磷酸化，或磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移的形式完成能量轉(zhuǎn)移。因而，細(xì)胞中各種磷酸核苷酸的濃度和相互間的比例，就能夠代表細(xì)胞的能量水平?？梢源呋鞣N磷酸核苷酸之間相互轉(zhuǎn)化的調(diào)控酶，實(shí)際上也就可以調(diào)控細(xì)胞的能量代謝。
腺苷酸激酶(Adenylate kinases，簡稱AK)家族就是這樣的調(diào)控酶。這是一個在生物體內(nèi)無處不在的蛋白，它可以在鎂離子的存在下，催化從腺苷一磷酸到腺苷二磷酸的反應(yīng)(J-Biochem-Tokyo.1993 Feb；113(2)200-7.)。經(jīng)過多年的研究，現(xiàn)已將AK家族分為三個大類，分別稱作AK1，AK2，AK3。其中AK1代表胞質(zhì)中的ATPAMP磷酸轉(zhuǎn)移酶；AK2代表線粒體內(nèi)膜空間中的ATPAMP磷酸轉(zhuǎn)移酶；AK3代表線粒體基質(zhì)中的GTPAMP磷酸轉(zhuǎn)移酶(Gene.1991 Nov 15；107(2)313-7.)。每種生物都同時具有這三種腺苷酸激酶，只是不同生物不同組織的表達(dá)量不盡相同，通常AK1水平高時AK2的水平就較低，反之亦然。而AK3的表達(dá)量則始終較高，這似乎表明AK3在這三者中是最為重要的一個(J-Biochem-Tokyo.1993Feb；113(2)200-7.)。
盡管第一個腺苷酸激酶很早就被表現(xiàn)，但對這個家族的研究卻始終沒有間斷過。1984年，Wieland B等人就測定了牛肉-心臟中AK3的氨基酸序列，并討論了AK家族中存在的廣泛的相似性(Eur J Biochem 1984 Sep 3；143(2)331-339.)。1989年，Yamada M等人克隆并鑒定了牛肝中AK3的cDNA順序(J-Biol-Chem.1989 Nov 15；264(32)19192-9.)。1991年，該小組又克隆并鑒定了該AK3的基因順序(Gene.1991 Nov 15；107(2)313-7.)。1992年，Xu-G等人鑒定了人類AK3的cDNA順序(Genomics.1992 Jul；13(3)537-42.)。近年來，在酵母，兔等真核生物體內(nèi)又發(fā)現(xiàn)很多腺苷酸激酶AK的存在。(Mol-Gen-Genet.1992 Jun；233(3)363-71.& Biull-Eksp-Biol-Med.1990 Aug；110(8)148-9.)。迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的腺苷酸激酶數(shù)量已不下六十個之多，但是人類的腺苷酸激酶已克隆的還很少。
然而，在本申請之前，還沒有人公開或發(fā)表過本發(fā)明這種新的腺苷酸激酶家族的成員。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼腺苷酸激酶家族的一個新成員，本發(fā)明的腺苷酸激酶被命名為GTP3P。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的人線粒體GTPAMP磷酸轉(zhuǎn)移酶家族成員，該酶被命名為GTP3P蛋白。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人線粒體GTPAMP磷酸轉(zhuǎn)移酶的方法。
本發(fā)明還提供了GTP3P基因序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人GTP3P蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-684位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-684位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從1-684位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的GTP3P蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有GTP3P蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有GTP3P蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成GTP3P蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-684位的核苷酸序列有至少70％的同源性；
(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成GTP3P蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)GTP3P蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有GTP3P蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為751個核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于1-684位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“GTP3P蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有GTP3P蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中1-684位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框1-684位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中1-684位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-684位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-684位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人GTP3P相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“GTP3P蛋白多肽”指具有GTP3P蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人線粒體GTPAMP磷酸轉(zhuǎn)移酶相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括GTP3P蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與GTP3P DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗GTP3P多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含GTP3P多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括GTP3P多肽的可溶性片段。通常，該片段具有GTP3P多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供GTP3P蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然GTP3P多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括GTP3P多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)GTP3P的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有GTP3P多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼GTP3P的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測GTP3P核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于GTP3P多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對GTP3P DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于GTP3P基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與GTP3P基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制GTP3P蛋白的分子，也包括那些并不影響GTP3P蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的GTP3P基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的GTP3P基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)GTP3P或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷GTP3P功能的抗體以及不影響GTP3P功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用GTP3P基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與GTP3P基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人GTP3P核苷酸序列全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆人載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。當(dāng)然，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明中，GTP3P的cDNA核苷酸序列是如此獲得的以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物5′-ATGGGCGCCGGCCGCAGACTGC-3′和反向引物5′-GCAGCTTCTAAATGCAAGGACTAG-3’，進(jìn)行PCR，獲得751bp的目的片段。經(jīng)鑒定測序后得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的GTP3P cDNA序列與已發(fā)表并確認(rèn)為腺苷酸激酶(AK)的基因序列高度同源，并且本發(fā)明涉及的蛋白具有短鏈醇脫氫酶家族高度保守的氨基酸序列。進(jìn)一步的研究表明，本發(fā)明與已被發(fā)表并確認(rèn)為牛AK3基因具有高度同源性，而已知牛AK3屬于腺苷酸激酶家族的AK3大類。因此，GTP3P基因也屬于AK家族的AK3亞類，是牛AK3基因的一個同源基因，并具有相似的功能。
AK家族在生物體中起著維持磷酸核苷酸組成穩(wěn)定的作用，而在磷酸核苷酸中，最重要的就是腺苷酸(ATP、ADP、AMP)，因此AK家族可以比其它的核苷酸激酶更有效的調(diào)節(jié)能量代謝。事實(shí)上，能量代謝水平上的變化對生物的影響是巨大的，近年來在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的大量腺苷酸激酶，它們在不同組織中發(fā)揮著作用。它們中的任何一個產(chǎn)生了某種缺陷，就會立即導(dǎo)致整個生物體的能量代謝紊亂，嚴(yán)重的將可能導(dǎo)致多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤，還有溶血性貧血(Genomics.1992Jul；13(3)537-42.)。無論在生理上還是病理上，AK家族都已成為人們專注的對象。本發(fā)明的GTP3P可以研究有關(guān)病癥，并為診斷和治療有關(guān)病癥提供了有力的武器。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人GTP3P與牛AK3的核酸序列的同源比較圖。其中，相同的核苷酸用“|”標(biāo)出。
圖2為本發(fā)明的人GTP3P蛋白與牛AK3蛋白的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出，相似的氨基酸用“+”標(biāo)出。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1GTP3P的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴(kuò)增以人腦λ gt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-ATGGGCGCCGGCCGCAGACTGC-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸A25′-GCAGCTTCTAAATGCAAGGACTAG-3’(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR。A1/A2的PCR條件為93℃ 4分鐘，隨之以93℃ 1分鐘、68℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)目的片斷長度為751bp。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⒂肁1、A2擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共751bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于1-684位核苷酸。根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出GTP3P的氨基酸序列，共227個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.4。
實(shí)施例2同源比較和結(jié)構(gòu)研究用GTP3P的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與已被發(fā)表并確認(rèn)為腺苷酸激酶(AK)的基因間存在高度同源的序列，并且本發(fā)明涉及的蛋白具有腺苷酸激酶家族高度保守的氨基酸序列。進(jìn)一步的檢索表明，其在核酸和蛋白水平上與已被公布的牛AK3基因(核酸和蛋白檢索號分別為gb|M25757和sp|P08760)存在同源性，其中它們的核酸序列的CDS間有約85％同一性(又稱相同性)(圖1)，而其蛋白序列間更有91％同一性，94％相似性(圖2)，因此該基因被確認(rèn)為牛AK3基因的同源基因。
此外，由于牛AK3已被鑒定為腺苷酸激酶家族成員，且GTP3P的蛋白質(zhì)序列中具有AK家族的嚴(yán)格保守的標(biāo)志性序列，特別是在GTP3P的氨基酸序列中存在由12個氨基酸組成的被認(rèn)為是腺苷酸激酶家族(AK)共有的特征性序列——(L/I/V/M/F/Y/W)(L/I/V/M/F/Y/W)(L/I/V/M/F/Y/W)DG(FYI)PRX3(NQ)。。在本發(fā)明的蛋白中符合上述模式的序列片段是WLLDGFPRTLPQ(SEQ ID NO.4中82-93位)。因此，這進(jìn)一步證實(shí)了本發(fā)明的GTP3P屬于腺苷酸激酶家族，并且具有腺苷酸激酶家族的相關(guān)功能。
牛AK3編碼的蛋白已被證實(shí)能夠在鎂離子的存在下催化GTP與AMP之間的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，本發(fā)明所涉及的蛋白由于在結(jié)構(gòu)上與牛AK3十分相似，從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定著功能特異性的生物化學(xué)原理，本發(fā)明的GTP3P也應(yīng)有此功能。除此之外，由于GTP3P已被證實(shí)屬于人類腺苷酸激酶家族，所以推測其還同樣具有該家族所具有的一些功能是合理的。如該家族能夠在一定條件下參與TCA循環(huán)中的底物水平磷酸化，和其他一些磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，而GTP3P也應(yīng)有此功能。
研究暗示，本發(fā)明的新蛋白就是一種人類線粒體基質(zhì)GTPAMP磷酸轉(zhuǎn)移酶，屬于腺苷酸激酶家族的AK3亞類，是早先發(fā)現(xiàn)的人類線粒體基質(zhì)GTPAMP磷酸轉(zhuǎn)移酶的同功酶。其功能則與與其高度同源的牛AK3蛋白及AK家族的其它成員相似，如涉及線粒體中腺苷單磷酸酸(AMP)進(jìn)一步的磷酸化反應(yīng)，或與許多過程中的底物水平的磷酸化有關(guān)。牛AK3所催化的反應(yīng)可以用以下方程式來表示MgGTP+AMP  MgGDP+ADP其中MgGTP代表鎂離子結(jié)合的鳥苷三磷酸，MgGDP代表鎂離子結(jié)合的鳥苷二磷酸(Genomics.1992 Jul；13(3)537-42.)。該反應(yīng)是可逆地進(jìn)行的，但主要發(fā)生的是正反應(yīng)方向的轉(zhuǎn)移。
我們已知道，線粒體是生物體能量代謝最主要的場所，著名的三羧酸循環(huán)(TCA)就發(fā)生在線粒體基質(zhì)中，此外還有許多代謝反應(yīng)都發(fā)生在線粒體基質(zhì)中，可以說線粒體是能量活動最頻繁的場所，而如果上述推斷正確的話，本發(fā)明又是線粒體基質(zhì)中參與能量轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵酶，其重要程度可見一斑。
此外，牛AK3的另一個重要特點(diǎn)是以GTP為底物，而不是常見的ATP。這一點(diǎn)在能量代謝中顯得尤為重要，因?yàn)樵诰€粒體基質(zhì)中發(fā)生的三羧酸循環(huán)(TCA)，會產(chǎn)生鳥苷三磷酸(GTP)，而它并不象最常見的腺苷三磷酸(ATP)那樣可以到處通用。相反，過多的GTP積累會影響細(xì)胞的正常生長，故而需要將鳥苷三磷酸中的能量轉(zhuǎn)移到腺嘌呤核苷酸上。這也可能是本發(fā)明所催化的反應(yīng)，它可以把糖代謝中產(chǎn)生的GTP能量轉(zhuǎn)化為通用的能量形式，產(chǎn)生的ADP即可進(jìn)一步用于合成代謝。
由上可知，本發(fā)明所涉及的酶極可能處于能量代謝中的關(guān)鍵一環(huán)，直接關(guān)系到生物的能量平衡。而生物體的能量水平，更直接操縱著生長發(fā)育的旺盛程度、神經(jīng)中樞的興奮程度、以及免疫力的強(qiáng)弱等一系列重要的生命現(xiàn)象。這樣本發(fā)明實(shí)際上提供了一種從能量水平上來改善患者的機(jī)體狀況，提高自身免疫力，進(jìn)而進(jìn)行疾病治療的方法。通過對本發(fā)明的深入研究，一定能發(fā)現(xiàn)它與許多臨床病例的關(guān)系，并最終為解決這些問題開拓新的思維與方法。
本發(fā)明的人GTP3P除了可作為腺苷酸激酶家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人GTP3P還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人GTP3P的N端與牛AK3的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人GTP3P的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
例如，本發(fā)明人GTP3P核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人GTP3P的表達(dá)水平或者抑制人GTP3P的過度表達(dá)。本發(fā)明的人GTP3P蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人GTP3P缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3GTP3P在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，用對應(yīng)于編碼GTP3P的cDNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得GTP3P的cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′TTGGGGATCCATGGGCGCCGGCCGCAGAC-3′(SEQ ID NO.5)該引物含有BamH1限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是由起始密碼子開始的GTP3P編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’-CGTCCTGCAGTCATGGAGTAACTGAAGCT-3’(SEQ ID NO.6)該引物含有PstI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，一個翻譯終止子和GTP3P的編碼序列的19個核苷酸。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和PstI消化pQE-9載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，并測序驗(yàn)證GTP3P的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)達(dá)0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的GTP3P。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫GTP3P。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘?，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小，測得GTP3P的分子量大小約為26kDa。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例4GTP3P在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，用對應(yīng)于編碼GTP3P的cDNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得GTP3P cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5′-TTGGGGATCCATGGGCGCCGGCCGCAGAC-3′(SEQ ID NO.5)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的GTP3P編碼序列的19個核苷酸；
3’端引物序列為5’-CGTCCTGCAGTCATGGAGTAACTGAAGCT-3’(SEQ ID NO.6)該引物含有PstI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個翻譯終止子和GTP3P的編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen公司)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)、一個病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用BamHI和PstI消化pcDNA3載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，并測序驗(yàn)證GTP3P的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小，測得GTP3P的分子量大小約為26kDa。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人GTP3P基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人上海新黃浦復(fù)旦基因工程有限公司(ii)發(fā)明名稱新的人線粒體基質(zhì)GTPAMP磷酸轉(zhuǎn)移酶、其編碼序列及制備方法(iii)序列數(shù)目6(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1ATGGGCGCCG GCCGCAGACT GC 22(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ IDNO2GCAGCTTCTA AATGCAAGGA CTAG 24(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度751bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.31 ATGGGCGCCGGCCGCAGACTGCTGCGAGCGGTGATCATGGGGGCCCCGGGCTCGGGCAAG61 GGCACCGTCTCGTCGCGCATCAGTACACACTTCGAGCTGAAGCACCTCTCCAGCGGGGAC121 CTGCTCCGGGACAACATGCTGCGGGGCACAGAAATTGGCGTGTTAGCCAAGGCTTTCATT181 GACCAAGGGAAACTCATCCCAGATGATGTCATGACTCGGCTGGCCCTTCATGAGCTGAAA241 AATCTCACCCAGTATAGCTGGCTGTTGGATGGTTTTCCAAGGACACTTCCACAGGCAGAA301 GCCCTAGATAGAGCTTATCAGATCGACACAGTGATTAACCTGAATGTGCCCTTTGAGGTC361 ATTAAACAACGCCTTACTGCTCGCTGGATTCATCCCGCCAGTGGCCGAGTCTATAACATT421 GAATTCAACCCTCCCAAAACTGTGGGCATTGATGACCTGACTGGGGAGCCTCTCATTCAG481 CGTGAGGATGATAAACCAGAGACGGTTATCAAGAGACTAAAGGCTTATGAAGACCAAACA541 AAGCCAGTCCTGGAATATTACCAGAAAAAAGGGGTGCTGGAAACATTCTCCGGAACAGAA601 ACCAACAAGATTTGTCCCTATGTATATGCTTTCCTACAAACTAAAGTTCCACAAAGAAGC661 CAGAAAGCTTCAGTTACTCCATGAGGAGAAATGTGTGTAACTATTAATAGTAAGATGGGC721 AAACCTCCTAGTCCTTGCATTTAGAAGCTGC(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度227個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.41 Met Gly Ala Gly Arg Arg Leu Leu Arg Ala Val Ile Met Gly Ala16 Pro Gly Ser Gly Lys Gly Thr Val Ser Ser Arg Ile Ser Thr His31 Phe Glu Leu Lys His Leu Ser Ser Gly Asp Leu Leu Arg Asp Asn46 Met Leu Arg Gly Thr Glu Ile Gly Val Leu Ala Lys Ala Phe Ile61 Asp Gln Gly Lys Leu Ile Pro Asp Asp Val Met Thr Arg Leu Ala76 Leu His Glu Leu Lys Asn Leu Thr Gln Tyr Ser Trp Leu Leu Asp91 Gly Phe Pro Arg Thr Leu Pro Gln Ala Glu Ala Leu Asp Arg Ala106 Tyr Gln Ile Asp Thr Val Ile Asn Leu Asn Val Pro Phe Glu Val121 Ile Lys Gln Arg Leu Thr Ala Arg Trp Ile His Pro Ala Ser Gly136 Arg Val Tyr Asn Ile Glu Phe Asn Pro Pro Lys Thr Val Gly Ile151 Asp Asp Leu Thr Gly Glu Pro Leu Ile Gln Arg Glu Asp Asp Lys166 Pro Glu Thr Val Ile Lys Arg Leu Lys Ala Tyr Glu Asp Gln Thr181 Lys Pro Val Leu Glu Tyr Tyr Gln Lys Lys Gly Val Leu Glu Thr196 Phe Ser Gly Thr Glu Thr Asn Lys Ile Cys Pro Tyr Val Tyr Ala211 Phe Leu Gln Thr Lys Val Pro Gln Arg Ser Gln Lys Ala Ser Val226 Thr Pro(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGGGGATCC ATGGGCGCCG GCCGCAGAC 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6CGTCCTGCAG TCATGGAGTA ACTGAAGCT 29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人GTP3P蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-684位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-684位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸1-684位的序列。
4.一種分離的GTP3P蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有GTP3P蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有GTP3P蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成GTP3P蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-684位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成GTP3P蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)GTP3P蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有GTP3P蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸1-684位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的GTP3P蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說,本發(fā)明提供人線粒體基質(zhì)GTP:AMP磷酸轉(zhuǎn)移酶的cDNA序列以及該序列編碼的多肽。 本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法,以及這些多核苷酸和所述多肽的用途。
文檔編號C07K16/18GK1249340SQ98119439
公開日2000年4月5日 申請日期1998年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月28日
發(fā)明者余龍, 趙勇, 畢安定, 高潔, 趙壽元 申請人:上海新黃浦復(fù)旦基因工程有限公司