改善的真菌選擇的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及構(gòu)建重組真菌宿主細(xì)胞的方法，該重組真菌宿主細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的整合在其基因組中的多核苷酸構(gòu)建體，所述方法包括：用包括編碼選擇性標(biāo)記物的第一多核苷酸和編碼目標(biāo)多肽的第二多核苷酸的整合型多核苷酸構(gòu)建體對真菌宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中第一多核苷酸、其5’非翻譯區(qū)和/或與其可操作地連接的核糖開關(guān)包括在其分支位點(diǎn)和其受體位點(diǎn)之間具有5個(gè)核苷酸或更少的剪接體內(nèi)含子；以及適合的多核苷酸構(gòu)建體，生成的真菌宿主細(xì)胞及制造方法。
【專利說明】改善的真菌選擇
[0001] 對序列表的引巧
[0002] 本申請含有計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，在此將其并入作為參考。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及構(gòu)建重組真菌宿主細(xì)胞的方法，該重組真菌宿主細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè) 拷貝的整合在其基因組中的多核巧酸構(gòu)建體，所述方法包括；用包括編碼選擇性標(biāo)記物的 第一多核巧酸和編碼目標(biāo)多膚的第二多核巧酸的整合型多核巧酸構(gòu)建體對真菌宿主細(xì)胞 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中第一多核巧酸、其5'非翻譯區(qū)和/或與其可操作地連接的核糖開關(guān)包括在 其分支位點(diǎn)和其受體位點(diǎn)之間具有5個(gè)核巧酸或更少的剪接體內(nèi)含子；W及適合的多核巧 酸構(gòu)建體，生成的真菌宿主細(xì)胞及制造方法。

【背景技術(shù)】
[0004] 為了多膚的高產(chǎn)量工業(yè)制造，生物技術(shù)工業(yè)要求提供無抗生素抗性標(biāo)記物的微生 物菌株，其包括若干染色體整合的目標(biāo)基因的拷貝。抗生素標(biāo)記物基因傳統(tǒng)上已用作選擇 攜帶多個(gè)拷貝的標(biāo)記物基因和伴隨的編碼工業(yè)上關(guān)注的多膚的表達(dá)盒的菌株的手段。由于 在拷貝數(shù)和最終的產(chǎn)物產(chǎn)率之間常有直接關(guān)聯(lián)，通過增加微生物制造菌株中的拷貝數(shù)對表 達(dá)盒進(jìn)行擴(kuò)增是所需要的。在過去20年，使用抗生素選擇標(biāo)記物的擴(kuò)增方法已經(jīng)廣泛用于 許多宿主菌株，不考慮單個(gè)表達(dá)盒的表達(dá)水平，其已被證明是在相對短期內(nèi)開發(fā)高產(chǎn)率制 造菌株的非常有效的方式。
[0005] 之前已在芽抱桿菌炬acillus)中顯示，從殘缺的（crippled)低水平啟動(dòng)子表達(dá) 的編碼半乳糖差向異構(gòu)酶的基因可W用作串聯(lián)擴(kuò)增的產(chǎn)物基因拷貝的位點(diǎn)特異性基因組 整合的選擇性標(biāo)記物（W0 2001/90393;NovozmesA/S)。但是，對于真菌宿主細(xì)胞尚未描述 有類似系統(tǒng)。
[0006] 核糖開關(guān)是mRNA分子的一部分，其可W與祀標(biāo)小分子直接結(jié)合而不涉及蛋 白質(zhì)。革E標(biāo)小分子的結(jié)合將會(huì)影響mRNA的翻譯的udlerE，MironovAS(2004)."The r;Lboswitchcontrolofbacterialmetabolism"(細(xì)菌新陳代謝的棱糖開關(guān)控 制）.TrendsBiochemSci29 (1):11 - 7;VitreschakAG,民odionovDA,Mironov AA,GelfandMS(2004)."民iboswitches:theoldestmechanismfortheregulation ofgenee邱ression?"(棱糖開關(guān)：基因表達(dá)調(diào)節(jié)的最古老機(jī)制？）.hendsGenet 20(1):44 - 50;TuckerBJ,BreakerRR(2005)."Riboswitchesasversatilegene controlelements"(作為通用的基因控制元件的棱糖開關(guān)）.CurrOpinStructBiol 15(3) :342 - 8 巧ateyRT(2006)."StructuresofregulatoryelementsinmRNAs".(mRNA 中調(diào)節(jié)元件的結(jié)構(gòu)）CurrOpinStructBiol16(3) :299 - 306]。
[0007] 在絲狀真菌細(xì)胞米曲霉（AspergillusOTyzae)中，化iA和nmtA基因的表達(dá) 受棱糖開關(guān)調(diào)節(jié)，該棱糖開關(guān)結(jié)合硫胺素焦鱗酸（TPP)，并控制可變剪接（alternative splicing)，W有條件地產(chǎn)生上游可讀框（0RF)，從而影響下游基因的表達(dá)。米曲霉化iA棱 糖開關(guān)含有核內(nèi)的前mRNA內(nèi)含子一剪接體內(nèi)含子，其參與促進(jìn)可變剪接。
[0008] 在構(gòu)巢曲霉（Aspergillusni化Ians)中已發(fā)現(xiàn)有另一種絲狀真菌核糖開 關(guān)，其中agaA基因受mRNA精氨酸結(jié)合的調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)可變剪接巧orsuk，P.等人 (2007).'，L-ArginineinfluencesthestructureandfunctionofarginasemRNAin Aspergillusni化Ians". (X-精氨酸影響構(gòu)巢曲霉中精氨酸酶mRNA的結(jié)構(gòu)和功能）Biol Chem. 388:135-144]。
[0009] 為了滿足目前對于無抗生素標(biāo)記物的重組真菌生產(chǎn)宿主菌的需求，我們找尋了產(chǎn) 生多拷貝宿主菌的可能的可選方式。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過改變位于下游基因5'非翻譯區(qū)的剪接體內(nèi)含子中分支位點(diǎn)和受 體位點(diǎn)之間的核巧酸的數(shù)目，可W對剪接效率進(jìn)行調(diào)節(jié)，W提供出人意料的大范圍的下游 基因表達(dá)。野生型內(nèi)含子中核巧酸的數(shù)目為6,發(fā)明人連續(xù)去除每個(gè)核巧酸，直至分支位點(diǎn) 和受體位點(diǎn)實(shí)際上重合一個(gè)核巧酸。內(nèi)含子變體文庫提供了梅異的下游基因表達(dá)水平范 圍，從正常表達(dá)到極低的表達(dá)水平，如下文實(shí)施例所述。發(fā)明人預(yù)計(jì)，對于位于基因編碼序 列內(nèi)的剪接內(nèi)含子來說也是該情況。
[0011] 在要整合到真菌宿主細(xì)胞基因組中的多核巧酸構(gòu)建體中包括選擇性標(biāo)記物該一 背景意義下，低表達(dá)水平尤其引人關(guān)注，因?yàn)樗鼈兪沟脤D(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行選擇成為可能，其 中多核巧酸構(gòu)建體已經(jīng)W多個(gè)串聯(lián)擴(kuò)增的拷貝整合到基因組中。該一選擇成為可能，是因 為當(dāng)在選擇性壓力下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，具有許多拷貝的W充分低的水平表達(dá)的選擇性標(biāo)記物的 那些細(xì)胞將會(huì)相對于拷貝較少的細(xì)胞而言具有生長優(yōu)勢。整合型構(gòu)建體中的表達(dá)盒將與選 擇性標(biāo)記物一起擴(kuò)增，從而確保產(chǎn)物的產(chǎn)率較高。
[0012] 而且，發(fā)明人在此研究的特定剪接體內(nèi)含子位于所謂的核糖開關(guān)一米曲霉的 thiA核糖開關(guān)中，其中其通常參與該基因的前mRNA的可變剪接，從而取決于是否有細(xì)胞需 要的足夠的硫胺素（更準(zhǔn)確地說，硫胺素-焦磯酸，TP巧調(diào)節(jié)其表達(dá)水平。盡管在此產(chǎn)生 的內(nèi)含子變體表現(xiàn)出出人意料地很寬的表達(dá)水平范圍，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，向包括本發(fā)明內(nèi)含子 變體的宿主細(xì)胞中加入TPP經(jīng)由thiA核糖開關(guān)的作用更進(jìn)一步地抑制了表達(dá)水平一在 一些情形中低于檢出水平。
[0013] 因此，在第一方面，本發(fā)明涉及構(gòu)建重組真菌宿主細(xì)胞的方法，該重組真菌宿主細(xì) 胞包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的整合在其基因組中的多核巧酸構(gòu)建體，所述方法包括：
[0014] a)提供用整合型多核巧酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的真菌宿主細(xì)胞，該構(gòu)建體包括編碼選擇性 標(biāo)記物的第一多核巧酸和編碼目標(biāo)多膚的第二多核巧酸，其中該第一多核巧酸、其5'非翻 譯區(qū)和/或與其可操作地連接的核糖開關(guān)包括在其分支位點(diǎn)和其受體位點(diǎn)之間的具有5個(gè) 核巧酸或更少的剪接體內(nèi)含子；
[0015] b)在有益于表達(dá)該選擇性標(biāo)記物的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的真菌宿主細(xì)胞；W及
[0016] C)分離包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的整合在其基因組中的多核巧酸構(gòu)建體的重組真菌 宿主細(xì)胞。
[0017] 在第二方面，本發(fā)明涉及適合于轉(zhuǎn)化到真菌宿主細(xì)胞中并整合到所述細(xì)胞的基因 組中的多核巧酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括：
[0018] a)編碼選擇性標(biāo)記物的第一多核巧酸，其中該第一多核巧酸、其5'非翻譯區(qū)和/ 或與其可操作地連接的核糖開關(guān)包括在其分支位點(diǎn)和其受體位點(diǎn)之間的具有5個(gè)核巧酸 或更少的剪接體內(nèi)含子；和
[0019] b)編碼目標(biāo)多膚的第二多核巧酸。
[0020] 在第H方面，本發(fā)明涉及包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的整合在其基因組中的多核巧酸構(gòu) 建體的重組真菌宿主細(xì)胞，所述構(gòu)建體包括：
[0021] a)編碼選擇性標(biāo)記物的第一多核巧酸，其中該第一多核巧酸、其5'非翻譯區(qū)和/ 或與其可操作地連接的核糖開關(guān)包括在其分支位點(diǎn)和其受體位點(diǎn)之間的具有5個(gè)核巧酸 或更少的剪接體內(nèi)含子；和
[0022] b)編碼目標(biāo)多膚的第二多核巧酸。
[0023] 在最后方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)目標(biāo)多膚的方法，包括：
[0024] a)培養(yǎng)根據(jù)第H方面所述的重組真菌宿主細(xì)胞；和任選地
[00幼 b)回收多膚。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1顯示了下文實(shí)施例的質(zhì)粒pC01sl086的概觀示意圖。
[0027] 圖2顯示了下文實(shí)施例的質(zhì)粒pC01sll24的概觀示意圖。
[0028] 圖3顯示了下文實(shí)施例的質(zhì)粒pCOlsl118的概觀示意圖。
[0029] 圖4顯示了下文實(shí)施例的質(zhì)粒pC01sll26的概觀示意圖。
[0030] 圖5顯示了剪接體內(nèi)含子RNA加工的一般圖示，W及制造為在thiA核糖開關(guān)內(nèi) 含子中在內(nèi)含子分支位點(diǎn)"ctaac"(陰影部分）和內(nèi)含子受體位點(diǎn)"tag"(陰影部分）之 間具有不同距離的8種不同的構(gòu)建體。兩個(gè)位點(diǎn)之間的堿基數(shù)目在2-6bp之間變化，一構(gòu) 建體的受體位點(diǎn)與分支位點(diǎn)重合并形成其一部分，產(chǎn)生序列"ctaacag"，其中分支位點(diǎn)是 "ctaac",受體位點(diǎn)是"cag"。后一變體命名為"內(nèi)含子（-1)"。其他命名為"內(nèi)含子（0)"、 "內(nèi)含子（1)"、"內(nèi)含子（2)"、"內(nèi)含子（3)"、"內(nèi)含子（4)"、"內(nèi)含子城"，最后是"內(nèi)含子 (6)"，其為野生型序列（圖5)，如下表所示：

【權(quán)利要求】
1. 一種構(gòu)建重組真菌宿主細(xì)胞的方法，所述重組真菌宿主細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的 整合在其基因組中的多核苷酸構(gòu)建體，所述方法包括： a) 提供用整合型多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的真菌宿主細(xì)胞，所述構(gòu)建體包括編碼選擇性標(biāo) 記物的第一多核苷酸和編碼目標(biāo)多肽的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸、其5'非翻 譯區(qū)和/或與其可操作地連接的核糖開關(guān)包括在其分支位點(diǎn)和其受體位點(diǎn)之間的具有5個(gè) 核苷酸或更少的剪接體內(nèi)含子； b) 在有益于表達(dá)所述選擇性標(biāo)記物的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的真菌宿主細(xì)胞；以及 c) 分離包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的整合在其基因組中的多核苷酸構(gòu)建體的重組真菌宿主 細(xì)胞；優(yōu)選兩個(gè)或更多個(gè)拷貝；甚至更優(yōu)選三個(gè)或更多個(gè)拷貝，最優(yōu)選四個(gè)或更多個(gè)拷貝。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌宿主細(xì)胞；優(yōu) 選為枝頂孢屬（Acremonium)、曲霉屬（Aspergillus)、短梗霉屬（Aureobasidium)、煙管 菌屬（Bjerkandera)、擬錯(cuò)菌屬（Ceriporiopsis)、金抱子菌屬（Chrysosporium)、鬼傘 屬（Coprinus)、革蓋菌屬（Coriolus)、隱球菌屬（Cryptococcus)、Filibasidium、鎌抱 霉屬（Fusarium)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、稻癌菌屬（Magnaporthe)、毛霉屬（Mucor)、毀 絲霉屬（Myceliophthora)、新美鞭菌屬（Neocallimastix)、脈抱菌屬（Neurospora)、 擬青霉屬（Paecilomyces)、青霉屬（Penicillium)、平革菌屬（Phanerochaete)、白腐 菌屬（Phlebia)、Piromyces、側(cè)耳屬（Pleurotus)、裂裙菌屬（Schizophyllum)、踩節(jié) 菌屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭孢殼屬（Thielavia)、彎頸霉屬 (Tolypocladium)、栓菌屬（Trametes)或木霉屬（Trichoderma)細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述真菌宿主細(xì)胞是酵母宿主細(xì)胞；優(yōu)選為念 珠菌屬（Candida)、漢遜酵母屬（Hansenula)、克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces)、畢赤 酵母屬（Pichia)、酵母屬（Saccharomyces)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)或耶 氏酵母屬（Yarrowia)細(xì)胞，例如，乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)、卡氏酵母 (Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母 (Saccharomyces diastaticus) > Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母（Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母（Saccharomyces norbensis)、卵形酵母（Saccharomyces oviformis) 或解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟（a)中的所述真菌宿主細(xì)胞具有 生長缺陷，并且所述整合型多核苷酸構(gòu)建體在整合到所述宿主細(xì)胞的基因組中時(shí)彌補(bǔ)所述 生長缺陷。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟（a)中的所述真菌宿主細(xì)胞缺乏功能性的硝 酸還原酶或亞硝酸還原酶，并且所述整合型多核苷酸構(gòu)建體分別包括編碼功能性硝酸還原 酶的基因，例如niaD，或編碼功能性亞硝酸還原酶的基因，例如niiA;或者步驟（a)中的所 述真菌宿主細(xì)胞缺乏功能性烯醇化酶，并且所述整合型多核苷酸構(gòu)建體包括編碼功能性烯 醇化酶的基因，例如acuN。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在轉(zhuǎn)化之后所述整合型多核苷酸構(gòu)建體通過非同 源重組而隨機(jī)整合在基因組中。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟（a)中的所述整合型多核苷酸構(gòu)建體在一側(cè) 或兩側(cè)是大小和與所述真菌宿主細(xì)胞基因組中的特異性基因座的序列同源性充足的同源 框，從而使得在轉(zhuǎn)化之后所述整合型多核苷酸構(gòu)建體能夠通過同源重組而位點(diǎn)特異性地整 合到所述基因組中。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述剪接體內(nèi)含子在其分支位點(diǎn)和其 受體位點(diǎn)之間具有4個(gè)核苷酸或更少；優(yōu)選3個(gè)核苷酸或更少；更優(yōu)選2個(gè)核苷酸或更少； 甚至更優(yōu)選1個(gè)核苷酸；再更優(yōu)選所述剪接體內(nèi)含子在其分支位點(diǎn)和其受體位點(diǎn)之間具有 〇個(gè)核苷酸，最優(yōu)選所述剪接體內(nèi)含子的所述分支位點(diǎn)和所述受體位點(diǎn)重合至少一個(gè)核苷 酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述剪接體內(nèi)含子包括選自以下內(nèi)含 子核苷酸序列的核苷酸序列：SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:27、 SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:33、 SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:35、SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:37、SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:39 和 SEQ ID N0:40。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述整合型多核苷酸構(gòu)建體的 所述第一多核苷酸具有與其可操作地連接的核糖開關(guān)；優(yōu)選所述核糖開關(guān)源自米曲霉 (Aspergillus oryzae)中的 thiA 或 nmtA 基因。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述整合型多核苷酸構(gòu)建體的所述 第一多核苷酸編碼選擇性標(biāo)記物乳清酸核苷-5' -磷酸脫羧酶或PyrG。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中由所述整合型多核苷酸構(gòu)建體的所 述第二多核苷酸編碼的目標(biāo)多肽包括酶；優(yōu)選為水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原 酶或轉(zhuǎn)移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、 幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、a -半乳糖苷 酶、￠-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、￠-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露 糖苷酶、變聚糖酶（mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白 水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶或3 -木糖苷酶。
13. -種適合于轉(zhuǎn)化到真菌宿主細(xì)胞中并整合到所述細(xì)胞的基因組中的多核苷酸構(gòu)建 體，所述構(gòu)建體包括： a) 編碼選擇性標(biāo)記物的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸、其5'非翻譯區(qū)和/或 與其可操作地連接的核糖開關(guān)包括在其分支位點(diǎn)和其受體位點(diǎn)之間的具有5個(gè)核苷酸或 更少的剪接體內(nèi)含子；和 b) 編碼目標(biāo)多肽的第二多核苷酸。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌宿主 細(xì)胞；優(yōu)選為枝頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管菌屬、擬錯(cuò)菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋 菌屬、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢霉屬、腐質(zhì)霉屬、稻癌菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭 菌屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、白腐菌屬、Piromyces、側(cè)耳屬、裂裙菌屬、踝 節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬或木霉屬細(xì)胞。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述真菌宿主細(xì)胞是酵母宿主細(xì) 胞；優(yōu)選為念珠菌屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母菌屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或 耶氏酵母屬細(xì)胞，例如，乳酸克魯維酵母、卡氏酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母細(xì)胞。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的多核苷酸構(gòu)建體，其包括編碼功能性硝酸還 原酶的基因，例如niaD，編碼功能性亞硝酸還原酶的基因，例如niiA，或編碼功能性烯醇化 酶的基因，例如acuN。
17. 根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的多核苷酸構(gòu)建體，其在一側(cè)或兩側(cè)是大小和 與所述真菌宿主細(xì)胞基因組中的特異性基因座的序列同源性充足的同源框，從而使得在轉(zhuǎn) 化之后所述整合型多核苷酸構(gòu)建體能夠通過同源重組而位點(diǎn)特異性地整合到所述基因組 中。
18. 根據(jù)權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述剪接體內(nèi)含子在 其分支位點(diǎn)和其受體位點(diǎn)之間具有4個(gè)核苷酸或更少；優(yōu)選3個(gè)核苷酸或更少；更優(yōu)選2個(gè) 核苷酸或更少；甚至更優(yōu)選1個(gè)核苷酸；再更優(yōu)選所述剪接體內(nèi)含子在其分支位點(diǎn)和其受 體位點(diǎn)之間具有0個(gè)核苷酸，最優(yōu)選所述剪接體內(nèi)含子的所述分支位點(diǎn)和所述受體位點(diǎn)重 合至少一個(gè)核苷酸。
19. 根據(jù)權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述剪接體內(nèi)含子包 括選自以下內(nèi)含子核苷酸序列的核苷酸序列：SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:26、 SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、 SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40。
20. 根據(jù)權(quán)利要求13-19中任一項(xiàng)所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述第一多核苷酸具 有與其可操作地連接的核糖開關(guān)；優(yōu)選所述核糖開關(guān)源自米曲霉中的thiA或nmtA基因。
21. 根據(jù)權(quán)利要求13-20中任一項(xiàng)所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述整合型多核苷酸 構(gòu)建體的所述第一多核苷酸編碼選擇性標(biāo)記物乳清酸核苷-5' -磷酸脫羧酶或PyrG。
22. 根據(jù)權(quán)利要求13-21中任一項(xiàng)所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中由所述整合型多核苷 酸構(gòu)建體的所述第二多核苷酸編碼的目標(biāo)多肽包括酶；優(yōu)選為水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂 解酶、氧化還原酶或轉(zhuǎn)移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解 酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯 酶、a -半乳糖苷酶、卩-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a -葡糖苷酶、卩-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆 酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、 蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶或3 -木糖苷酶。
23. -種重組真菌宿主細(xì)胞，其包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的整合在其基因組中的多核苷酸 構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括： a) 編碼選擇性標(biāo)記物的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸、其5'非翻譯區(qū)和/或 與其可操作地連接的核糖開關(guān)包括在其分支位點(diǎn)和其受體位點(diǎn)之間的具有5個(gè)核苷酸或 更少的剪接體內(nèi)含子；和 b) 編碼目標(biāo)多肽的第二多核苷酸。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組真菌宿主細(xì)胞，其包括兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的整合在其 基因組中的多核苷酸構(gòu)建體；甚至更優(yōu)選三個(gè)或更多個(gè)拷貝、最優(yōu)選四個(gè)或更多個(gè)拷貝的 整合在其基因組中的多核苷酸構(gòu)建體。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的重組真菌宿主細(xì)胞，其為絲狀真菌宿主細(xì)胞；優(yōu)選為 枝頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管菌屬、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬、隱球菌 屬、Filibasidium、鐮孢霉屬、腐質(zhì)霉屬、稻癌菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、脈孢菌 屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、白腐菌屬、Piromyces、側(cè)耳屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱 子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬或木霉屬細(xì)胞。
26. 根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的重組真菌宿主細(xì)胞，其為酵母宿主細(xì)胞；優(yōu)選為念珠 菌屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母菌屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或耶氏酵母屬細(xì)胞， 例如，乳酸克魯維酵母、卡氏酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克魯弗 酵母、諾地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母細(xì)胞。
27. 根據(jù)權(quán)利要求23-26中任一項(xiàng)所述的重組真菌宿主細(xì)胞，其中整合型多核苷酸構(gòu) 建體通過非同源重組而隨機(jī)整合到基因組中。
28. 根據(jù)權(quán)利要求23-26中任一項(xiàng)所述的重組真菌宿主細(xì)胞，其中所述整合型多核苷 酸構(gòu)建體通過同源重組而位點(diǎn)特異性地整合到基因組中；優(yōu)選整合到編碼硝酸還原酶或亞 硝酸還原酶的基因中；更優(yōu)選整合到葡糖異生所需的基因中；最優(yōu)選整合到niaD、niiA、 acuN、acuK或acuM基因座中。
29. 根據(jù)權(quán)利要求23-28中任一項(xiàng)所述的重組真菌宿主細(xì)胞，其中所述剪接體內(nèi)含子 在其分支位點(diǎn)和其受體位點(diǎn)之間具有4個(gè)核苷酸或更少；優(yōu)選3個(gè)核苷酸或更少；更優(yōu)選2 個(gè)核苷酸或更少；甚至更優(yōu)選1個(gè)核苷酸；再更優(yōu)選所述剪接體內(nèi)含子在其分支位點(diǎn)和其 受體位點(diǎn)之間具有0個(gè)核苷酸，最優(yōu)選所述剪接體內(nèi)含子的所述分支位點(diǎn)和所述受體位點(diǎn) 重合至少一個(gè)核苷酸。
30. 根據(jù)權(quán)利要求23-28中任一項(xiàng)所述的重組真菌宿主細(xì)胞，其中所述剪接體內(nèi)含 子包括選自以下內(nèi)含子核苷酸序列的核苷酸序列：SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:26,SEQ ID N0:27,SEQ ID N0:28,SEQ ID N0:29,SEQ ID N0:30,SEQ ID N0:3USEQ ID N0:32、SEQ ID N0:33、SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:35、SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:37、SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:39 和 SEQ ID N0:40。
31. 根據(jù)權(quán)利要求23-30中任一項(xiàng)所述的重組真菌宿主細(xì)胞，其中所述整合型多核苷 酸構(gòu)建體的所述第一多核苷酸具有與其可操作地連接的核糖開關(guān)；優(yōu)選所述核糖開關(guān)源自 米曲霉中的thiA或nmtA基因；甚至更優(yōu)選所述核糖開關(guān)包括米曲霉中的thiA或nmtA基 因的核糖開關(guān)；最優(yōu)選所述核糖開關(guān)由米曲霉中的thiA或nmtA基因的核糖開關(guān)組成。
32. 根據(jù)權(quán)利要求23-31中任一項(xiàng)所述的重組真菌宿主細(xì)胞，其中所述整合型多核苷 酸構(gòu)建體的所述第一多核苷酸編碼選擇性標(biāo)記物乳清酸核苷-5' -磷酸脫羧酶或PyrG。
33. 根據(jù)權(quán)利要求23-32中任一項(xiàng)所述的重組真菌宿主細(xì)胞，其中由所述整合型多核 苷酸構(gòu)建體的所述第二多核苷酸編碼的目標(biāo)多肽包括酶；優(yōu)選為水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、 裂解酶、氧化還原酶或轉(zhuǎn)移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水 解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯 酶、a -半乳糖苷酶、卩-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a -葡糖苷酶、卩-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆 酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、 蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶或3 -木糖苷酶。
34. -種生產(chǎn)目標(biāo)多肽的方法，包括： a) 培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求23-33中任一項(xiàng)所述的重組真菌宿主細(xì)胞；和任選地 b) 回收所述多肽。
【文檔編號】C12N15/81GK104395454SQ201380028411
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】C·L·奧爾森 申請人:諾維信公司