灰葡萄孢石竹變種用于制備金納米粒子的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及灰葡萄孢石竹變種(Botrytis cinerea)菌株、其孢子、菌絲、菌絲體、菌核、胞內(nèi)和/或胞外有機分子(如蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂質(zhì)和次級代謝物)用于生物合成金納米粒子(AuNps)的用途。概括地，本發(fā)明涉及灰葡萄孢石竹變種菌株和/或由該生物產(chǎn)生的分子用于生物合成AuNps的用途，并且因此，應用領(lǐng)域是，使用植物病原體真菌灰葡萄孢石竹變種和/或它的單獨地或組合地純化的胞內(nèi)或胞外蛋白質(zhì)或該生物產(chǎn)生的任何其他胞內(nèi)和/或胞外分子作為生物合成系統(tǒng)合成納米材料，尤其是AuNps。金屬納米粒子被用于各種應用，包括：半導體、光致發(fā)光、生物醫(yī)學、醫(yī)學診斷成像、催化劑(分散型及支持型)并且被用于針對某些類型的瘤形成(癌癥)的治療，等等。
【專利說明】 灰葡萄孢石竹變種用于制備金納米粒子的用途發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及灰葡萄孢石竹變種(Botrytis cinerea)菌株、其孢子、菌絲、菌絲體、菌核、胞內(nèi)和/或胞外有機分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂質(zhì)和次級代謝物用于生物合成金納米粒子(AuNps)的用途。概括地，本發(fā)明聚焦于將灰葡萄孢石竹變種(B.cinerea)菌株和/或由該生物產(chǎn)生的分子用于生物合成AuNps。因此，申請的領(lǐng)域集中于，使用植物病原體真菌灰葡萄孢石竹變種和/或它的單獨地或組合地純化的胞內(nèi)或胞外蛋白質(zhì)或由該生物產(chǎn)生的任何其他胞內(nèi)和/或胞外分子作為生物合成系統(tǒng)，合成納米材料，尤其是AuNps。
[0002]金屬納米粒子被用于各種應用，包括:半導體、光致發(fā)光、生物醫(yī)學、醫(yī)學診斷成像、催化劑(分散型及支持型)并且被用于針對某些類型的瘤形成(癌癥)的治療，等等。
[0003]發(fā)明背景
[0004]納米粒子是尺寸為I至100納米范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)體，并且由于其光學、化學、光電化學和電學性質(zhì)而尤其有吸引力(Wilson Μ.，Kannangara K.，Smith G，Simmons M.，RaguseB.Nanotechnology:Basic Science and Emerging Technologies (納米技術(shù):基礎(chǔ)科學和新興技術(shù)).Chapman and Hall/CRC 2002 ;Jain，P.K.，Huang，Χ.，El-Sayed，1.H.El-Sayed，M.A.2008.Noble metals on the nanoscale:optical and photothermal propertiesand some applicat1ns in imaging, sensing, b1logy and medicine (納米級的貴金屬:光學和光熱性質(zhì)以及在成像、感測、生物學和醫(yī)學方面的一些應用).A of Chem Res.41:1578-1586)。
[0005]近年，合成具有不同組成和尺寸的納米粒子是非常讓人感興趣的研宄領(lǐng)域。目前，大規(guī)模制備AuNPs通過化學方法進行，所述化學方法需要使用還原劑以由可溶的金鹽生產(chǎn)粒子。也存在物理方法，其需要在減壓和高溫下操作。在這兩種情況中，伴隨AuNPs生產(chǎn)，由于所述反應試劑和信號系統(tǒng)的操作條件而產(chǎn)生有毒的化學化合物；這帶來了問題，所述問題涉及產(chǎn)生的納米粒子的穩(wěn)定性、聚集和所需尺寸的控制(Sau T.K.,Murphy C.J.2004.Room temperature,high-yield synthesis of multiple shapes of gold nanoparticlesin aqueous solut1n (在水溶液中室溫高產(chǎn)率合成多種形狀的金納米粒子).J Am ChemSoc 126:8648-8649)。
[0006]已知此課題在世界范圍內(nèi)的相關(guān)性，必需要進行備選的和有效的不需要大量的能量的“對環(huán)境友好的”用于獲得金屬納米粒子的方法。在這點上，生物系統(tǒng)是進行此種方法的良好候選。目前，關(guān)于此課題有多種出版物，具體地涉及包括細菌和真菌在內(nèi)的某些生物產(chǎn)生這些結(jié)構(gòu)體的能力(Brown S.，Sarikaya Μ.，Johnson E.A.2000.Geneticanalysis of crystal growth (晶體生長的遺傳分析).J Mol B1l 299:725-735 ；NairB.，Pradeep T.2002.Coalescence of nanoclusters and format1n of submicroncrystallites assisted by Lactobacillus strains (乳酸桿菌菌株輔助的納米族的聚結(jié)和亞微米微晶的形成).Cryst Growth Des 2:293-298 ；-Husseiny Μ.1.,Abd El-Aziz Μ.，Badr Y.，Mahmoud Μ.A.2007.B1synthesis of gold nanoparticles using Pseudomonasaeruginosa (使用銅綠假單胞菌生物合成金納米粒子).Spectrochimica Acta Part A.67:1003-1006 ；Thirumurugan G，Veni VS，Ramachandran S，Rao JV? Dhanaraju MD.2011.Super1r wound healing effect of topically delivered silver nanoparticleformulat1n using eco-friendly potato plant pathogenic fungus:synthesis andcharacterizat1n (使用對環(huán)境友好的馬鈴薯植物病原真菌的局部遞送的銀納米粒子制劑的出色的傷口愈合效果:合成和表征).J B1med Nanotechnol.7:659-66)。
[0007]灰葡萄孢石竹變種是植物病原體真菌，其感染大量的具有極高經(jīng)濟重要性的植物物種，包括果樹、觀賞植物和蔬菜。此真菌產(chǎn)生被稱為灰霉病(grey mold)的疾病，其在草莓、覆盆子、蘋果、梨、栗子、獼猴桃和葡萄等中在收割前和收割后產(chǎn)生嚴重的問題。在葡萄藤中，該真菌產(chǎn)生果腐病(bunch rot)，(van Kan J.A.2006.Licensed to kill:thelifestyle of a necrotrophic plant pathogen(授權(quán)殺戮:腐生性植物病原體的生活方式).Trends Plant Sc1.11，247-253 ;Elad，Y.，Williamson，B.，Tudzynski，P.和 Delen，N.編輯 2007.Botrytis:B1logy，Pathology and Control (葡萄孢:生物學、病理學和防治).The Netherlands:Kluwer Academic Publishers)。
[0008]傳統(tǒng)上，研宄灰葡萄孢石竹變種的目的在于產(chǎn)生策略以允許對其進行控制，并且因此，降低與由該真菌產(chǎn)生的感染相關(guān)的經(jīng)濟損失。直至今日，在納米【技術(shù)領(lǐng)域】還沒有研宄將灰葡萄孢石竹變種的培養(yǎng)物、繁殖體或分子用于合成金屬納米粒子的方法。我們的結(jié)果顯示，液體培養(yǎng)基中的灰葡萄孢石竹變種能夠催化在室溫自撤11(:14的溶液的金納米粒子的合成。納米粒子的形成通過跟蹤溶液顏色從淺黃色到微紅色到紫色的變化得到驗證。此外，含有納米粒子的溶液在540nm處呈現(xiàn)光密度的最大值，這是此類結(jié)構(gòu)存在的特性。
[0009]關(guān)于知識產(chǎn)權(quán)，涉及金屬納米粒子的合成的專利主要由化學方法用于合成這些結(jié)構(gòu)體的用途組成，它們中的一些允許制備具有特定尺寸和形態(tài)的粒子。這就是專利USN0.6.929.675中的情況，其中描述了用于制備銅、銀和金納米粒子的化學體系。具體地關(guān)于AuNps，還可以找到一些公開，如專利US 20070125196，其中描述了使用含有丙烯酸鈉的水介質(zhì)合成尺寸在30至90nm范圍內(nèi)的AuNPs，并且還可以找到公開US 20060021468，其中描述了用于控制產(chǎn)生的粒子的均勻性的化學方法。
[0010]最后，應當注意的是，雖然有涉及使用生物系統(tǒng)合成AuNps的專利，但是目前沒有專利描述將灰葡萄孢石竹變種或由所述真菌產(chǎn)生的分子用于此用途。關(guān)于這點，具有最大相似性的專利是由University of Illinois的研宄者在2010年公開的專利(公開USN0.20100055199)，其中描述了真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)用于合成AuNps的用途。
[0011]發(fā)明概述
[0012]本發(fā)明涉及由絲狀子囊菌(filamentous ascomycete)灰葡萄孢石竹變種和/或由該真菌菌絲體分泌的分子介導的AuNps的合成。因為以上，該方法可以以分離的方式直接使用所述真菌或其分子來進行。
[0013]附圖簡述
[0014]圖1.通過灰葡萄孢石竹變種的胞外AuNps合成。將灰葡萄孢石竹變種培養(yǎng)物上清與HAuC14在ELISA微平板的不同的孔中溫育。(a)沒有接種的培養(yǎng)基，(b)獲得自灰葡萄孢石竹變種的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，(1、5和10)獲得自在分別存在HAuCl41、5和1mM的情況下的灰葡萄孢石竹變種的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。
[0015]圖2.由灰葡萄孢石竹變種培養(yǎng)物上清產(chǎn)生的AuNps的吸收光譜。吸收的最大值約在550nm處觀察到。
[0016]圖3.由灰葡萄孢石竹變種產(chǎn)生的金粒子的EDS譜。觀察到對應于作為納米粒子成分的金元素的存在的信號。
[0017]圖4.由灰葡萄孢石竹變種產(chǎn)生的金粒子的透射電子顯微鏡法。觀察到具有極大多樣性的尺寸和形態(tài)的粒子。底部右側(cè)處的條對應于lOOnm。
[0018]本發(fā)明優(yōu)選實施方案的描述
[0019]具體被設(shè)計成自絲狀真菌制備金納米粒子的方法。該方法包括以下步驟:
[0020]1.-真菌菌絲體的生長:將真菌菌絲體培養(yǎng)在含有50ml的營養(yǎng)培養(yǎng)基的250mLErlenmeyer燒瓶中，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基含有0.1_1 %之間的麥芽提取物和0.1_1%的酵母提取物。將所述真菌在20°C在暗處培養(yǎng)，并且為了這樣做，將燒瓶保持在暗室中10天。
[0021]2.-金屬納米粒子的產(chǎn)生:將約10mL的獲得自所述真菌的生長的上清液收集在500mL Erlenmeyer燒瓶中，并且將其與HAuCl4.3H20(終濃度0.5-1OmM) 一起溫育。為了這樣做，向所述上清中添加0.5-1OmL的HAuCl4.3H20 10mM的溶液，并且將該500mLErlenmeyer燒瓶在25_27°C之間的范圍內(nèi)的溫度溫育0.5至12小時的時間。通過低速離心(6，000-8，OOOrpm)或通過自發(fā)沉降(使試管靜置至少I小時)回收粒子。
[0022]所述材料通過以下各項表征:i)吸收光譜，其中在約550nm處觀察到最大值。ii)由灰葡萄孢石竹變種產(chǎn)生的金粒子的透射電子顯微鏡法。觀察到具有極大多樣性的尺寸(10-300nm)以及形態(tài)(球形的、六角形的、三角形的和多面的)的粒子。
【權(quán)利要求】
1.合成金納米粒子的方法，其中所述方法包括: 通過在含有0.1-1%之間的麥芽提取物和0.1-1%的酵母提取物的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)灰葡萄孢石竹變種(Botrytis cinerea)使真菌菌絲體生長，使所述灰葡萄孢石竹變種在20°C在暗處生長10天；并且 產(chǎn)生金納米粒子，取獲得自所述真菌的生長的上清與HAuCl4.3H20溫育，將其在25-27°C之間的溫度保持0.5至12小時的時間，并且通過低速離心或通過在靜置至少I小時后的自發(fā)沉降回收所述粒子。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)包括任選地自所述上清提取由灰葡萄孢石竹變種(B.cinerea)產(chǎn)生的胞內(nèi)和胞外分子，并且將含有所述分子的懸浮液在25_27°C之間的溫度保持0.5至12小時的時間，并且通過低速離心或通過在靜置至少I小時后的自發(fā)沉降回收所述粒子。
【文檔編號】C12P3/00GK104520432SQ201380028398
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
【發(fā)明者】米格爾·卡斯特羅雷塔馬爾, 安東尼奧·卡斯蒂略納拉 申請人:智利圣地亞哥大學