抗-脂阿拉伯甘露聚糖抗體和使用該抗體對抗酸桿菌感染的免疫測定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種單克隆抗體，其特異性結(jié)合抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖，特別是結(jié)核桿菌脂阿拉伯甘露聚糖，所述抗體描述如下：(A)單克隆抗體，其包含通過接頭連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含下述(a)-(c)所示的重鏈CDR1-CDR3，并且所述輕鏈可變區(qū)包含下述(d)-(f)所示的輕鏈CDR1-CDR3；(a)由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR1，(b)由SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR2，(c)由SEQ?ID?NO：3所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR3，(d)由SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR1，(e)由SEQ?ID?NO：5所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR2，和(f)由SEQ?ID?NO：6所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR3。本發(fā)明還提供所述抗體的應(yīng)用。
【專利說明】抗-脂阿拉伯甘露聚糖抗體和使用該抗體對抗酸桿菌感染 的免疫測定

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，所述單克隆抗體特異性結(jié)合抗酸桿菌（如結(jié)核桿 菌）的脂阿拉伯甘露聚糖，并且特別涉及單鏈抗體（scFv)及其多價抗體。
[0002] 本發(fā)明還涉及使用所述抗體檢測抗酸桿菌的方法，特別涉及用于診斷結(jié)核病 (tuberculosis)的方法或結(jié)核病診斷方法；并且涉及抗酸桿菌檢測試劑（例如，結(jié)核病診 斷試劑）和抗酸桿菌檢測試劑盒（例如，結(jié)核病診斷試劑盒），其用于上述方法中。
[0003] 本發(fā)明還涉及使用所述抗體確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果的方法；以及用 于上述方法的用于確定抗結(jié)核病藥物的治療效果的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0004] 結(jié)核病是一種數(shù)千年來一直困擾人類的傳染病，并且估計十九世紀(jì)歐洲1/4的成 年人口死于結(jié)核病。由于二十世紀(jì)生活標(biāo)準(zhǔn)的改善以及抗生素的發(fā)現(xiàn)，到二十世紀(jì)五十年 代，工業(yè)化國家已經(jīng)幾乎根除了結(jié)核病。然而，作為復(fù)發(fā)的傳染病，結(jié)核病仍然是猖獗的。在 當(dāng)下，估計在世界人口中三個人中有一個感染結(jié)核桿菌（tubercle bacillus)(潛伏的結(jié)核 ?。?jù)說世界上新發(fā)作的結(jié)核病患者的總數(shù)有九百四十萬，并且估計其中有兩百萬名患者 死于該病。目前，大約95%的活動性結(jié)核病（active tuberculosis)患者生活在發(fā)展中國 家，99%的死于結(jié)核病的人集中在發(fā)展中國家。
[0005] 在二十世紀(jì)九十年代，人們再次認(rèn)識到結(jié)核病病例的數(shù)量仍然持續(xù)上升，成為集 中在發(fā)展中國家的最主要的傳染病，并且已經(jīng)開始采取全面的措施。在全球協(xié)作下已經(jīng)制 定了針對結(jié)核病的對策，諸如最主要由世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO) 采用的直接觀察的短期治療（Directly Observed Treatment, Short-Course, DOTS),在 直接涉及的國家、提供援助的國家和援助組織的協(xié)作下建立用于推進(jìn)措施的"終止結(jié)核病 伙伴（Stop Tuberculosis partnership)"，以及"世界抗擊艾滋、結(jié)核病和痕疾基金（The Global Fund to Fight AIDS，Tuberculosis and Malaria)" 作為提供經(jīng)濟支持的系統(tǒng)的 資助?，F(xiàn)有的用作結(jié)核病對策的多種技術(shù)已經(jīng)使用了幾十年而沒有改善。因此，在發(fā)展中 國家亟需開發(fā)有效的新技術(shù)。
[0006] 對于結(jié)核病的診斷，最重要的是在早期階段發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌感染以開始治療。特別 地，由于處于細(xì)菌釋放狀態(tài)的患者具有向周圍人群傳播傳染病的極高危險，因此，需要在不 與周圍人群有任何接觸的隔離的環(huán)境中治療那些患者。作為用于此的檢測，存在"結(jié)核病的 細(xì)菌學(xué)診斷（Bacteriological diagnosis of tuberculosis)"，并且最普遍使用其中所述 的痰液涂片檢查。
[0007] 痰液涂片檢查是一種在顯微鏡下直接觀察和檢查痰液涂片樣品的方法（痰液涂 片樣品直接顯微鏡檢），并且由Robert Koch遠(yuǎn)在一個世紀(jì)之前建立。通過染色結(jié)核病的病 原體而鑒定臨床測試樣品中的分枝桿菌（Mycobacteria)?，F(xiàn)在所用的結(jié)核病診斷方法是通 過在實踐中使用Koch所用的技術(shù)而建立的。在發(fā)展中國家中，結(jié)核桿菌涂片檢查是標(biāo)準(zhǔn)的 結(jié)核病診斷方法，并且還用作參比來評價新檢測方法的表現(xiàn)。
[0008] 已經(jīng)確定基因擴增方法是具有比痰液涂片檢查更高的靈敏性的方法?；驍U增方 法是一種使用DNA聚合酶以鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方式擴增特定的DNA片段的方法。這一方法的原理是 使用要擴增的DNA，與該DNA兩端的序列互補的一對DNA引物，和耐熱性DNA聚合酶，并且制 定重復(fù)的溫度變化，來擴增要用于檢測的DNA。盡管基因擴增方法在靈敏性方面是令人滿意 的，但是，由于可操作性、設(shè)備和成本原因，在發(fā)展中國家很難使用這種方法。
[0009] 作為最近的全球趨勢，由于多藥耐藥性結(jié)核病的傳播，興趣轉(zhuǎn)向培養(yǎng)物檢測和核 酸擴增檢測的必要性。然而，在現(xiàn)有的多種細(xì)菌學(xué)診斷方法中，痰液涂片檢查（直接的痰液 顯微鏡檢）仍然被視為結(jié)核病對策策略的中樞核心。特別地，在結(jié)核病傳播的資源匱乏的 發(fā)展中國家，痰液涂片檢查不僅是有效的診斷方法，而且作為確定治療效果的方式起著重 要的作用。
[0010] 如上文所述，盡管痰液涂片檢查是結(jié)核病控制基本策略的中樞核心，但是，在許多 發(fā)展中國家中進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗的工人人數(shù)完全不足，并且據(jù)說這樣的工人的技能是有問題 的。由于這一檢測的有效性取決于實驗室技術(shù)人員的技能，日常培訓(xùn)和質(zhì)量控制是必需的， 并且引起綜合費用的過度增加。另外，發(fā)展中國家在改善實驗室環(huán)境、檢測設(shè)備、檢測技術(shù) 等所需要的社會基礎(chǔ)設(shè)施方面存在許多問題。這些因素以復(fù)雜的方式糾結(jié)在一起，并且結(jié) 果以不小的程度不利地影響檢測的質(zhì)量。
[0011] 此外，由于痰液涂片檢查是用于檢測和鑒定抗酸桿菌的檢測，而不是用于檢測結(jié) 核桿菌的方法，因此，不可能利用該檢測來鑒定結(jié)核桿菌。
[0012] 關(guān)于在發(fā)達(dá)國家的結(jié)核病治療，在鑒定結(jié)核桿菌后開始使用化學(xué)藥劑的治療；而 在發(fā)展中國家進(jìn)行的DOTS計劃中，在痰液涂片檢查中檢測到抗酸桿菌而不是鑒定結(jié)核桿 菌時，開始使用化學(xué)藥劑的治療。此處，盡管用于結(jié)核桿菌感染和非結(jié)核性抗酸桿菌感染的 化學(xué)藥劑是不同的，但是，由于尚未開發(fā)用于非結(jié)核性抗酸桿菌的高療效的藥物，基本上使 用用于結(jié)核桿菌的化學(xué)藥劑進(jìn)行用于非結(jié)核性抗酸桿菌的治療。因此，患者必須忍受化學(xué) 藥劑的副作用的危險。已經(jīng)指出的危險的代表性實例包括嚴(yán)重的副作用，注入肝功能下降 和視力喪失，以及耐藥性非結(jié)核性抗酸桿菌的擴散。
[0013] 如上文所述，盡管在當(dāng)前所知的結(jié)核病診斷及其治療中存在多種問題，但是，Koch 于1882年開發(fā)的痰液涂片檢查方法目前仍然用于結(jié)核病的診斷，沒有任何大的改善。為 了解決發(fā)展中國家和最近新興國家中關(guān)于實驗室環(huán)境所需要的社會基礎(chǔ)設(shè)施、檢測設(shè)備、 檢測技術(shù)等的問題的目的，考慮兩種措施，即，"建立完全使用電源和設(shè)施的允許高通量 處理在局限區(qū)域采集的樣品的高靈敏性和低成本的檢測方法"或"建立高靈敏性的、快速 的、容易的和低成本的并且無需使用需要電源的設(shè)備進(jìn)行的護(hù)理點檢測（Point Of Care Testing，P0CT)"。
[0014] 如果其實位于非常局限的地區(qū)，則電源和設(shè)備在發(fā)展中國家和最近新興的國家中 也是就位的。另外，在此類地區(qū)已經(jīng)存在進(jìn)行相對先進(jìn)的檢測的檢測中心，并且一些富有的 患者可以使用這些服務(wù)。通過使用此類檢測中心，可以解決諸如實驗室環(huán)境、檢測設(shè)備、檢 測技術(shù)和人力資源的問題。在這樣的情形中，需要將患者或痰液樣品由醫(yī)學(xué)檢查現(xiàn)場轉(zhuǎn)移 至檢測中心。在轉(zhuǎn)運用于核酸擴增檢測或培養(yǎng)物檢測的痰液樣品過程中存在一些主要的限 制。為了防止污染和不需要的微生物的生長，在要進(jìn)行轉(zhuǎn)運的痰液收集后，樣品必須立即冷 凍。此外，由于將細(xì)菌保持在生長狀態(tài)對于培養(yǎng)物檢測是重要的，所以，當(dāng)與遺傳檢測相比 較時，需要更多的注意。此外，由于在對樣品進(jìn)行滅菌操作，諸如熱處理時，不能進(jìn)行這兩種 檢測，因此，樣品必須以嚴(yán)格可控的狀態(tài)轉(zhuǎn)運。由于在發(fā)展中國家和最近新興的國家中沒有 建立可以處理樣品轉(zhuǎn)運所涉及的此類限制的系統(tǒng)，因此，建立甚至能夠在對其實施滅菌操 作的樣品中進(jìn)行檢測的測定是重要的。
[0015] 在進(jìn)行P0CT時，允許在短時間期間在臨床現(xiàn)場進(jìn)行測定，而無需使用專門的設(shè)施 和設(shè)備，是重要的。關(guān)于P0CT通常所用的技術(shù)是免疫層析檢測（ICT)。通常，認(rèn)為ICT在靈 敏性方面劣于免疫測定方法，如ELISA。因此，如果要用P0CT來解決問題，建立能夠高靈敏 性檢測的測定系統(tǒng)是重要的。此外，在使用P0CT的情形中，由于對于檢測工人難以通過使 用檢測中心等所用的安全櫥等來采取感染預(yù)防措施，因此，為減少被樣品感染的危險進(jìn)行 滅菌處理是必需的。
[0016] 因此，需要建立能夠在滅菌的樣品中進(jìn)行高靈敏性檢測的測定，以"建立完全使用 電源和設(shè)施的允許高通量處理在局限區(qū)域采集的樣品的高靈敏性和低成本的檢測方法"和 "建立高靈敏性的、快速的、容易的和低成本的并且無需使用需要電源的設(shè)備進(jìn)行的護(hù)理點 檢測（P0CT)"。為了做到這些，靶抗原的選擇是重要的。作為對結(jié)核桿菌特異性的抗原，報 道了蛋白抗原，如Ag85。然而，由于蛋白抗原在體內(nèi)迅速降解并且被消化，使用其幾乎不能 獲得精細(xì)的靈敏性。
[0017] 抗酸桿菌中主要的抗原包括糖脂，其實細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的主要組成成分。由于 其在體內(nèi)是高度穩(wěn)定的，因此，認(rèn)為糖脂抗原時一種有希望的靶抗原類型。在這些之中， LAM占細(xì)菌細(xì)胞成分的15%，并且其為在其數(shù)量方面也引起注意的一種抗原。有多份關(guān)于 產(chǎn)生用于檢測活樣品中的抗酸桿菌的LAM的目的的PoAb和MoAb的報道（參見非專利文 獻(xiàn)1-4 (NPL 1-4))。與這些報道相應(yīng)地，使用ELISA來檢測痰液或尿液脂阿拉伯甘露聚糖 (lipoarabinomannan，以下，還稱為"LAM")。然而，抗酸桿菌中的LAMs的基本結(jié)構(gòu)除了在甘 露糖封端觀察到的微小的不同之外幾乎是相同的。特別地，在鳥分枝桿菌（Mycobacterium avium)(其為僅次于結(jié)核桿菌以第二最大頻率引起抗酸桿菌感染的細(xì)節(jié)）中，甘露糖封端 結(jié)構(gòu)與結(jié)核桿菌的甘露糖封端結(jié)構(gòu)幾乎是相同的（參見，非專利文獻(xiàn)5(NPL 5))。因此，需 要能夠特異性檢測抗酸桿菌中的結(jié)核桿菌的LAM的單克隆抗體。
[0018] 引用列表 [0019] 非專利文獻(xiàn)
[0020] NPL 1 ：Aharona Glatman-Freedman 等，"Monoclonal antibodies to surface antigens of Mycobacterium tuberculosis and their use in a modified Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay for detection of Mycobacteria (結(jié)核分枝桿菌表面 抗原的單克隆抗體及其在用于檢測分枝桿菌的改良的酶聯(lián)免疫吸附印記測定中的應(yīng) 用），" Journal of Clinical Microbiology (臨床微生物學(xué)雜志），1996 年 11 月， pp.2795-2802
[0021] NPL 2 :Lenka M. Pereira Arias-Bouda等，"Development of antigen detection assay for diagnosis of tuberculosis using sputum samples (開發(fā)使用痰液樣品用于 結(jié)核病診斷的抗原檢測測定），" Journal of Clinical Microbiology(臨床微生物學(xué)雜 志），2000 年 6 月，ρρ· 2278-2283
[0022] NPL 3 :Beston Hamasur 等，"Rapid diagnosis of tuberculosis by detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan in urine(通過檢測尿液中的抗酸桿菌脂阿 拉伯甘露聚糖快速診斷結(jié)核?。?J〇urnal of Microbiological Methods (微生物學(xué)方法 雜志），45, 2001，ρρ· 41-52
[0023] NPL 4 :C. Boehme 等，"Detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan with an antigen-capture ELISA in unprocessed urine of Tanzanian patients with suspected tuberculosis (使用抗原-捕獲ELISA檢測疑似結(jié)核病坦桑尼亞患者的未處 理的尿液中的抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖）/'Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 99, 2005, pp. 893-900
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[0025] NPL 6 :Winter 等，Annu. Rev. Immunol.(年度免疫學(xué)綜述），12 :433,1994
[0026] NPL 7 :Κ· Zuberbiihler，Protein Engineering，Design&Selection (蛋白質(zhì)工程、 設(shè)計和選擇），22,169 (2009)
[0027] 發(fā)明概述
[0028] 技術(shù)問題
[0029] 本發(fā)明的目的是提供特異性結(jié)合抗酸桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖（以下，有時稱為 "LAM"）的單克隆抗體，特別是其單鏈抗體（scFv)和多價抗體。
[0030] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用所述抗體來檢測抗酸桿菌的方法，或結(jié)核病 診斷方法，和抗酸桿菌檢測試劑（例如，結(jié)核病診斷試劑）和使用所述方法的抗酸桿菌檢測 試劑盒（例如，結(jié)核病診斷試劑盒）。
[0031] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用所述抗體確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療 效果的方法，和用于確定抗結(jié)核病藥物的治療效果的試劑盒，所述試劑盒用于上述方法。 [0032] 問題的解決方案
[0033] 通過開發(fā)產(chǎn)生或選擇適當(dāng)?shù)拿庖邉游?、免疫原和MoAb的技術(shù)，本發(fā)明人成功地開 發(fā)了可以區(qū)分抗酸桿菌LAM與其他細(xì)菌的LAM或同其結(jié)構(gòu)相似的膜抗原并且以與基因擴增 檢測方法的靈敏性相當(dāng)?shù)母哽`敏性特異性檢測抗酸桿菌LAM的抗體和測定方法。此外，本 發(fā)明人成功地開發(fā)了可以區(qū)分結(jié)核桿菌LAM與非結(jié)核性抗酸桿菌的LAM并且特異性檢測結(jié) 核桿菌LAM的抗體。
[0034] 因此，本發(fā)明包括下述實施方案：
[0035] (I)特異件結(jié)合抗酸桿菌的脂阿柃伯甘露聚糖（LAM)的單克降抗體（1-1)
[0036] (1-1)能夠結(jié)合抗酸桿菌LAM的單克隆抗體，所述抗體如下述（A)-(C)所述：
[0037] (A)單克隆抗體，其包含通過接頭連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可 變區(qū)包含下述（a)-(c)所示的重鏈CDR1-CDR3,并且所述輕鏈包含下述（d)-(f)所示的 CDR1-CDR3 ;
[0038] (a)由SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR1，
[0039] (b)由SEQ ID N0 :2所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR2，
[0040] (c)由SEQ ID N0 :3所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R3，
[0041] (d)由SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR1，
[0042] (e)由SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR2,和
[0043] (f)由SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR3 ;
[0044] (B)單克隆抗體，其包含通過接頭連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可 變區(qū)包含下述（g)-(i)所示的重鏈CDR1-CDR3,并且所述輕鏈包含下述（j)-(l)所示的 CDR1-CDR3 ;
[0045] (g)由SEQ ID N0 :31所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR1，
[0046] (h)由SEQ ID N0 :32所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R2，
[0047] ⑴由SEQ ID N0 :33所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R3，
[0048] (j)由SEQ ID N0 :34所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR1，
[0049] (k)由SEQ ID N0 :35所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R2,和
[0050] (1)由SEQ ID N0 :36所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR3 ;和
[0051] (C)單克隆抗體，其包含通過接頭連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可 變區(qū)包含下述（m)-(o)所示的重鏈CDR1-CDR3,并且所述輕鏈包含下述（p)-(r)所示的 CDR1-CDR3 ;
[0052] (m)由SEQ ID N0 :47所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR1，
[0053] (η)由SEQ ID N0 :48所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR2，
[0054] (〇)由SEQ ID N0 :49所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR3，
[0055] (p)由SEQ ID N0 :50所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR1，
[0056] (q)由SEQ ID N0 :51所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR2,和
[0057] (r)由SEQ ID N0 :52所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR3。
[0058] (1-2)根據(jù)（1-1)所述的單克隆抗體，其中（A)的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)由SEQ ID N0 :7所示的氨基酸序列組成。
[0059] (1-3)根據(jù)（1-1)或（1-2)所述的單克隆抗體，其中（A)的單克隆抗體的輕鏈可變 區(qū)由SEQ ID N0 :8所示的氨基酸序列組成。
[0060] (1-4)根據(jù)（1-1)至（1-3)中任一項所述的單克隆抗體，其中（A)的單克隆抗體的 接頭具有SEQ ID N0:11所示的氨基酸序列。
[0061] (1-5)根據(jù)（1-1)至（1-4)中任一項所述的單克隆抗體，其中（A)的單克隆抗體由 SEQ ID N0:12所示的氨基酸序列組成。
[0062] (1-6)根據(jù)（1-1)至（1-5)中任一項所述的單克隆抗體，其中⑷的單克隆抗體 能夠特異性結(jié)合結(jié)核桿菌LAM，特別是人結(jié)核桿菌（結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis))的 LAM。
[0063] (1-7)根據(jù)（1-1)所述的單克隆抗體，其中（B)的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)由SEQ ID N0 :37所示的氨基酸序列組成。
[0064] (1-8)根據(jù)（1-1)或（1-7)所述的單克隆抗體，其中（B)的單克隆抗體的輕鏈可變 區(qū)由SEQ ID N0:38所示的氨基酸序列組成。
[0065] (1-9)根據(jù)（1-1)，（1-7)和（1-8)中任一項所述的單克隆抗體，其中（B)的單克 隆抗體的接頭具有SEQ ID N0 :40所示的氨基酸序列。
[0066] (1-10)根據(jù)（1-1)和（1-7)至（1-9)中任一項所述的單克隆抗體，其中（B)的單 克隆抗體由SEQ ID NO :39所示的氨基酸序列組成。
[0067] (1-11)根據(jù)（1-1)所述的單克隆抗體，其中（C)的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)由SEQ ID N0 :53所示的氨基酸序列組成。
[0068] (1-12)根據(jù)（1-1)或（1-11)所述的單克隆抗體，其中（C)的單克隆抗體的輕鏈可 變區(qū)由SEQ ID N0 :54所示的氨基酸序列組成。
[0069] (1-13)根據(jù)（1-1)，（1-11)和（1-12)任一項中所述的單克隆抗體，其中（C)的單 克隆抗體的接頭具有SEQ ID N0 :11所不的氣基酸序列。
[0070] (1-14)根據(jù)（1-1)和（1-11)-(1-13)中任一項所述的單克隆抗體，其中（C)的單 克隆抗體由SEQ ID N0 :30所示的氨基酸序列組成。
[0071] (1-15)根據(jù)（1-1)和（1-7)-(1-14)所述的單克隆抗體，其中（B)或（C)的單克隆 抗體能夠特異性結(jié)合非結(jié)核性抗酸桿菌。
[0072] (1-16)根據(jù)（1-1)-(1-15)中任一項所述的單克隆抗體，其中（A)-(C)中任一項的 單克隆抗體是單價或二價抗體。
[0073] (II)用于免疫非人動物產(chǎn)牛特異件結(jié)合抗酸桿菌脂阿柃伯甘露聚糖（LAM)的單 克降抗體的方法和用于產(chǎn)牛所沭單克降抗體的方法
[0074] (II-1)用于免疫非人動物產(chǎn)生特異性結(jié)合抗酸桿菌LAM的單克隆抗體的方法，所 述方法包括向所述非人動物施用作為免疫原的BCG來誘導(dǎo)針對BCG的體液免疫應(yīng)答。
[0075] (II-2)根據(jù)（II-1)所述的方法，其中所述非人動物是兔或雞。
[0076] (II-3)根據(jù)（II-1)或（II-2)所述的方法，其中所述抗酸桿菌是結(jié)核桿菌，優(yōu)選人 結(jié)核桿菌（結(jié)核分枝桿菌）。
[0077] (11-4)用于產(chǎn)生特異性結(jié)合抗酸桿菌LAM的單克隆抗體的方法，所說方法包括下 述步驟：
[0078] 向所述非人動物施用作為免疫原的BCG來誘導(dǎo)針對BCG的體液免疫應(yīng)答，并且產(chǎn) 生結(jié)合抗酸桿菌LAM的抗體；和
[0079] 從所述非人動物收集產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞。
[0080] (11-5)用于產(chǎn)生特異性結(jié)合抗酸桿菌LAM的單克隆抗體的方法，所述方法包括下 述步驟：
[0081] 向非人動物施用作為免疫原的BCG來誘導(dǎo)針對BCG的體液免疫應(yīng)答；
[0082] 制備來自編碼所述非人動物的結(jié)合抗酸桿菌LAM的抗體的mRNA ;
[0083] 使用所述mRNA作為模板制備cDNA ;并且
[0084] 使用所述cDNA通過噬菌體展示方法收集特異性結(jié)合抗酸桿菌LAM的單克隆抗體。
[0085] (II-6)根據(jù)（II-4)或（II-5)所述的方法，其中所述非人動物是兔或雞。
[0086] (II-7)根據(jù)（11-4)-(11-6)中任一項所述的方法，其中所述抗酸桿菌是結(jié)核桿 菌，優(yōu)選人結(jié)核桿菌（結(jié)核分枝桿菌）。
[0087] (II-8)根據(jù)（11-4)-(11-7)中任一項所述的方法，其中所述特異性結(jié)合抗酸桿菌 LAM的單克隆抗體是（1-1)-(1-12)中任一項所述的單克隆抗體。
[0088] (II-9)根據(jù)（11-4)-(11-8)中任一項所述的方法，其中特異性結(jié)合分枝桿菌LAM、 優(yōu)選結(jié)合人結(jié)核桿菌（結(jié)核分枝桿菌）LAM的單克隆抗體是（1-1)-(1-6)中任一項所述的 (A)的單克隆抗體。
[0089] (II-10)用于產(chǎn)生特異性結(jié)合抗酸桿菌LAM的單克隆抗體的方法，所述方法包括 下述步驟：
[0090] 向非人動物施用LAM與（1-1)-(1-6)中任一項所述的（A)的單克隆抗體的復(fù)合物 作為免疫原，以誘導(dǎo)針對所述復(fù)合物的體液免疫應(yīng)答，并且產(chǎn)生結(jié)合抗酸桿菌LAM的抗體； 和
[0091] 從所述非人動物收集產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞。
[0092] (Π -ll)用于產(chǎn)生特異性結(jié)合抗酸桿菌LAM的單克隆抗體的方法，所述方法包括 下述步驟：
[0093] 向非人動物施用LAM與（1-1)-(1-6)中任一項所述的（A)的單克隆抗體的復(fù)合物 作為免疫原，以誘導(dǎo)針對所述復(fù)合物的體液免疫應(yīng)答；
[0094] 制備編碼來自所述非人動物的結(jié)合抗酸桿菌LAM的抗體的mRNA ;
[0095] 使用所述mRNA作為模板制備cDNA ;并且
[0096] 使用所述cDNA通過噬菌體展示方法收集特異性結(jié)合抗酸桿菌LAM的單克隆抗體。
[0097] (11-12)根據(jù)（11-10)或（Π -ll)所述的方法，其中所述特異性結(jié)合抗酸桿菌LAM 的單克隆抗體是（1-1)和（1-7)-(1-12)中任一項所述的（B)的單克隆抗體。
[0098] (III)用于檢測抗酸桿菌、優(yōu)詵結(jié)核桿菌的方法
[0099] (III-1)用于檢測抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的方法，所述方法包括下述步驟：
[0100] (1)使（1-1)-(1-16)中任一項所述的單克隆抗體與受試者的生物樣品接觸；并且
[0101] (2)使用所述單克隆抗體與抗酸桿菌LAM、優(yōu)選結(jié)核桿菌LAM的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo) 測定在所述樣品中存在的抗fe桿囷、優(yōu)選結(jié)核桿囷。
[0102] (III-2)根據(jù)（III-1)所述的方法，其中用于檢測結(jié)核桿菌的方法使用 (1-1)-(1-6)中任一項所述的（A)的單克隆抗體。
[0103] 在上述檢測方法中，結(jié)核桿菌檢測方法可以解釋為用于診斷患者中的結(jié)核病的方 法（結(jié)核病診斷方法）。
[0104] (IV)結(jié)核病診斷試齊I丨矛口結(jié)核病診斷試齊I丨念
[0105] (IV-1)結(jié)核病診斷試劑，其包含（1-1)-(1-6)中任一項所述的㈧的單克隆抗體。
[0106] (IV-2)結(jié)核病診斷試劑盒，其包含含（1-1)-(1-6)中任一項所述的（A)的單克隆 抗體作為結(jié)核病檢測試劑。
[0107] (V)用于測量抗酸桿菌脂阿柃伯甘露聚糖（LAM)的方法
[0108] (V-1)用于測量測試樣品中的抗酸桿菌LAM的方法，所述方法包括下述步驟：
[0109] (1)使（1-1)-(1-16)中任一項所述的單克隆抗體與可能含有抗酸桿菌的測試樣 品接觸；并且
[0110] (2)利用所述單克隆抗體與抗酸桿菌LAM之間的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo)測定測試樣品 中的抗酸桿菌LAM。
[0111] (V-2)根據(jù)（V-1)所述的方法，其是包括檢測抗酸桿菌LAM作為步驟（2)的抗酸桿 菌LAM定性方法，或者是包括定量抗酸桿菌LAM作為步驟（2)的抗酸桿菌LAM定量方法。
[0112] (V-3) (V-1)或（V-2)所述的方法，其中所述抗酸桿菌是結(jié)核桿菌，優(yōu)選人結(jié)核桿 菌（結(jié)核分枝桿菌）。
[0113] (V-4)根據(jù)（V-3)所述的方法，其中所述單克隆抗體是（1-1)-(1-6)中任一項所述 的（A)的單克隆抗體。
[0114] (VI)抗酸桿菌脂阿柃伯甘露聚糖（LAM)檢測試劑或檢測試劑倉
[0115] (VI-1)抗酸桿菌LAM檢測試劑，其包含（1-1)-(1-16)中任一項所述的單克隆抗 體。
[0116] (VI-2)抗酸桿菌LAM檢測試劑，其包含（1-1)-(1-6)中任一項所述的（A)的單克 隆抗體。
[0117] (VI-3)根據(jù)（VI-2)所述的試劑，其中所述抗酸桿菌是結(jié)核桿菌，優(yōu)選人結(jié)核桿菌 (結(jié)核分枝桿菌）。
[0118] (VI-4)抗酸桿菌LAM檢測試劑盒，其包含（1-1)-(1-16)中任一項所述的單克隆抗 體的作為抗酸桿菌LAM檢測試劑。
[0119] (VI-5)根據(jù)（VI-4)所述的抗酸桿菌LAM檢測試劑盒，其中所述單克隆抗體是 (1-1)-(1-6)中任一項所述的（A)的單克隆抗體。
[0120] (VI-6)根據(jù)（VI-5)所述的抗酸桿菌LAM檢測試劑盒，其中所述抗酸桿菌是結(jié)核桿 菌，優(yōu)選人結(jié)核桿菌（結(jié)核分枝桿菌）。
[0121] (VII) #用滅菌樣品的測定
[0122] (VII-1) -種用于確定測試樣品中存在或不存在抗酸桿菌感染的方法，所述方法 包括下述步驟：
[0123] (1)通過煮沸、優(yōu)選通過高壓滅菌而將測試樣品滅菌；
[0124] (2)使（1-1)-(1-16)任一項所述的單克隆抗體、優(yōu)選（1-1)-(1-6)和 (1-7)-(1-10)中任一項的㈧或⑶的單克隆抗體與所述滅菌的樣品接觸；
[0125] (3)使用單克隆抗體與抗酸桿菌LAM之間的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo)測定所述測試樣品 中的抗酸桿菌LAM ;和
[0126] (4)當(dāng)在所述測試樣品中檢測到抗酸桿菌LAM時，確定所述測試樣品感染了抗酸 桿菌。
[0127] (VII-2)根據(jù)（VII-1)所述的方法，其中所述單克隆抗體是（1-1)-(1-6)和 (1-7)-(1-10)中任一項所述的（A)或（B)的單克隆抗體，并且所述抗酸桿菌是結(jié)核桿菌。
[0128] (VIII)用于確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果的方法
[0129] (VIII-1)用于確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果的方法，所述方法包括下述步 驟：
[0130] (1)使（1-1)-(1-6)中任一項所述的（A)的單克隆抗體與施用所述抗結(jié)核病藥物 之前和之后的測試樣品接觸；
[0131] (2)使用所述單克隆抗體與結(jié)核桿菌LAM之間的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo)測定在施用抗 結(jié)核病藥物之前和之后的測試樣品中的結(jié)核桿菌LAM ;和
[0132] (3)當(dāng)在施用所述抗結(jié)核病藥物之前的所述測試樣品中檢測到結(jié)核桿菌LAM，并 且在施用所述抗結(jié)核病藥物之后的所述測試樣品中沒有檢測到結(jié)核桿菌LAM時，確定所述 抗結(jié)核病藥物具有結(jié)核病治療效果。
[0133] (VIII-2)用于確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果的方法，所述方法包括下述步 驟：
[0134] (1)使（1-1)-(1-6)中任一項所述的（A)的單克隆抗體與施用所述抗結(jié)核病藥物 之前和之后的測試樣品接觸；
[0135] (2)使用所述單克隆抗體與結(jié)核桿菌LAM之間的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo)定量在施用所 述抗結(jié)核病藥物之前和之后的所述測試樣品中的結(jié)核桿菌LAM ;和
[0136] (3)比較施用所述抗結(jié)核病藥物之后的所述測試樣品中的結(jié)核桿菌LAM的量（給 藥后測量）與施用所述抗結(jié)核病藥物之前所述測試樣品中的結(jié)核桿菌LAM的量（給藥前測 量）；并且當(dāng)給藥后測量低于給藥前測量時，確定所述抗結(jié)核病藥物具有結(jié)核病治療效果， 并且當(dāng)給藥后測量不低于給藥前測量時，確定所述抗結(jié)核病藥物不具有結(jié)核病治療效果。
[0137] (IX)用于確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果的試劑倉
[0138] (IX)用于確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果的試劑盒，所述試劑盒包含 (1-1)-(1-6)中任一項所述的（A)的單克隆抗體。
[0139] (X)抗酸桿菌（結(jié)核桿菌）檢測工具
[0140] (X-1)抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌檢測工具，其包含由能夠通過毛細(xì)作用轉(zhuǎn)移測試樣 品的材料形成的溶液吸收片，所述溶液吸收片包含：
[0141] (1)樣品收集部，其用于吸收和收集測試樣品；
[0142] (2)標(biāo)記的抗體部，其負(fù)載有與抗酸桿菌LAM特異性反應(yīng)的標(biāo)記的（1-1)-(1-16) 中任一項所述的單克隆抗體；
[0143] (3)確定部，其包括測試結(jié)果顯示部（a)，在所述測試結(jié)果顯示部（a)上固定有與 抗酸桿菌LAM特異性反應(yīng)的未標(biāo)記的（1-1)-(1-16)中任一項所述的單克隆抗體；和
[0144] (4)溶液吸收部，其用于吸收已經(jīng)移動通過所述樣品收集部、標(biāo)記的抗體部和確定 部的所述測試樣品的殘余的溶液。
[0145] (X-2) (X-1)所述的抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌檢測工具，其中所述確定部（3)還包 括對照顯示部（b)，在所述對照顯示部（b)上固定有與標(biāo)記的（1-1)-(1-16)中任一項所 述的單克隆抗體反應(yīng)的未標(biāo)記的抗體，所述對照顯示部與所述測試結(jié)果顯示部（a)分開放 置。
[0146] (X-3)(X-1)或（X-2)所述的抗酸桿菌檢測工具，其中所述單克隆抗體是 (1-1)-(1-6)中任一項所述的（A)的單克隆抗體，并且所述抗酸桿菌是結(jié)核桿菌，優(yōu)選人結(jié) 核桿菌（結(jié)核分枝桿菌）。
[0147] 發(fā)明的有利效果
[0148] 按照本發(fā)明，能夠?qū)⒃谑茉囌叩纳飿悠罚ㄌ狄骸⑼僖?、血液、肺洗出液、胃液、?液、糞便、皮膚或胰液）中存在的抗酸桿菌與其他細(xì)菌區(qū)分開來，并且能夠?qū)ζ溥M(jìn)行特異性 檢測。本發(fā)明所述的用于檢測抗酸桿菌的方法具有與基因擴增檢測方法的靈敏性和特異性 相當(dāng)?shù)撵`敏性和特異性。由于本發(fā)明所述的用于檢測抗酸桿菌的方法可以確定活體中抗酸 桿菌的量，因此，可以監(jiān)測針對抗酸桿菌特別是結(jié)核病的治療效果。此外，本發(fā)明所述的用 于檢測抗酸桿菌的方法甚至能夠可靠地且準(zhǔn)確地檢測來自滅菌后至少一周的滅菌的靶標(biāo) 樣品的抗酸桿菌。因此，即使在沒有用于防止感染的專門的樣品轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的地區(qū)，可以通過 通用的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（諸如通過郵寄）轉(zhuǎn)運滅菌的樣品。
[0149] 按照本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，在結(jié)核病患者生物樣品中存在的結(jié)核桿菌能夠與 非結(jié)核性抗酸桿菌區(qū)分開來，并且對其進(jìn)行特異性檢測。因此，本發(fā)明能夠以高準(zhǔn)確性診斷 結(jié)核桿菌感染。此外，能夠以高準(zhǔn)確性確定抗結(jié)核病藥物在結(jié)核病患者中的治療作用。
[0150] 附圖簡述
[0151] [圖1]在圖1中，㈧和⑶均為顯示本發(fā)明的結(jié)核桿菌檢測工具（結(jié)核桿菌LAM 檢測工具）的模式的示意圖（側(cè)視圖）。示意圖（A)顯示其中確定部（3)僅具有測試結(jié)果 顯示部（a)的模式，示意圖（B)顯示其中確定部（3)具有測試結(jié)果顯示部（a)和對照顯示 部（b)二者的模式。該附圖中的附圖標(biāo)記表示下述：10 :支持體，21 :片材形成的樣品收集 部（1)，22:片材形成的標(biāo)記的抗體部（2)，23:片材形成的確定部（3)，24:片材形成的溶液 吸收部（4)，（a):測試結(jié)果顯示部，（b):對照顯示部，（1):樣品收集部，（2):標(biāo)記的抗體部， (3):確定部，（4):溶液吸收部，P :箭頭顯示測試樣品的流動方向。（同樣適用于圖2)。
[0152] [圖2]顯示本發(fā)明的結(jié)核桿菌檢測工具（結(jié)核桿菌LAM檢測工具）的一種模式 (透視圖）。
[0153] [圖3]顯示使用其上固定有結(jié)核分枝桿菌的LAM(-__)和鳥分枝桿菌的 LAM(- ·-)的抗原平板通過ELISA法測量分別用BCG疫苗或殺死的H37Ra細(xì)菌細(xì)胞皮下免 疫的兔的血液中的抗體滴度的測量結(jié)果（參比實施例1(2))。（A)顯示來自用BGC疫苗免 疫的兔的結(jié)果，（B)顯示來自用殺死的H37Ra細(xì)菌細(xì)胞免疫的兔的結(jié)果。
[0154] [圖4]顯示具有LAM反應(yīng)性的scFv的氨基酸序列。更具體地，產(chǎn)生在上下 行之間的比較，上一行顯示由用殺死的HR37Ra細(xì)菌細(xì)胞免疫的兔的脾細(xì)胞的產(chǎn)生的 scFV(Myc〇-scFv)的氨基酸序列（SEQ ID N0:30)，下一行顯示由用BCG疫苗免疫的兔的脾 細(xì)胞產(chǎn)生的scFv(TB-scFv)的氨基酸序列（SEQ ID N0:12)，以及重鏈可變區(qū)中CDR1-CDR3 區(qū)域、接頭和輕鏈可變區(qū)中CDR1-CDR3區(qū)域的相應(yīng)的位置之間的比較。應(yīng)該注意到，關(guān)于具 有結(jié)合在其N端的四個絲氨酸殘基的接頭序列，N端一側(cè)的氨基酸區(qū)域表示VH區(qū)，并且C端 一側(cè)的區(qū)域表示VL區(qū)。
[0155] [圖5]顯示TB-scFv LAM反應(yīng)性評估的結(jié)果。使用其上固定有結(jié)核分枝桿菌的 LAM和鳥分枝桿菌的LAM的平板，使用ELISA評估由用BCG疫苗免疫的兔產(chǎn)生的TB-scFv的 LAM反應(yīng)性。在圖5中，"· "表示針對結(jié)核分枝桿菌的LAM的反應(yīng)性，" ?"表示針對鳥分 枝桿菌的反應(yīng)性。
[0156] [圖6]顯示抗酸桿菌LAM檢測ELISA和結(jié)核桿菌LAM檢測ELISA的評估結(jié)果。使 用純化的結(jié)核分枝桿菌LAM和鳥分枝桿菌LAM在抗酸桿菌LAM檢測ELISA和結(jié)核桿菌LAM 檢測ELISA中評估針對LAM的反應(yīng)性。在圖6中，"?"表示在抗酸桿菌LAM檢測ELISA中 針對結(jié)核分枝桿菌的LAM的反應(yīng)性，""表示在抗酸桿菌LAM檢測ELISA中針對鳥分枝桿 菌的LAM的反應(yīng)性，"〇"表示在結(jié)核桿菌LAM檢測ELISA中針對結(jié)核分枝桿菌的LAM的反 應(yīng)性，并且"□"表示在結(jié)核桿菌LAM檢測ELISA中針對鳥分枝桿菌的LAM的反應(yīng)性。
[0157] [圖7]顯示抗體組合的評估結(jié)果?？贵w組合的評估使用抗酸桿菌臨床分離株通過 抗酸桿菌LAM檢測ELISA和結(jié)核桿菌LAM檢測ELISA進(jìn)行。針對每種菌株的反應(yīng)性用色彩 密度表示。在圖7中，myco表示抗酸桿菌LAM檢測ELISA的結(jié)果，TB表示結(jié)核桿菌LAM檢 測ELISA的結(jié)果。
[0158] [圖8]顯示抗酸桿菌LAM檢測免疫層析測試和結(jié)核桿菌LAM檢測免疫層析測試 的評估結(jié)果。使用純化的結(jié)核分枝桿LAM(A和B)和鳥分枝桿菌的LAM(C和D)在抗酸桿菌 LAM檢測免疫層析和結(jié)核桿菌LAM檢測免疫層析中評估針對LAM的反應(yīng)性。在每幅圖中， "myco"表示抗酸桿菌LAM檢測免疫層析測試的結(jié)果，"TB"表示結(jié)核桿菌LAM檢測免疫層析 測試的結(jié)果。
[0159] [圖9]顯示雞抗血清針對LAM的抗體滴度（實施例5)。在圖9種，表示 針對純化的結(jié)核桿菌（結(jié)核分枝桿菌）的青山B菌株（Aoyama B strain)的LAM的反應(yīng)性， 表示針對純化的鳥分枝桿菌的LAM的反應(yīng)性。
[0160] [圖10]顯示由雞scFv文庫分離的單鏈抗體G3-SCFV的氨基酸序列，以及重鏈可 變區(qū)中⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)、GS接頭區(qū)和輕鏈可變區(qū)中⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)的位置。
[0161] [圖11]顯示使用二價抗體的LAM檢測ELISA的反應(yīng)性（實施例7)。在圖11中， 表示在結(jié)核桿菌LAM檢測ELISA中針對BCG的反應(yīng)性，表示在抗酸桿菌 LAM檢測ELISA中針對BCG的反應(yīng)性。
[0162] [圖12]顯示使用二價抗體的抗酸桿菌LAM檢測ELISA的檢測靈敏性（實施例8)。 在該圖中，表格是核酸擴增檢測（NAAT)與抗酸桿菌LAM檢測ELISA之間的檢測靈敏性的比 較。
[0163] [圖13]顯示抗酸桿菌LAM檢測ELISA關(guān)于口腔細(xì)菌的交叉反應(yīng)性檢測的結(jié)果（實 施例9)。在該圖中，"Na"意指星形諾卡菌（N. asteroids)的細(xì)菌細(xì)胞，"Nf"意指皮疽諾卡 菌（N.faroinica)的細(xì)菌細(xì)胞，"Sg"意指鏈霉菌屬（Streptomyces)的細(xì)菌細(xì)胞，"Ca"意指 白色念珠菌（C. albicans)的細(xì)菌細(xì)胞，"Ai"意指放線菌屬（Actinomycete)的細(xì)菌細(xì)胞， "Tp"意指少變家村菌（T. paurometabolum)的細(xì)菌細(xì)胞。此處顯示的是使用由每種這些培 養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞和培養(yǎng)的BCG細(xì)菌細(xì)胞提取的LAM進(jìn)行的抗酸桿菌LAM檢測ELISA的結(jié)果。
[0164] [圖14]顯示在使用二價抗體的LAM檢測ELISA中針對抗酸桿菌臨床分離株的反 應(yīng)性（實施例10)。在該圖中，"A"表示38個結(jié)核桿菌臨床分離株的測定結(jié)果，"B"表示29 個非結(jié)核性抗酸桿菌菌株（23個鳥分枝桿菌菌株、6個胞內(nèi)分枝桿菌（M. intracellulare)) 的測定結(jié)果。該圖中的A和B中，黑色柱表示抗酸桿菌LAM檢測ELISA的測定結(jié)果，白色 柱表示結(jié)核桿菌LAM檢測ELISA的測定結(jié)果。在B中的29個非結(jié)核性抗酸桿菌菌株中， Nos. 1-23是23個鳥分枝桿菌菌株的結(jié)果，Nos. 24-29是6個胞內(nèi)分枝桿菌菌株的結(jié)果。
[0165] [圖15]顯示抗酸桿菌LAM檢測ELISA與結(jié)核桿菌LAM檢測ELISA中的反應(yīng)性的 比率（抗酸桿菌LAM檢測ELISA的值/結(jié)核桿菌LAM檢測ELISA的值）。
[0166] [圖16]顯示使用二價抗體在結(jié)核桿菌LAM檢測ELISA (左圖）和在抗酸桿菌LAM 檢測ELISA(右圖）中針對臨床痰液樣品的反應(yīng)性（實施例11)。在該圖中，"I"表示在涂 片檢查（直接涂片檢查）中為陰性的且在核酸擴增檢測中為陰性的樣品組的結(jié)果，"II"表 示在涂片檢查中為"不足的（scanty) "且在核酸擴增檢測中為陰性的樣品的結(jié)果，"III"表 示在涂片檢查中為陰性的且在核酸擴增檢測中為陽性的樣品組的結(jié)果，"IV"表示在涂片檢 查中為"不足的"且在核酸擴增檢測中為陽性的樣品組的結(jié)果，"V"表示在涂片檢查中評分 1+的樣品組的結(jié)果，"VI"表示在涂片檢查中評分2+的樣品組的結(jié)果，"VII"表示在涂片檢 查中評分3+的樣品組的結(jié)果。應(yīng)該注意，在涂片檢查中評分等于或高于1+的樣品在核酸 擴增檢測中都是陽性的。此外，虛線表示暫定的截點值。
[0167] [圖17]顯示在LAM檢測ELISA中檢測的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)與LAM濃度之間的相關(guān)性（實 施例11)。在該圖中，"I"表示在涂片檢查中為陰性的且在核酸擴增檢測中為陰性的樣品組 的結(jié)果，"II"表示在涂片檢查中為陰性的且在核酸擴增檢測中為陽性的樣品的結(jié)果，"III" 表示在涂片檢查中為"不足的"且在核酸擴增檢測中為陽性的樣品組的結(jié)果，"IV"表示在涂 片檢查中評分1+的樣品組的結(jié)果，"V"表示在涂片檢查中評分2+的樣品組的結(jié)果，"VI"表 示在涂片檢查中評分3+的樣品組的結(jié)果。應(yīng)該注意，在涂片檢查中評分等于或高于1+的 樣品在核酸擴增檢測中都是陽性的。此外，每個樣品組中的線表示平均LAM濃度值。
[0168] [圖18]顯示抗酸桿菌LAM針對滅菌處理的穩(wěn)定性。白色柱表示未滅菌的細(xì)菌細(xì) 胞的測定結(jié)果，黑色柱表示已經(jīng)在100°c煮沸30分鐘的細(xì)菌細(xì)胞的測定結(jié)果，灰色柱表示 已經(jīng)在高壓蒸汽中滅菌（在121 °C高壓滅菌15分鐘）的細(xì)菌細(xì)胞的測定結(jié)果（實施例12)。
[0169] [圖19]顯示高壓蒸汽滅菌處理（高壓滅菌）后LAM的儲存穩(wěn)定性。白色柱表示 緊接在高壓蒸汽滅菌處理后的細(xì)菌細(xì)胞的測定結(jié)果，黑色柱表示在高壓蒸汽滅菌處理后已 在25°C放置7天的細(xì)菌細(xì)胞的測定結(jié)果（實施例12)。
[0170] 實施方案描述
[0171] (I)特異件結(jié)合抗酸桿菌LAM的單克降抗體
[0172] 結(jié)核桿菌屬于分枝桿菌科（Mycobacteriaceae)的分枝桿菌屬（Mycobacterium), 并且是一種與其他屬于分枝桿菌的細(xì)菌一起稱作抗酸桿菌的細(xì)菌組類型。然而，結(jié)核桿菌 通過其能夠在37°C生長而不能在28°C生長的事實和通過其具有耐熱性過氧化氫酶的事實 而與其他抗酸桿菌（非結(jié)核性抗酸桿菌）區(qū)分開來。已知四種類型的結(jié)核桿菌，即，結(jié)核桿 菌（結(jié)核分枝桿菌，人結(jié)核桿菌），牛結(jié)核桿菌（牛分枝桿菌（M. bovis)，牛結(jié)核桿菌，牛桿 菌），非洲分枝桿菌（Mycobacterium africanum) (Mafricans)和田鼠結(jié)核桿菌（田鼠分枝 桿菌（M. microti))。在這些中，人結(jié)核桿菌（結(jié)核分枝桿菌）作為引起結(jié)核病的細(xì)菌對人 是致病性的，牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌（M.africans)極少感染人。田鼠分枝桿菌對人沒 有致病性。此外，BCG通過經(jīng)由連續(xù)長期的傳代培養(yǎng)使牛分枝桿菌減毒而獲得，并且用作用 于結(jié)核病預(yù)防的疫苗（減毒活細(xì)菌疫苗）。
[0173] 作為本發(fā)明的主題的單克隆抗體（以下，還稱為"MoAb"）是這樣的抗體，S卩，其區(qū) 分抗酸桿菌與體內(nèi)存在的其他細(xì)菌并且特異性識別抗酸桿菌。更具體地，其是一種區(qū)分抗 酸桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM)與其他細(xì)菌的LAM-樣抗原，并且特異性結(jié)合抗酸桿菌的 LAM。此處所述的LAM是一種形成包括結(jié)核桿菌的分枝桿菌屬（抗酸桿菌）細(xì)菌的細(xì)胞膜 和細(xì)胞壁的主要脂聚糖。通常，LAM包括甘露糖基磷脂酰肌醇錨定（MPI)、包括D-甘露聚糖 核心和D-阿拉伯聚糖結(jié)構(gòu)域的糖骨架和封端基序。然而，取決于細(xì)菌類型，在分子內(nèi)包括 的多個糖殘基（例如，甘露糖）的數(shù)量、糖鏈的分支結(jié)構(gòu)、?；鶊F的數(shù)目和形成?；鶊F 的脂肪酸類型中存在差別。
[0174] 具體地，本發(fā)明的MoAb包括具有下述結(jié)構(gòu)的抗體：其中包括下述（a)-(c)的重鏈 ⑶R1-⑶R3的重鏈可變區(qū)與包括下述（d)-(f)的輕鏈⑶R1-⑶R3的輕鏈可變區(qū)通過接頭連 接在一起。為了便利，這種MoAb還稱為"MoAb 1"。
[0175] (a)由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R1。
[0176] (b)由SEQ ID N0 :2所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR2。
[0177] (c)由SEQ ID N0 :3所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R3。
[0178] (d)由SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R1。
[0179] (e)由SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR2。
[0180] (f)由SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR3。
[0181] 此外，具體地，本發(fā)明的MoAb包括具有下述結(jié)構(gòu)的抗體：其中包括下述（g)-(i)的 重鏈⑶R1-⑶R3的重鏈可變區(qū)與包括下述（j)-(1)的輕鏈⑶R1-⑶R3的輕鏈可變區(qū)通過接 頭連接在一起。為了便利，這種MoAb還稱為"M〇Ab2"。
[0182] (g)由SEQ ID NO :31所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR1。
[0183] (h)由SEQ ID N0 :32所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R2。
[0184] ⑴由SEQ ID N0 :33所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR3。
[0185] (j)由SEQ ID N0 :34所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR1。
[0186] (k)由SEQ ID N0 :35所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R2。
[0187] (1)由SEQ ID N0 :36所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R3。
[0188] 此外，具體地，本發(fā)明的MoAb包括具有下述結(jié)構(gòu)的抗體：其中包括下述（m)-(o)的 重鏈⑶R1-⑶R3的重鏈可變區(qū)與包括下述（p)-(r)的輕鏈⑶R1-⑶R3的輕鏈可變區(qū)通過接 頭連接在一起。為了便利，這種MoAb還稱為"M 〇Ab3"。
[0189] (m)由SEQ ID NO :47所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR1。
[0190] (η)由SEQ ID N0 :48所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR2。
[0191] (〇)由SEQ ID N0 :49所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR3。
[0192] (p)由SEQ ID N0 :50所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR1。
[0193] (q)由SEQ ID N0 :51所示的氨基酸序列組成的輕鏈CDR2。
[0194] (r)由SEQ ID N0 :52所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R3。
[0195] 此處，"CDR"是還稱為互補性決定區(qū)的"Complementarity Determining Region(互補性決定區(qū)）"的縮寫。CDRs是存在于免疫球蛋白可變區(qū)中的區(qū)域，并且是深入 參與抗體與抗原的特異性結(jié)合的區(qū)域。在這些中，"重鏈⑶R"是指存在于免疫球蛋白的重 鏈的可變區(qū)的CDR，"輕鏈CDR"是指存在于免疫球蛋白的輕鏈的可變區(qū)的CDR。
[0196] 重鏈可變區(qū)是包括重鏈⑶R1-⑶R3的區(qū)域，輕鏈可變區(qū)是包括輕鏈⑶R1-⑶R3的 區(qū)域。盡管對這些CDR1-CDR3的排列順序（優(yōu)選地，在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)二者中） 沒有特別的限制，但是，⑶R1、⑶R2和⑶R3按照這一順序在從N端一側(cè)到C端一側(cè)的方向 連續(xù)的或通過其他氨基酸序列排列。
[0197] 本發(fā)明的MoAb的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，在上述⑶R1-⑶R3之外的上述可 變區(qū)中的區(qū)域中可以具有作為其他氨基酸序列的稱為構(gòu)架區(qū)（以下，簡稱為"FR"）的氨基 酸序列。FR的氨基酸序列可以是來源于免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的構(gòu)架區(qū) (FR)的氨基酸序列、其變體或其通過在來源于FR的氨基酸序列的一部分中引入限制性酶 識別位點而獲得的部分修飾。
[0198] 在免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)中，例如，重鏈可變區(qū)的N端與上述⑶R1之間的區(qū) 域定義為"FR1"，⑶R1與⑶R2之間的區(qū)域定義為"FR2"，⑶R2與⑶R3之間的區(qū)域定義為 "FR3"，并且⑶R3與重鏈可變區(qū)的C端之間的區(qū)域定義為"FR4"。類似地，在免疫球蛋白的 輕鏈可變區(qū)中，例如，輕鏈可變區(qū)的N端與⑶R1之間的區(qū)域定義為"FR1"，⑶R1與⑶R2之 間的區(qū)域定義為"FR2"，⑶R2與⑶R3之間的區(qū)域定義為"FR3"，并且⑶R3與可變區(qū)的C端 之間的區(qū)域定義為"FR4"。
[0199] 這些FRs具有作為連接上述⑶R1XDR2和⑶R3 (作為抗原識別序列是重要的）中 的每一個的接頭的功能，并且是有助于形成可變區(qū)的三維構(gòu)象的區(qū)域。
[0200] 在本發(fā)明的MoAbl中，重鏈可變區(qū)優(yōu)選地具有SEQ ID N0 :7所示的119個氨基酸 殘基的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)優(yōu)選地具有SEQ ID NO :8所示的112個氨基酸殘基的氨基 酸序列。在顯示重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的SEQ ID NO :7中，從N端至第30個氨基酸的區(qū) 域?qū)?yīng)于重鏈可變區(qū)的"FR1"，從第31個氨基酸至第35個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于重鏈 可變區(qū)的"⑶Rl"（SEQ ID NO :1)，從第36個氨基酸至第49個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于 "FR2"，從第50個氨基酸至第65個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"CDR2"（SEQ ID NO :2)，從 第66個氨基酸至第96個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR3"，從第97個氨基酸至第106個 氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"⑶R3"（SEQ ID NO :3)，并且從第107個氨基酸至第119個氨 基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR4"。
[0201] 此外，在顯示本發(fā)明的MoAbl的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的SEQ ID N0 :8中，從N 端至第23個氨基酸的區(qū)域?qū)?yīng)于輕鏈可變區(qū)的"FR1"，東堤24個氨基酸至第36個氨基酸 的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于輕鏈可變區(qū)的"⑶Rl"（SEQ ID NO :4)，從第37個氨基酸至第51個氨 基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR2"，從第52個氨基酸至第58個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于 "CDR2"（SEQ ID NO :5)，從第59個氨基酸至第89個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR3"，從 第90個氨基酸至第102個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"⑶R3"(SEQ ID NO :6)，從第103個 氨基酸至第112個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR4"。
[0202] 在本發(fā)明的MoAb2中，重鏈可變區(qū)優(yōu)選地具有SEQ ID N0 :37所示的130個氨基酸 殘基的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)優(yōu)選地具有SEQ ID N0 :38所示的116個氨基酸殘基的氨基 酸序列。在顯示重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的SEQ ID N0 :37中，從N端至第35個氨基酸的 區(qū)域?qū)?yīng)于重鏈可變區(qū)的"FR1"，從第36個氨基酸至第40個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于 重鏈可變區(qū)的"⑶R1"(SEQ ID N0 :31)，從第41個氨基酸至第54個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?應(yīng)于"FR2"，從第55個氨基酸至第74個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"CDR2"（SEQ ID N0 : 32)，從第75個氨基酸至第106個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR3"，從第107個氨基酸至 第119個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"⑶R3"(SEQ ID NO :33)，以及從第120個氨基酸至第 130個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR4"。
[0203] 此外，在顯示本發(fā)明的MoAb2的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的SEQ ID N0 :38中，從 N端至第20個氨基酸的區(qū)域?qū)?yīng)于輕鏈可變區(qū)的"FR1"，從第21個氨基酸至第28個氨基 酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于輕鏈可變區(qū)的"⑶R1"(SEQ ID N0 :34)，從第29個氨基酸至第44個 氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR2"，從第45個氨基酸至第51個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于 "⑶R2"(SEQ ID NO :35)，從第52個氨基酸至第83個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR3"，從 第84個氨基酸至第95個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"⑶R3"(SEQ ID NO :36)，以及從第96 個氨基酸至第116個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR4"。
[0204] 在本發(fā)明的MoAb3中，重鏈可變區(qū)優(yōu)選地具有SEQ ID N0 :53所示的121個氨基酸 殘基的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)優(yōu)選地具有SEQ ID N0 :54所示的110個氨基酸殘基的氨基 酸序列。在顯示重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的SEQ ID N0 :53中，從N端至第30個氨基酸的 區(qū)域?qū)?yīng)于重鏈可變區(qū)的"FR1"，從第31個氨基酸至第35個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于重 鏈可變區(qū)的"⑶R1"(SEQ ID NO :47)，從第36個氨基酸至第49個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng) 于"FR2"，從第50個氨基酸至第65個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"CDR2"(SEQ ID NO :48)， 從第66個氨基酸至第96個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR3"，從第97個氨基酸至第108 個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"⑶R3"(SEQ ID NO :49)，以及從第109個氨基酸至第121個 氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR4"。
[0205] 此外，在顯示本發(fā)明的MoAb3的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的SEQ ID N0 :54中，從 N端至第23個氨基酸的區(qū)域?qū)?yīng)于輕鏈可變區(qū)的"FR1"，從第24個氨基酸至第34個氨基 酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于輕鏈可變區(qū)的"⑶R1"(SEQ ID N0 :50)，從第35個氨基酸至第49個 氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR2"，從第50個氨基酸至第56個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于 "⑶R2"(SEQ ID NO :51)，從第57個氨基酸至第87個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR3"，從 第88個氨基酸至第100個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"⑶R3"（SEQ ID NO :52)，以及從第 101個氨基酸至第110個氨基酸的氨基酸區(qū)域?qū)?yīng)于"FR4"。
[0206] 只要不損害本發(fā)明的MoAbl和MoAb2的有利作用，可以在對應(yīng)于SEQ ID N0S :7， 37和53所示的重鏈可變區(qū)的FR1-FR4的氨基酸序列和對應(yīng)于SEQ ID N0S :8, 38和54所示 的輕鏈可變區(qū)的FR1-FR4的氨基酸序列的任一種中引入突變。此處，除非特別另外指明，否 則，"本發(fā)明的MoAbl、M 〇Ab2和M〇Ab3的有利作用"意指與抗酸桿菌LAM的結(jié)合，優(yōu)選地意 指與抗酸桿菌LAM的特異性結(jié)合。具體地，"本發(fā)明的MoAbl的有利作用"意指與結(jié)核桿菌 LAM的結(jié)合，優(yōu)選地意指與結(jié)核桿菌LAM的特異性結(jié)合。盡管對可以引入的突變的數(shù)目也沒 有特別的限制，但是，可以設(shè)定引入的突變的數(shù)目，以使與突變前的氨基酸序列的氨基酸序 列同一性為85%以上，優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上，并且特別優(yōu)選地98%以上。應(yīng)該 注意，此處所述的引入突變可以包括氨基酸置換、缺失和插入。此外，可以向重鏈可變區(qū)的 FR1和/或輕鏈/重鏈可變區(qū)的FR4中引入限制性酶識別位點。
[0207] 此外，在MoAbl和MoAb3中所示的重鏈可變區(qū)的FR1-FR4與輕鏈可變區(qū)的FR1-FR4 均為來源于兔的氨基酸序列，而MoAb2中所示的重鏈可變區(qū)的FR1-FR4與輕鏈可變區(qū)的 FR1-FR4均為來源于雞的氨基酸序列。然而，只要不損害本發(fā)明的MoAb的有利效果，可以 使用來源于任何動物物種的構(gòu)架區(qū)。所述動物物種的實例可以包括，但不特別限于，人，兔， 雞，馬，牛，山羊，綿羊，狗，小鼠，倉鼠和大鼠。氨基酸序列優(yōu)選地來源于兔、雞或人，并且更 優(yōu)選地來源于人。應(yīng)該注意，人源的FR1-FR4的氨基酸序列在本領(lǐng)域中是已知的（Kabat， 等，US Department of Health AND human Services (美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部），NIH(1991)， USA)，并且，例如，記述在NCBI的網(wǎng)站上。
[0208] 本發(fā)明的MoAb具有下述結(jié)構(gòu)：其中具有上述構(gòu)型的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū) 通過接頭連接在一起。關(guān)于此處的"接頭"，沒有特別的限制，只要本發(fā)明的MoAb的有利 效果不被損害，并且其實例可以包括具有由通常為約8-30個、優(yōu)選約8-20個、更優(yōu)選約 8-15個氨基酸殘基數(shù)目的氨基酸序列形成的接頭序列的肽。優(yōu)選的接頭序列的實例包 括，但不限于，GS 接頭序列[(Gly-Gly-Gly-Ser:SEQ ID N0:9)n，（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser: SEQ ID NO :10)n;n為重復(fù)的數(shù)目]等。優(yōu)選地，具有1-3個（n為1-3的整數(shù)）所述 GS接頭序列的重復(fù)的序列的肽用作接頭。在下文所述的實施例中，具有三個GS接頭序 列重復(fù)的序列（GGGGSGGGGSGGGGS:SEQ ID N0:11)的肽（實施例1)和具有另一種序列 (GGGGSGGDGSGGGGS :SEQ ID NO :40)的肽（實施例 6)用作接頭。
[0209] 本發(fā)明的MoAbl的優(yōu)選的模式可以是由SEQ ID N0 :12所示的氨基酸序列組成的 單鏈抗體。此外，MoAb2的優(yōu)選的模式可以是由SEQ ID N0 :39所示的氨基酸序列組成的單 鏈抗體。此外，MoAb3的優(yōu)選的模式可以是由SEQ ID N0 :30所示的氨基酸序列組成的單鏈 抗體。
[0210] 本發(fā)明所述的單克隆抗體包括從非結(jié)核性抗酸桿菌區(qū)分并特異性識別結(jié)核桿菌 的抗體。更具體地，其包括區(qū)分結(jié)核桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM)與非結(jié)核性抗酸桿 菌的LAMs并且特應(yīng)性結(jié)合結(jié)核桿菌LAM的抗體。單克隆抗體的實例可以包括上文所述的 MoAbl。與非結(jié)核桿菌抗酸桿菌區(qū)分并且由本發(fā)明的MoAb特異性識別的結(jié)核桿菌優(yōu)選是人 結(jié)核桿菌（結(jié)核分枝桿菌）和牛結(jié)核桿菌（牛分枝桿菌），更優(yōu)選是人結(jié)核桿菌（結(jié)核分枝 桿菌）.
[0211] 當(dāng)通過競爭方法比較針對結(jié)核桿菌LAM的反應(yīng)時，當(dāng)非結(jié)核性抗酸桿菌LAM需要 的量是結(jié)核桿菌LAM的量的10倍以上時，可以認(rèn)為是關(guān)于結(jié)核桿菌LAM的特異性結(jié)合。 此外，當(dāng)通過使用固定的抗體和檢測抗體的夾心法檢測到LAM時，如果針對非結(jié)核性抗酸 桿菌LAM的反應(yīng)性已經(jīng)減小為針對結(jié)核桿菌LAM的反應(yīng)性的1/100,則可以確定本發(fā)明的 MoAb具有更優(yōu)先的針對結(jié)核桿菌LAM的結(jié)合特異性。
[0212] 抗體的親和力可以容易地使用目前已知的技術(shù)來測量，例如，測量1251標(biāo)記的IgG 或其片段的飽和結(jié)合等溫線的技術(shù)，或通過Motilsky在Analyzing Data with GraphPad Prizm(1999)，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA 中所述的使用未標(biāo)記的 IgG 同源置 換125IgG的非線性回歸分析來測量。本領(lǐng)域已知的其他方法可以用于所述測量，并且，所述 方法可以是，例如，Scatchard等，Ann. NYAcd. Sci.，51，660 (1949)中所述的方法。
[0213] 本發(fā)明的MoAb可以按照但不限于噬菌體展不法（G Smith，Science (科學(xué)），228， 1315 (1985))使用結(jié)核桿菌作為抗原來產(chǎn)生。此處，結(jié)核桿菌的實例可以包括上述結(jié)核桿菌 (結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis),人結(jié)核桿菌），牛結(jié)核桿菌（牛分枝桿菌， 牛結(jié)核桿菌，牛桿菌），非洲分枝桿菌，和田鼠結(jié)核桿菌。優(yōu)選結(jié)核桿菌（結(jié)核分枝桿菌，人 結(jié)核桿菌），牛結(jié)核桿菌（牛分枝桿菌，牛結(jié)核桿菌，牛桿菌）和非洲分枝桿菌，并且更優(yōu)選 牛結(jié)核桿菌。如上文所述，通過連續(xù)長期傳代培養(yǎng)使牛結(jié)核桿菌（牛分枝桿菌）減毒獲得 BCG。
[0214] 使用BCG作為抗原利用噬菌體展示產(chǎn)生本發(fā)明的MoAb的方法記述在實施例中。如 上文所述，本發(fā)明的MoAb的特征是區(qū)分抗酸桿菌與其他細(xì)菌諸如口腔細(xì)菌并且特異性識 別抗酸桿菌，更具體地，區(qū)分抗酸桿菌LAM與其他細(xì)菌的LAM-樣抗原，并且特異性結(jié)合抗酸 桿菌LAM。所述特征是優(yōu)選區(qū)分結(jié)核桿菌與非結(jié)核性抗酸桿菌并且特異性識別結(jié)核桿菌， 并且更具體地，區(qū)分結(jié)核桿菌LAM與非結(jié)核性抗酸桿菌LAM并且特異性結(jié)合結(jié)核桿菌LAM。 可以使用BCG作為免疫原產(chǎn)生所述MoAb。
[0215] 應(yīng)該注意，如上文所述，BCG是由牛結(jié)核桿菌（牛分枝桿菌）產(chǎn)生的減毒菌株，并 且是指具有抗原性但是沒有或減少的對人的毒性的細(xì)菌。然而，在本發(fā)明中，不僅此，而且 使用該細(xì)菌產(chǎn)生的BCG疫苗也稱為"BCG"。
[0216] 此外，本發(fā)明的單克隆抗體包括是上文所述的單鏈抗體的多價抗體。盡管多 價抗體包括二價抗體、三價抗體和四價抗體，但是優(yōu)選二價抗體。這些多價抗體可以 按照目前已知的方法產(chǎn)生（非專利文獻(xiàn)7 :K. Zuberbuhler，Protein Engineering, Design&Selection(蛋白質(zhì)工程、設(shè)計和選擇），22,169(2009))。具體地，多價抗體可以這 樣產(chǎn)生，例如，在使用二價抗體的情形中，使用恒定區(qū)的基因連接單鏈抗體的重鏈和輕鏈的 基因，將所連接的基因克隆到能夠在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的載體中，用包含所述基因的載 體轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞，并且培養(yǎng)所述細(xì)胞。
[0217] (II)用于免疫非人動物以產(chǎn)牛特異件結(jié)合抗酸桿菌LAM、優(yōu)詵結(jié)核桿菌LAM的單 克降抗體的方法和用于產(chǎn)牛所沭單克降抗體的方法
[0218] 本發(fā)明還涉及用于免疫非人動物以產(chǎn)生特異性結(jié)合抗酸桿菌LAM的MoAb的方法， 和使用該免疫方法產(chǎn)生MoAb的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于免疫非人動物以產(chǎn)生特異 性結(jié)合結(jié)核桿菌LAM的方法，和使用該免疫方法產(chǎn)生MoAb的方法。
[0219] (II-1)免疫方法
[0220] 除了在甘露糖封端結(jié)構(gòu)中觀察到的微小的差別之外，抗酸桿菌LAMs的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu) 幾乎是相同的。當(dāng)產(chǎn)生針對所述抗酸桿菌LAM的抗體時，通常使用人結(jié)核桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株 如H37Rv作為免疫原免疫非人動物。通過這樣做，可以產(chǎn)生廣泛與抗酸桿菌LAM反應(yīng)的抗 體。
[0221] 另一方面，當(dāng)使用BCG(即，由牛結(jié)核桿菌（牛分枝桿菌）產(chǎn)生的減毒菌株）或由 其產(chǎn)生的疫苗作為免疫原免疫非人動物時，可以獲得高特異性抗體，所述高特異性抗體通 過區(qū)分結(jié)核桿菌LAM與非結(jié)核性抗酸桿菌的LAMs而特異性結(jié)合結(jié)核桿菌LAM，優(yōu)選人結(jié)核 桿菌的LAM。作為優(yōu)選的模式，本發(fā)明提供使用BCG作為免疫原（免疫用抗原）免疫非人動 物的方法，作為產(chǎn)生特異性結(jié)合人結(jié)核桿菌的LAM的MoAb的免疫方法。
[0222] 此處，非人動物可以是除人之外的動物，其實例包括哺乳動物，如小鼠、大鼠、倉 鼠、豚鼠、兔、猴子、狗、山羊、綿羊、豬、馬和牛，以及鳥類，如雞、鴨、火雞和鵪_。優(yōu)選哺乳動 物（小動物），諸如小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠和兔，并且更優(yōu)選兔。
[0223] 本發(fā)明產(chǎn)生特異性結(jié)合結(jié)核桿菌LAM的MoAb的免疫方法特征在于，使用BCG作為 免疫原（免疫用抗原）免疫非人動物；并且用于免疫的技術(shù)沒有特別的限制，并且可以適當(dāng) 地選擇使用本領(lǐng)域已知的方法。
[0224] 其實例包括通過皮下、靜脈內(nèi)或腹內(nèi)注射BCG以及必要時連同佐劑一起的施用方 法。優(yōu)選皮下施用。所述佐劑的實例可以包括，但不限于，完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐 齊U。應(yīng)該注意，施用BCG優(yōu)選在第一次施用（第一次免疫）后以約2周的時間間隔進(jìn)行約 2-5 次。
[0225] 以所述方式免疫的非人動物的脾細(xì)胞可用作用于產(chǎn)生對結(jié)核桿菌LAM、優(yōu)選人結(jié) 核桿菌的LAM高度特異性的抗體的細(xì)胞。在第一次Beg免疫后十個單數(shù)日至數(shù)周從免疫的 非人動物取出脾，并且用來產(chǎn)生和獲得對結(jié)核桿菌LAM、優(yōu)選人結(jié)核桿菌的LAM高度特異性 的抗體。
[0226] 具體地，例如，由從免疫的非人動物取出的脾制備的細(xì)胞（抗體產(chǎn)生細(xì)胞）與骨髓 瘤細(xì)胞按照目前已知的方法使用聚乙二醇法或電刺激融合，并且在HAT選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng) 所述細(xì)胞，從而獲得雜交瘤。然后，通過從所述雜交瘤篩選，可以獲得產(chǎn)生結(jié)合結(jié)核桿菌LAM 的抗體（使用目前已知的方法，諸如限制性稀釋分析）的雜交瘤，對結(jié)核桿菌LAM高特異性 的MoAb的雜交瘤。通過使用目前已知的方法的培養(yǎng)，雜交瘤以這樣的方式克隆，可能制備 并獲得對需要的結(jié)核桿菌的LAM、優(yōu)選人結(jié)核桿菌的LAM高特異性的MoAb。
[0227] 不管是結(jié)核桿菌還是非結(jié)核性抗酸桿菌，用于制備并獲得與寬范圍的抗酸桿菌的 LAMs選擇性結(jié)合的MoAb的方法的實例可以包括使用LAM與上述獲得的對結(jié)核桿菌LAM、優(yōu) 選人結(jié)核桿菌的LAM高度特異性的抗體的復(fù)合物選擇抗體的方法。在這一情形中，用于免 疫的技術(shù)沒有特別限制，并且可以適當(dāng)?shù)剡x擇使用本領(lǐng)域已知的方法。應(yīng)該注意，本文所述 的"復(fù)合物"是指形成LAM與對結(jié)核桿菌LAM高特異性的抗體的抗原-抗體復(fù)合物，并且所 述復(fù)合物的產(chǎn)生可以通過使用ELISA進(jìn)行分析來確定。
[0228] (II-2)用于產(chǎn)牛特異件結(jié)合抗酸桿菌LAM、優(yōu)詵結(jié)核桿菌LAM的MoAb的方法
[0229] 特異性結(jié)合抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的LAM的MoAb可以使用已經(jīng)用上述免疫方法 免疫的非人動物（免疫的非人動物）來產(chǎn)生。
[0230] 所述方法的實例包括從上述免疫的非人動物中取出脾，由取出的脾制備細(xì)胞（抗 體生成細(xì)胞），按照目前已知的方法使用聚乙二醇或電刺激將所述細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合 以獲得雜交瘤，從所獲得的雜交瘤中選擇產(chǎn)生特異性結(jié)合抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的LAM 的MoAb，并且培養(yǎng)所述雜交瘤。以這種方式，可以制備并獲得對抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的 LAM、更優(yōu)選人結(jié)核桿菌的LAM高度特異性的MoAb。此處，培養(yǎng)雜交瘤可以在非人動物（如 小鼠或兔）的腹內(nèi)進(jìn)行，或者可以使用培養(yǎng)皿等在體外進(jìn)行。在前一種方法中，即，在非人 動物的腹內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤，在培養(yǎng)后收集非人動物的腹水，并且從所述腹水分離并純化需要 的MoAb。在后一種方法中，即，在體外培養(yǎng)雜交瘤，從在培養(yǎng)后獲得的培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基中 分離并純化需要的MoAb?？顾隹贵w的亞類為IgG時，用于純化單克隆抗體的方法的實例 可以包括使用蛋白質(zhì)A的親和層析法。
[0231] 此外，特異性結(jié)合抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的LAM的MoAb也可以使用近年來開發(fā) 的噬菌體展示法產(chǎn)生（非專利文獻(xiàn)6 :Winter等，Annu. Rev. Immunol.(免疫學(xué)年度綜述）， 12 :433,1994)。具體地，從通過上述方法免疫的免疫的非人動物取出脾，由該取出的脾制備 總RNA或mRNA，使用所述RNA作為模板制備cDNA，并且制備編碼抗體的可變區(qū)的單鏈抗體 (scFv :可變區(qū)的單鏈片段）的基因。此處，關(guān)于抗體的可變區(qū)，只要它們中的每一個包括兩 個區(qū)，即，重鏈可變區(qū)（VH區(qū)）和輕鏈可變區(qū)（LH區(qū)），在所述VH區(qū)與LH區(qū)之前可以包括任 何肽接頭。例如，如（I)所述，肽接頭可以是具有由約8-30個氨基酸殘基的氨基酸序列形 成的接頭序列的肽，并且所述接頭序列的實例包括GS接頭序列。
[0232] 將所述基因克隆到噬菌粒載體中，并且引入到大腸桿菌（Escherichia coli)中， 然后將其轉(zhuǎn)染噬菌體以允許scFv抗體在噬菌體莢膜上的表達(dá)（制備scFv展示噬菌體文 庫）。
[0233] 當(dāng)使用BCG作為非人動物的免疫法中的免疫原（免疫用抗原）時，可以獲得并產(chǎn) 生特異性結(jié)合結(jié)核桿菌LAM、優(yōu)選人結(jié)核桿菌的LAM的單克隆抗體（scFv抗體），這通過下 述進(jìn)行：使用已經(jīng)用作免疫用抗原的BCG，用表達(dá)scFv抗體的scFv展示噬菌體文庫進(jìn)行生 物淘選（bio-panning)，并且隨后使用具有固相的結(jié)核桿菌LAM、優(yōu)選人結(jié)核桿菌的LAM的 抗原平板進(jìn)行生物淘選。
[0234] 此外，作為選擇對分枝桿菌的LAM高度特異性的MoAb (單鏈抗體）的方法，可以獲 得并產(chǎn)生選擇性結(jié)合寬泛范圍的抗酸桿菌的LAMs的單鏈抗體（scFv抗體），而不管其是結(jié) 核桿菌還是非結(jié)核性抗酸桿菌，這通過下述進(jìn)行：使用其中LAM被具有抗-LAM抗體的載體 作為固相捕獲的抗體-抗原復(fù)合物，用表達(dá)scFv抗體的scFv展示噬菌體文庫進(jìn)行生物淘 選。
[0235] 應(yīng)該注意，關(guān)于總RNA或mRNA的制備，cDNA的制備，亞克隆到噬菌粒中，引入到 大腸桿菌中，用噬菌體感染，和篩選（生物淘選）特異性結(jié)合抗酸桿菌LAM、優(yōu)選結(jié)核桿菌 LAM、更優(yōu)選人結(jié)核桿菌的LAM的單克隆抗體（scFv抗體）的方法；可以使用本領(lǐng)域已知的 方法，并且更具體地，上述步驟可以使用下述實施例作為參比進(jìn)行。
[0236] (III)用于檢測抗酸桿菌、特別是結(jié)核桿菌的方法以及其中#用的抗酸桿菌（特 別是結(jié)核桿菌）檢測工具
[0237] 上文所述的本發(fā)明的MoAb可以用于檢測抗酸桿菌，優(yōu)選結(jié)核桿菌。換言之，使用 本發(fā)明的MoAb，可以確定受試者是否攜帶抗酸桿菌，特別是結(jié)核桿菌。也就是說，可以診斷 /檢測受試者是否感染抗酸桿菌，特別是結(jié)核桿菌。
[0238] 本發(fā)明的抗酸桿菌、特別是結(jié)核桿菌的檢測（診斷/測試）可以通過下述（1)和 (2)的步驟進(jìn)行：
[0239] (1)使本發(fā)明的MoAb與受試者的生物樣品（測試樣品）接觸的步驟，并且
[0240] (2)使用本發(fā)明的MoAb與抗酸桿菌LAM、特別是結(jié)核桿菌LAM之間的結(jié)合反應(yīng)作 為指標(biāo)測定所述測試樣品中存在的結(jié)核桿菌的步驟。
[0241] 在步驟（1)中與本發(fā)明的MoAb接觸的受試者的生物樣品（測試樣品）可以是其 中存在抗酸桿菌、特別是結(jié)核桿菌的生物樣品，并且所述生物樣品的實例可以包括痰液、唾 液、血液（血清、血漿）、肺洗出液、胃液、尿液、糞便、皮膚和胰液等。所述生物樣品優(yōu)選是痰 液、唾液或血液，并且更優(yōu)選是痰液或唾液。
[0242] 此處，進(jìn)行測定的受試者優(yōu)選是人，然而，除人之外的動物，諸如馬、牛、山羊、綿 羊、狗、雞、小鼠、倉鼠和大鼠也可以用作受試者。
[0243] 本發(fā)明的MoAb與所述生物樣品彼此接觸的條件沒有特別限制，只要是不損害本 發(fā)明的MoAb與抗酸桿菌LAM、優(yōu)選結(jié)核桿菌LAM之間的結(jié)合反應(yīng)的條件即可，并且使用免疫 反應(yīng)的一般條件。其方法的實例可以包括使得本發(fā)明的MoAb與含有抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿 菌的生物樣品在通常45°C以下、優(yōu)選約4-40°C、更優(yōu)選約25-40°C的溫度條件下共存；并且 放置或溫育該混合物約0. 5-40小時，并且優(yōu)選約1-20小時。此外，對于結(jié)合反應(yīng)中所用的 溶劑及其pH沒有特別的限制，只要對該反應(yīng)沒有不利作用即可；并且，按照或遵照目前已 知的方法，可以使用緩沖液（例如，檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液、乙酸鹽緩 沖液等），以使pH為約5-9。
[0244] 步驟（1)可以在本發(fā)明的MoAb被固定（固相的）狀態(tài)下（其中MoAb結(jié)合在固體 載體上的狀態(tài)）進(jìn)行。所述固定包括兩種情形：本發(fā)明的MoAb以可解離的方式和以不可解 離的方式結(jié)合在固體載體上。
[0245] 作為用于固定MoAb的固體載體，可以使用本領(lǐng)域常用的多種載體，并且其實例可 以包括寬泛范圍的制品，諸如由各種材料形成的棒（sticks)、珠子、平板（包括微量平板）、 試管等，所述各種材料如玻璃、纖維素粉、Sephadex、瓊脂糖、聚苯乙烯、濾紙、羧甲基纖維 素、硝基纖維素、離子交換樹脂、葡聚糖、塑料膜、塑料管、尼龍、玻璃珠、絲織品、聚胺-甲基 乙烯醚-馬來酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-馬來酸共聚物等。
[0246] 對固定方法沒有特別的限制，并且取決于不同的固體載體，可以使用物理粘結(jié)和 化學(xué)鍵合。其實例可以包括：化學(xué)反應(yīng)，如作為共價結(jié)合法的重氮基法，肽法（酸-酰胺衍 生物法、羧基氯化物樹脂法、碳二亞胺樹脂法、馬來酸酐衍生物法、異氰酸酯衍生物法、溴化 氰活化的多糖法、碳酸纖維素酯衍生物法和使用縮聚試劑的方法），烷基化法，使用交聯(lián)劑 的載體結(jié)合法（例如，使用戊二醒、六亞甲基異氰酸酯（hexamethylene isocyanate)等作 為交聯(lián)劑），和使用Ugi反應(yīng)的載體結(jié)合法；使用諸如離子交換樹脂的載體的離子鍵法；以 及使用多孔玻璃如玻璃珠作為載體的物理吸附法。
[0247] 在步驟（2)中，本發(fā)明的MoAb可以以使用任何標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記狀態(tài)使用。此處， 標(biāo)記物質(zhì)的實例可以包括：酶，諸如辣根過氧化物酶（HRP)和堿性磷酸酶；熒光物質(zhì)，如熒 光異氰酸酯和羅丹明；放射性物質(zhì)，如 32P和1251 ;著色物質(zhì)（染色物質(zhì)），如用膠體金屬（如 膠體金）和白色膠體或紅、藍(lán)等色素染色的膠乳，包括天然膠乳和合成膠乳，諸如聚苯乙烯 膠乳；以及化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。取決于不同的標(biāo)記物質(zhì)，用這些標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記MoAb可以按照目 前已知的方法進(jìn)行。
[0248] 步驟（2)是通過本發(fā)明的MoAb與抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的LAM之間的結(jié)合反 應(yīng)檢測/測定所獲得的免疫復(fù)合物（抗原-抗體結(jié)合的物質(zhì)）的步驟。此處，檢測/測 定免疫復(fù)合物（抗原-抗體結(jié)合的物質(zhì)）和用于其的條件沒有特別限制，并且可以使用 與常規(guī)免疫測定法相同或相符的方法和條件。具體地，取決于用于標(biāo)記MoAb的標(biāo)記物質(zhì) 的類型，可以使用通常用于免疫化學(xué)測定的多種方法，諸如例如，放射性同位素免疫測定 (RIA法），ELISA法，熒光抗體法，斑塊法，印跡法，凝集法，Ouchterlony法等（例如，參 見R&D planning Κ·Κ·于 1982 年3 月 5 日出版的 "Hybridoma method and monoclonal antibody (雜交瘤法和單克隆抗體）"的第30-53頁）。從靈敏性和簡單性觀點來看，步驟 (2)優(yōu)選按照ELISA法進(jìn)行，更優(yōu)選按照夾心法進(jìn)行。
[0249] 例如，當(dāng)使用固相夾心法時，例如，可以以下述方式測定測試樣品中作為抗酸桿 菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的測定靶標(biāo)。
[0250] 首先，將生物樣品（例如，痰液、唾液或血液等），作為包含是抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核 桿菌的測定靶標(biāo)的測試樣品，添加到通過固定（通過可解離的固定）引起與測定靶標(biāo)抗酸 桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的LAM的特異性抗原-抗體反應(yīng)的抗體而獲得的固相抗體中，以允許抗 原-抗體反應(yīng)發(fā)生。接著，例如，通過洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)；添加引起與測定靶標(biāo)抗酸桿 菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的特異性抗原-抗體反應(yīng)的抗體，以允許與上述產(chǎn)生的抗原-抗體結(jié)合物 質(zhì)中的測定靶標(biāo)細(xì)菌反應(yīng)；檢測（定性測量）在所述反應(yīng)中產(chǎn)生的抗原-抗體結(jié)合的物質(zhì) ("抗體-抗酸桿菌-抗體"復(fù)合物，并且優(yōu)選的是"抗體-結(jié)核桿菌-抗體"復(fù)合物）或者 測量其量（定量測量）。對于這一方法，在本發(fā)明中，本發(fā)明的MoAb，優(yōu)選MoAbl用作引起 與抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的LAM的特異性抗原-抗體反應(yīng)的抗體。
[0251] 抗原-抗體結(jié)合的物質(zhì)（"抗體-抗酸桿菌-抗體"復(fù)合物，并且優(yōu)選的是"抗 體-結(jié)核桿菌-抗體"復(fù)合物）的測定可以通過使用用上述任一種標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的抗體（標(biāo) 記的抗體）作為用來進(jìn)行與抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的LAM的抗原-抗體反應(yīng)的抗體中的 一種（本發(fā)明的MoAb，優(yōu)選MoAbl)而容易地進(jìn)行。為了允許測定更容易地進(jìn)行，例如，可以 使用用著色膠乳顆粒等（如膠體金等）標(biāo)記的抗體進(jìn)行的免疫層析法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 該充分知曉關(guān)于這些測定技術(shù)及其改進(jìn)的多種方式的選擇，并且本發(fā)明可以使用所述技術(shù) 中的任一種來實現(xiàn)（參見"Clinical Test Method Manual (臨床檢測方法手冊）'Kanehara Shuppan，1995,等）。
[0252] 例如，所述方法可以使用具有下述結(jié)構(gòu)的抗酸桿菌檢測工具、優(yōu)選結(jié)核桿菌檢測 工具（以下，還稱為"檢測工具"進(jìn)行）。所述檢測工具是用于確定人或動物的體液（包括 痰液、唾液和尿液）中存在抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的工具，即，確定抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿 菌感染的存在或不存在；并且包括由能夠通過毛細(xì)作用轉(zhuǎn)運測試樣品的材料形成的溶液吸 收片。
[0253] 所述溶液吸收片包括：
[0254] ⑴樣品收集部，其用于吸收和收集測試樣品；
[0255] (ii)標(biāo)記的抗體部，其負(fù)載有標(biāo)記的與所述測試樣品中的抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿 菌的LAM特異性反應(yīng)的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（本發(fā)明的MoAb);
[0256] (iii)確定部，其包括下文所述的檢測結(jié)果顯示部，
[0257] (a)所述檢測結(jié)果顯示部在其上固定有未標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（本發(fā)明 的MoAb)，所述抗體與抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的LAM特異性反應(yīng)；并且
[0258] (iv)溶液吸收部，其用于吸收已經(jīng)通過所述樣品收集部、標(biāo)記的抗體部和確定部 的測試樣品的殘余的溶液。
[0259] 應(yīng)該注意，除了（a)檢測結(jié)果顯示部之外，（iii)確定部包括還包括下文所述的與 檢測結(jié)果顯示部分開放置的對照顯示部：
[0260] (b)所述對照顯示部其上固定有未標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（本發(fā)明的 MoAb)，優(yōu)選未標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（本發(fā)明的MoAb 1)，所述抗體與標(biāo)記的抗-抗 酸桿菌LAM抗體（本發(fā)明的MoAb)、優(yōu)選標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（本發(fā)明的MoAb 1) 反應(yīng)。
[0261] 使用所述檢測工具，可以通過存在或不存在（a)檢測結(jié)果顯示部的顯色而確定測 試樣品中抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的存在。
[0262] 本發(fā)明的檢測工具包括由能夠通過毛細(xì)作用或?qū)游鲎饔茫ㄔ诒景l(fā)明中，這些總體 上稱為"毛細(xì)作用"）轉(zhuǎn)運測試樣品的材料形成的溶液吸收片。所述溶液吸收片可以是薄片 樣的片（以下，稱為"薄片樣片"），并且所述薄片樣片可以由單個薄片形成，或可以由堆疊 或彼此連接的多層薄片形成。備選地，所述溶液吸收片可以采用能夠通過毛細(xì)作用吸收并 轉(zhuǎn)運液體的各種形式，諸如長的和薄的棒型片等。應(yīng)該注意，本發(fā)明的檢測工具還可以包括 用于負(fù)載所述溶液吸收片的支持體。
[0263] 用于溶液吸收片的材料沒有特別限制，只要：所述材料具有允許溶劑（水、血清、 尿液和其他生物樣品）、檢測成分（抗酸桿菌，如結(jié)核桿菌）和包括所述檢測成分的復(fù)合物 (例如，標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（本發(fā)明的MoAbl)和結(jié)核桿菌的復(fù)合物[標(biāo)記的抗 體-結(jié)核桿菌]，或所述復(fù)合物與未標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（本發(fā)明的MoAbl)的復(fù) 合物[標(biāo)記的抗體-結(jié)核桿菌-抗體])滲透的多孔結(jié)構(gòu)或毛細(xì)結(jié)構(gòu)；并且，當(dāng)將含有所述 檢測成分的樣品應(yīng)用（收集、滴加、添加）到（1)所述樣品收集部時，所述材料允許所述測 試樣品在多孔結(jié)構(gòu)或毛細(xì)結(jié)構(gòu)內(nèi)轉(zhuǎn)運（擴散），甚至在轉(zhuǎn)運過程中當(dāng)所述測試樣品在其中 獲得抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（本發(fā)明的MoAbl)和所述復(fù)合物（標(biāo)記的抗體-結(jié)核桿菌） 時。其實例可以包括上述固體載體。上述這些中，優(yōu)選有機多孔體。應(yīng)該注意，有機多孔體 的實例可以包括天然纖維，諸如纖維素，纖維素衍生物，如硝基纖維素，和半合成的纖維素， 如乙酸纖維素，由合成的纖維形成的纖維聚集物，如聚乙烯，聚丙烯，尼龍和聚酯，多孔聚丙 烯，多孔聚苯乙烯，多孔聚甲基丙烯酸甲酯，多孔尼龍，多孔聚砜，多孔氟樹脂，和多孔合成 樹脂，如在其中引入親水基團的聚偏二氟乙烯。優(yōu)選天然纖維，如纖維素，和纖維素衍生物， 如硝基纖維素，和半合成的纖維，如乙酸纖維素。
[0264] 對所述溶液吸收片的尺寸沒有特別的限制；并且其優(yōu)選的尺寸是寬（短邊的長 度）約2-20mm，優(yōu)選在約4-10mm的范圍內(nèi)，長（長邊的長度）為20-200mm，優(yōu)選在30-150mm 的范圍內(nèi)。
[0265] 下文中，將參照附圖描述本發(fā)明一個實施方案的檢測工具。
[0266] 圖1中㈧和⑶顯示本發(fā)明的檢測工具的一種模式。圖1中㈧和⑶是從本發(fā) 明的檢測工具的側(cè)面觀察的示意圖。在所述檢測工具中，溶液吸收片包括用于收集（加入） 測試樣品的樣品收集部（1)，標(biāo)記的抗體部（2)，具有檢測結(jié)果顯示部（a)的確定部（3)，和 用于吸收已經(jīng)通過所述樣品收集部、標(biāo)記的抗體部和確定部的測試樣品的殘余的溶液的溶 液吸收部（4)。圖1的（B)顯示所述檢測工具在確定部（3)除檢測結(jié)果顯示部（a)外還包 括對照顯示部（b)。
[0267] 盡管在圖1所示的實例中，溶液吸收片是由多片薄片形成的薄片樣片，但是所述 薄片樣片可以由均一材料的單個薄片形成，或可以由多片相同或不同材料的薄片整體上形 成為單個薄片。應(yīng)該注意，整個薄片可以由多個薄片形成，或者可以具有部分由多個薄片形 成的部分。
[0268] 在圖1所示的實例中，薄片樣片粘合在支持體10上。在長邊方向上從一個末端邊 到另一個末端邊，所述薄片樣片依次包括形成樣品收集部（1)的薄片21，形成標(biāo)記的抗體 部（2)的薄片22,形成確定部（3)的薄片23,和形成溶液吸收部（4)的薄片24。此外，如 圖2所示，其可以具有這樣的構(gòu)型，其中薄片21的末端部分與薄片22的末端部分重合，薄 片22的末端部分與薄片23的末端部分重合，薄片23的末端部分與薄片24的末端部分重 合。通過具有這樣的構(gòu)型，溶液的移動可以順利進(jìn)行。
[0269] 樣品收集部（1)是用于吸收和收集作為測試靶標(biāo)的測試樣品的部分（測試樣品供 給部）。測試樣品的實例可以包括作為本發(fā)明的測定靶標(biāo)的受試者的生物樣品。
[0270] 如圖1和圖2所示，樣品收集部（1)可以放置在薄片樣片的末端部分（始端部）。
[0271] 形成標(biāo)記的抗體部（2)，其與上述樣品收集部（1)的末尾端接觸（圖1)，或其以與 樣品收集部（1)部分重合的狀態(tài)形成（圖2)。標(biāo)記的抗體部（2)以可解離的方式包括與測 試樣品中包含的抗酸桿菌LAM、優(yōu)選結(jié)核桿菌LAM特異性反應(yīng)的抗體。具體地，本發(fā)明的檢 測工具在形成標(biāo)記的抗體部（2)的薄片22上以可解離的方式包括抗-抗酸桿菌LAM抗體 (本發(fā)明的MoAb)，優(yōu)選抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（本發(fā)明的MoAbl)，所述抗體通過抗原-抗 體反應(yīng)特異性結(jié)合抗酸桿菌LAM、優(yōu)選結(jié)核桿菌LAM。此處，本發(fā)明的MoAb以被上述標(biāo)記物 質(zhì)中的任一種標(biāo)記的狀態(tài)使用，即，作為標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的 MoAb)，并且MoAbl作為標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)使用。
[0272] 在所述薄片樣片中采用的材料中，標(biāo)記的抗體部（2)優(yōu)選由親水性和吸水材料形 成，所述材料以可解離的方式包括標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)， 優(yōu)選標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)，所述抗體與已經(jīng)通過樣品收 集部（1)的測試樣品中的檢測成分（抗酸桿菌，優(yōu)選結(jié)核桿菌）反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合 物（抗酸桿菌LAM與標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)的復(fù)合物，優(yōu) 選結(jié)核桿菌LAM與標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)的復(fù)合物）。所 述材料具有允許復(fù)合物以圖1中箭頭P所示的方向移動的特性，所述移動與測試樣品向確 定部（3)的移動相關(guān)聯(lián)。
[0273] 應(yīng)該注意，對用于使標(biāo)記的抗體部（2)以可解離的方式負(fù)載標(biāo)記的抗-抗酸桿 菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)、優(yōu)選標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明 的MoAbl)的方法沒有限制；并且其實例包括將標(biāo)記的抗體部（2)用包含標(biāo)記的本發(fā)明的 MoAb、優(yōu)選標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl的溶液浸漬的方法，和將所述溶液黏附到標(biāo)記的抗體部 (2)上的方法。此外，為了允許測試樣品中所包含的檢測成分（抗酸桿菌，優(yōu)選結(jié)核桿菌） 與標(biāo)記的抗體部（2)完全結(jié)合的目的，優(yōu)選地使標(biāo)記的抗體部（2)負(fù)載過量的標(biāo)記的本發(fā) 明的MoAb，優(yōu)選標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb 1。
[0274] 確定部（3)是用于將從樣品收集部（1)經(jīng)過標(biāo)記的抗體部（2)移動的測試樣品進(jìn) 一步轉(zhuǎn)運到溶液吸收部（4)的部分。確定部（3)在其轉(zhuǎn)運區(qū)域包括用于捕獲已轉(zhuǎn)運的測 試樣品中包含的特定成分（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)的復(fù)合物，優(yōu)選結(jié)核桿菌LAM與標(biāo)記的 抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)的復(fù)合物）并且顯示捕獲的結(jié)果的部分 (檢測結(jié)果顯示部（a))。由于可以基于檢測結(jié)果顯示部（a)上顯示的結(jié)果來確定測試樣品 中分枝桿菌的存在或不存在，因此，包括顯示部（a)的區(qū)域稱為"確定部（3)"。
[0275] 除了檢測結(jié)果顯示部（a)之外，本發(fā)明的檢測工具可以在確定部（3)包括對照顯 示部（b)。應(yīng)該注意，檢測結(jié)果顯示部（a)和對照顯示部（b)之間以一定的間隔設(shè)置依次排 列。
[0276] 以過量的量固定在檢測結(jié)果顯示部（a)上的是未標(biāo)記的與抗酸桿菌LAM特異性反 應(yīng)的抗體（未標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體），優(yōu)選未標(biāo)記的與抗酸桿菌LAM特異性反應(yīng)的 抗體（未標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體）。因此，通過在標(biāo)記的抗體部（2)的抗原-抗體反 應(yīng)已經(jīng)與標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb結(jié)合的抗酸桿菌，優(yōu)選已經(jīng)與標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl結(jié)合的 結(jié)核桿菌，在檢測結(jié)果顯示部（a)以與本發(fā)明的MoAb、優(yōu)選標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl的復(fù)合物 的形態(tài)被捕獲；并且歸因于所述標(biāo)記物質(zhì)的顯色以依賴于所捕獲的量的強度顯現(xiàn)。
[0277] 應(yīng)該注意，特異性結(jié)合抗酸桿菌的LAM的本發(fā)明的MoAb (本發(fā)明的MoAb)可以類 似地用作形成未標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體的抗-抗酸桿菌LAM抗體。此外，特異性結(jié) 合結(jié)核桿菌LAM的本發(fā)明的MoAbl (本發(fā)明的MoAbl)可以類似地用作形成未標(biāo)記的抗-結(jié) 核桿菌LAM抗體的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體。
[0278] 以確定的量固定在對照顯示部（b)上的是未標(biāo)記的與標(biāo)記的抗體部（2)中包含的 標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)、優(yōu)選標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體 (標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)反應(yīng)的未標(biāo)記的抗體（第二抗體）。對照顯示部（b)可以在測試 樣品移動方向（圖1中P的方向）上以檢測結(jié)果顯示部（a)_對照顯示部（b)的順序與檢 測結(jié)果顯示部（a)間隔放置。以過量的量固定在對照顯示部（b)上的是未標(biāo)記的與已經(jīng)由 前面的薄片移動過來的測試樣品中所含有的標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明 的MoAb)、優(yōu)選抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)反應(yīng)的抗體（第二抗體）。
[0279] 因此，在對照顯示部（b)，捕獲已經(jīng)從標(biāo)記的抗體部（2)解離并且釋放到測試樣 品中的標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)，優(yōu)選抗-結(jié)核桿菌LAM抗 體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)，并且歸因于標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的 MoAb)、抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)的標(biāo)記物質(zhì)的顯色以依賴于固定 在對照顯示部（b)上的第二抗體的量的強度顯現(xiàn)。
[0280] 此處，如果其是與標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)、優(yōu)選 抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)結(jié)合的抗體，則所述未標(biāo)記的抗體（第二 抗體）是足量的。盡管所述未標(biāo)記的抗體（第二抗體）沒有限制，例如，可以使用抗酸桿菌 的LAM結(jié)合蛋白、陰離子顆粒等。
[0281] 使用本發(fā)明的檢測工具的結(jié)核桿菌測定使用在確定部（3)的檢測結(jié)果顯示部（a) 的顯色的存在或不存在作為指標(biāo)進(jìn)行。這時，如果需要，可以使用在確定部（3)的對照顯示 部（b)的顯色的存在或不存在進(jìn)行確定。甚至當(dāng)在檢測結(jié)果顯示部（a)的顯色不可識別 時，如果顯色在對照顯示部（b)能夠被識別，則測定已經(jīng)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行，并且測定結(jié)果可以確 定為陰性的。然而，當(dāng)顯色在對照顯示部（b)不可識別時，這表示測定沒有適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行，并 且檢測結(jié)果顯示部（a)的結(jié)果不能用來確定為陰性的。
[0282] 在薄片樣片所采用的材料中，確定部（3)優(yōu)選由親水性和吸水材料形成，所述材 料能夠通過毛細(xì)作用使包含多種成分的測試樣品移動至溶液吸收部（4)，并且具有將未標(biāo) 記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)、優(yōu)選抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的 本發(fā)明的MoAbl)穩(wěn)定地固定在檢測結(jié)果顯示部（a)上、或?qū)⑽礃?biāo)記的抗體（第二抗體）穩(wěn) 定地固定在對照顯示部（b)上的特性。
[0283] 溶液吸收部（4)是用于吸收已經(jīng)沿箭頭P的方向從樣品收集部（1)經(jīng)過標(biāo)記的抗 體部（2)和確定部（3)(檢測結(jié)果顯示部（a)，或檢測結(jié)果顯示部（a)和對照顯示部（b)) 移動的測試樣品的殘余的溶液的部分。因此，在所述薄片樣片所采用的材料中，溶液吸收部 (4)優(yōu)選地由親水性和吸附性材料形成，并且更優(yōu)選的由具有不排斥吸收的溶液的特性的 材料或彈性材料形成。具體地，所述材料的實例包括無紡織物，如濾紙和親水性纖維，并且， 還可以使用濾紙和無紡織物的層壓體。
[0284] 盡管本發(fā)明的檢測工具基本上包括具有上述構(gòu)型的薄片樣片，但是，除薄片樣片 之外，其還可以包括支持體10。對支持體10沒有特別的限制，只要其具有能夠保持所述薄 片樣片的構(gòu)型和材料即可。例如，其可以是層壓在要用的薄片樣片的后表面（底層表面） 上的薄片樣支持體，或用于支撐（housing)所述薄片樣片的框架型支持體。
[0285] 薄片樣支持體的實例可以包括由各種塑料（塑料薄片）、硬紙制成的薄片，由金屬 (包括合金）（如鋁）制成的薄片，例如，通過將多個不同類的或相同質(zhì)量的紙裱糊在一起 (粘附在一起）得到的多層紙，通過將塑料薄片和紙裱糊在一起（粘附在一起）得到的制 品，通過將紙和金屬薄片紙裱糊在一起（粘附在一起）得到的制品，通過將塑料薄片、紙和 金屬薄片裱糊在一起（粘附在一起）得到的制品，和在其上提供有涂層（如防水涂層）的 紙，等等。優(yōu)選地，支持體具有防水功能。
[0286] 框架型支持體優(yōu)選是濕氣不能透過的材料，諸如聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚苯 乙烯、丙烯酸聚合物等；但是，如果在其上進(jìn)行防水處理，也可以使用由紙制成的制品。所述 框架優(yōu)選在其上至少形成與在框架中支撐的薄片樣片的樣品收集部（1)相對應(yīng)的"溶液收 集窗"，與確定部（3)的檢測結(jié)果顯示部（a)相對應(yīng)的"確定顯示窗"和與對照顯示部（b)相 對應(yīng)的"對照顯示窗"。應(yīng)該注意，"確定顯示窗"和"對照顯示窗"可以單獨形成，或者可以 形成為一個窗口。
[0287] 為了使用包括上述薄片樣片的本發(fā)明的檢測工具，首先，將樣品收集部（1)充滿 測試樣品。通過這樣做，樣品收集部（1)吸收的測試樣品通過毛細(xì)作用滲透所述薄片樣片， 并且首先到達(dá)以可解離的方式負(fù)載標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)、 優(yōu)選抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)的標(biāo)記的抗體部（2)。在此處，通過 抗原-抗體反應(yīng)，測試樣品中的檢測成分（結(jié)核桿菌）與所述標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗 體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)、優(yōu)選抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)特異性 結(jié)合。接著，測試樣品到達(dá)確定部（3)的檢測結(jié)果顯示部（a)，同時伴隨著"抗酸桿菌與標(biāo)記 的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)的復(fù)合物"結(jié)核桿菌與標(biāo)記的抗-結(jié) 核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)的復(fù)合物"）和"未與結(jié)核桿菌結(jié)合的過量的標(biāo) 記的結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的M 〇Ab)"（ "未與結(jié)核桿菌結(jié)合的過量的標(biāo)記的結(jié) 核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb 1) ")。由于未標(biāo)記的特異性結(jié)合抗酸桿菌的抗-抗 酸桿菌LAM抗體（本發(fā)明的MoAb)，優(yōu)選未標(biāo)記的特異性結(jié)合結(jié)核桿菌的抗-結(jié)核桿菌LAM 抗體（本發(fā)明的MoAbl)穩(wěn)定地固定在檢測結(jié)果顯示部（a)上，測試樣品中"已與抗酸桿菌 特異性結(jié)合的標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb) "、優(yōu)選"已與結(jié)核桿菌 特異性結(jié)合的標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl) "被捕獲并且積聚。 結(jié)果，基于在所捕獲的標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)中、優(yōu)選在所 捕獲的標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)中的標(biāo)記物質(zhì)，檢測結(jié)果顯 示部（a)顯現(xiàn)出強度依賴于測試樣品中所含有的抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌的量的顯色。利 用此，可以檢測測試樣品中存在或不存在抗酸桿菌、優(yōu)選結(jié)核桿菌，及其數(shù)量比率。
[0288] 然后，測試樣品到達(dá)確定部（3)的對照顯示部（b)，同時伴隨著"過量的未與抗酸 桿菌結(jié)合的標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb) "，優(yōu)選"過量的未與結(jié) 核桿菌結(jié)合的標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)"。由于與標(biāo)記的 抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)結(jié)合的第二抗體（未標(biāo)記的抗體），優(yōu)選 與標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)結(jié)合的第二抗體（未標(biāo)記的抗 體）以特定的量穩(wěn)定地固定在對照顯示部（b)上，因此，捕獲并積聚過量包含在測試樣品中 的標(biāo)記的抗-抗酸桿菌LAM抗體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAb)、優(yōu)選標(biāo)記的抗-結(jié)核桿菌LAM抗 體（標(biāo)記的本發(fā)明的MoAbl)。結(jié)果，對照顯示部（b)顯現(xiàn)出強度依賴于固定在對照顯示部 (b)的第二抗體的量（或已與第二抗體結(jié)合的標(biāo)記的抗體的量）的顯色。
[0289] 除了上述這些之外，在不背離本發(fā)明的范圍的前提下，可以對本發(fā)明的檢測工具 進(jìn)行各種改進(jìn)。對本發(fā)明的檢測工具，可以附上記載怎樣使用所述檢測工具和確定方法 的說明文件，由此本發(fā)明提供確定試劑盒，其是包括所述說明文件和所述檢測工具的套件 (set)。
[0290] (IV)結(jié)核病診斷試劑或診斷試劑念
[0291] 上述抗酸桿菌檢測方法和抗酸桿菌檢測工具用于檢測受試者的生物樣品中抗酸 桿菌的存在。具體地，當(dāng)本發(fā)明的MoAbl用作單克隆抗體時，可以舉例結(jié)核桿菌作為抗酸桿 菌的優(yōu)選的實例。因此，上述抗酸桿菌檢測方法和抗酸桿菌檢測工具用于診斷抗酸桿菌、特 別是結(jié)核桿菌感染的存在或不存在。
[0292] 因此，上述本發(fā)明的MoAb、優(yōu)選MoAbl可用作結(jié)核病診斷試劑，并且本發(fā)明提供包 含本發(fā)明的MoAb、優(yōu)選MoAbl的結(jié)核病診斷試劑。本發(fā)明的MoAb可以可解離地或不可解離 地固定在固體載體上，或者可以用任意標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記。
[0293] 此外，當(dāng)進(jìn)行本發(fā)明的用于檢測抗酸桿菌、特別是結(jié)核桿菌的方法時，所述方法可 以通過使用結(jié)核病診斷試劑盒容易地進(jìn)行，所述試劑盒包括本發(fā)明的MoAb、優(yōu)選MoAbl作 為結(jié)核桿菌檢測試劑。因此，本發(fā)明提供用于進(jìn)行結(jié)核病檢測方法的結(jié)核病診斷試劑盒。 所述結(jié)核病診斷試劑盒是利用抗原-抗體反應(yīng)檢測測定測試樣品中存在的結(jié)核桿菌的試 劑盒。當(dāng)所述試劑盒包含本發(fā)明的MoAb、優(yōu)選MoAbl時，其是充分的；并且所述試劑盒可以 包括上述結(jié)核桿菌檢測工具，與本發(fā)明的MoAb、優(yōu)選MoAbl反應(yīng)的第二抗體，抗體檢測試劑 等。此外，為了進(jìn)行測定的便利，所述診斷試劑盒還可以包括適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溶液、稀釋溶液、潤 洗溶液、反應(yīng)終止溶液、標(biāo)記活性測量試劑等。
[0294] (V)用于抗酸桿菌LAM(特別是結(jié)核桿菌LAM)的測定，和抗酸桿菌LAM(特別是結(jié) 核桿菌LAM)檢測試劑或檢測試劑盒
[0295] 本發(fā)明的MoAb是特異性識別并且結(jié)合抗酸桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM)的抗 體。因此，上述本發(fā)明的抗酸桿菌檢測方法也可以用于測定抗酸桿菌LAM。
[0296] 具體地，本發(fā)明的用于抗酸桿菌LAM的測定可以通過下述步驟進(jìn)行：
[0297] (1)使本發(fā)明的MoAb與可能包含抗酸桿菌的測試樣品接觸的步驟；和
[0298] (2)使用在本發(fā)明的MoAb與抗酸桿菌LAM之間的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo)測定在測試樣 品中存在的抗酸桿菌LAM的步驟。
[0299] 步驟⑴和（2)是分別對應(yīng)于上述"（II)用于檢測抗酸桿菌"中描述的步驟（1) 和（2)的步驟，并且上文在（II)中提供的描述在此也可以用作參考。另外，所述用于抗酸 桿菌LAM的測定可以使用上述"（II)用于檢測分枝桿菌的方法"中所述的抗酸桿菌檢測工 具類似地進(jìn)行（應(yīng)該注意，在該情形中，可以將其改述為"抗酸桿菌LAM檢測工具"）。
[0300] 應(yīng)該注意，關(guān)于本發(fā)明的MoAb，由于MoAbl是特異性識別并結(jié)合結(jié)核桿菌的脂阿 拉伯甘露聚糖（LAM)的抗體，上述本發(fā)明的抗酸桿菌檢測方法也可以用作結(jié)核桿菌檢測方 法用于測定結(jié)核桿菌LAM。
[0301] 此處，用于抗酸桿菌LAM、優(yōu)選結(jié)核桿菌LAM的測定包括檢測抗酸桿菌LAM、優(yōu)選結(jié) 核桿菌LAM的定性測量和測量抗酸桿菌LAM、優(yōu)選結(jié)核桿菌LAM的量的定量測量。定量測 量的實例可以包括，但不限于，預(yù)先由本發(fā)明的MoAb與已知量的抗酸桿菌LAM、優(yōu)選結(jié)核桿 菌LAM反應(yīng)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線并且由所述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算在測試樣品中包含的抗酸桿菌LAM、優(yōu) 選結(jié)核桿菌LAM的未確定的量的方法。
[0302] 在這樣的測定中，本發(fā)明的MoAb可用作抗酸桿菌LAM檢測試劑，并且本發(fā)明提供 抗酸桿菌LAM檢測試劑，其包含本發(fā)明的MoAb作為抗酸桿菌LAM檢測試劑。具體地，本發(fā) 明的MoAbl可用作結(jié)核桿菌LAM檢測試劑，并且本發(fā)明提供結(jié)核桿菌LAM檢測試劑，其包含 本發(fā)明的MoAb 1作為結(jié)核桿菌LAM檢測試劑。本發(fā)明的這些MoAbs可以可解離地或不可解 離地固定在任意的固體載體上，或者可以用任意標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記。
[0303] 當(dāng)要進(jìn)行本發(fā)明的抗酸桿菌LAM測定時，所述測定可以通過使用包含本發(fā)明的 MoAb作為抗酸桿菌LAM檢測試劑的抗酸桿菌LAM檢測試劑盒容易地進(jìn)行。此外，當(dāng)要進(jìn)行 本發(fā)明的結(jié)核桿菌LAM測定時，所述測定可以通過使用結(jié)核桿菌LAM檢測試劑盒容易地進(jìn) 行，所述試劑盒包含本發(fā)明的MoAbs中的MoAbl作為結(jié)核桿菌LAM檢測試劑。
[0304] 因此，本發(fā)明提供用于進(jìn)行抗酸桿菌LAM測定的抗酸桿菌LAM檢測試劑盒，特別是 用于進(jìn)行結(jié)核桿菌LAM測定的結(jié)核桿菌LAM檢測試劑盒。所述抗酸桿菌LAM檢測試劑盒，特 別是所述結(jié)核桿菌LAM檢測試劑盒，是利用抗原-抗體反應(yīng)檢測測定測試樣品中存在的抗 酸桿菌、特別是結(jié)核桿菌的LAM的試劑的試劑盒。所述抗酸桿菌LAM檢測試劑盒包括本發(fā) 明的MoAb。當(dāng)所述結(jié)核桿菌LAM檢測試劑盒包括本發(fā)明的MoAbl時，其是充分的，并且所述 試劑盒可以包括抗酸桿菌LAM檢測工具（或結(jié)核桿菌LAM檢測工具）、與本發(fā)明的MoAb (或 MoAbl)反應(yīng)的第二抗體、抗體檢測試劑等。此外，為了進(jìn)行測定的便利，診斷試劑盒還可以 包括適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溶液、稀釋溶液、洗漆溶液、反應(yīng)終止溶液、標(biāo)記活性測量試劑等。
[0305] (VI)滅菌的樣品的測定
[0306] 上述（III)中所述的本發(fā)明的用于檢測抗酸桿菌或結(jié)核桿菌的方法可以作為無 生物公害的測定應(yīng)用。具體地，本發(fā)明的無生物公害的測定可以通過下述步驟進(jìn)行：
[0307] (1)將樣品樣品煮沸滅菌，優(yōu)選高壓蒸汽滅菌，
[0308] (2)使本發(fā)明的MoAb、優(yōu)選MoAbl與所述滅菌的測試樣品接觸的步驟；
[0309] (3)使用本發(fā)明的MoAb、優(yōu)選MoAbl與結(jié)核桿菌LAM之間的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo)測 定所述測試樣品中的結(jié)核桿菌的步驟；和
[0310] (4)當(dāng)在所述測試樣品中檢測到結(jié)核桿菌LAM時，確定所述測試樣品感染了結(jié)核 桿菌的步驟。
[0311] (VII)確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果的方法
[0312] 上述（III)所述的本發(fā)明用于檢測抗酸桿菌、特別是結(jié)核桿菌的方法可以用于確 定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果。
[0313] 具體地，本發(fā)明用于確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果的方法可以通過下述步 驟進(jìn)行：
[0314] (1)使本發(fā)明的MoAb、優(yōu)選MoAbl與施用所述抗結(jié)核病藥物之前和之后的測試樣 品接觸的步驟；
[0315] (2)使用在本發(fā)明的MoAb、優(yōu)選MoAbl與結(jié)核桿菌LAM之間的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo) 測定在施用所述抗結(jié)核病藥物之前和之后所述測試樣品中的結(jié)核桿菌LAM的步驟；和
[0316] (3)當(dāng)在施用所述抗結(jié)核病藥物之前的所述測試樣品中檢測到結(jié)核桿菌LAM，并 且在施用所述抗結(jié)核病藥物之后的所述測試樣品中沒有檢測到結(jié)核桿菌LAM時，確定所述 抗結(jié)核病藥物具有結(jié)核病治療效果。
[0317] 這些步驟（1)和（2)分別對應(yīng)于在上述"（III)用于檢測分枝桿菌、特別是結(jié)核桿 菌的方法"中記載的步驟（1)和（2)，并且，除了測試樣品是具有感染的結(jié)核?。ǜ腥居薪Y(jié) 核桿菌）的結(jié)核病患者的測試樣品，并且進(jìn)行所述方法的測試樣品是在施用抗結(jié)核病藥物 之前的測試樣品（在結(jié)核病治療前）和在施用所述抗結(jié)核病藥物之后的測試樣品（在結(jié)核 病治療后）之外，在上述（III)中所述的方法可以相似地進(jìn)行。另外，在（2)中進(jìn)行的結(jié)核 桿菌LAM的測定可以使用在上述"（III)用于檢測抗酸桿菌、特別是結(jié)核桿菌的方法"中記 載的結(jié)核桿菌檢測工具類似地進(jìn)行（應(yīng)該注意，在這一情形中，可以將其改述為"結(jié)核桿菌 LAM檢測工具"）。
[0318] 作為此處所述的抗結(jié)核病藥物，可以使用本領(lǐng)域目前已知的那些，諸如利福 平（rifampicin)，異煙肼（isoniazid)(異煙酸肼），批嗪酰胺（pyrazinamide)，鏈霉素 (streptomycin)及其鹽，以及乙胺丁醇（ethambutol)及其鹽。然而,所述抗結(jié)核病藥物不 限于此，并且包括展現(xiàn)出針對結(jié)核桿菌的殺菌作用（抗結(jié)核病活性）的核準(zhǔn)的或未核準(zhǔn)的 藥物。
[0319] 作為上述步驟（2)的結(jié)果，當(dāng)在施用抗結(jié)核病藥物之前的測試樣品中檢測到結(jié)核 桿菌LAM(換言之，檢測到結(jié)核桿菌），并且當(dāng)在施用抗結(jié)核病藥物之后的測試樣品中沒有 檢測到結(jié)核桿菌LAM(結(jié)核桿菌）時，由于所述抗結(jié)核病藥物對主題結(jié)核病患者具有結(jié)核病 治療效果，因此，可以確定所述抗結(jié)核病藥物的效用。
[0320] 另一方面，作為上述步驟（2)的結(jié)果，當(dāng)在施用抗結(jié)核病藥物之前的測試樣品中 檢測到結(jié)核桿菌LAM(換言之，檢測到結(jié)核桿菌），并且當(dāng)在施用抗結(jié)核病藥物之后的測試 樣品中也檢測到結(jié)核桿菌LAM(結(jié)核桿菌）時，可以比較在施用所述抗結(jié)核病藥物之前和之 后檢測到的結(jié)核桿菌的量。此處，當(dāng)觀察到施用所述抗結(jié)核病藥物之前和之后的結(jié)核桿菌 的量的減少時，提示所述抗結(jié)核病藥物對主題結(jié)核病患者可能有結(jié)核病治療效果，并且可 以對醫(yī)學(xué)工作者提供繼續(xù)使用所述抗結(jié)核病藥物的治療選擇。另一方面，當(dāng)沒有觀察到施 用所述抗結(jié)核病藥物之前和之后的結(jié)核桿菌的量減少時，這表明所述抗結(jié)核病藥物對主題 結(jié)核病患者沒有結(jié)核病治療效果。因此，可以向醫(yī)學(xué)工作者提供停止使用所述抗結(jié)核病藥 物并且轉(zhuǎn)用另一利療法的治療選擇。
[0321] 在上述方法中，本發(fā)明的MoAb、特別是MoAbl可用作抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療 效果確定試劑，并且本發(fā)明提供結(jié)核病治療效果確定試劑，其包含本發(fā)明的MoAb、特別是 MoAbl作為結(jié)核病治療效果確定試劑。本發(fā)明的MoAb、特別是MoAbl可以可解離地或不可 解離地固定在任何固體載體上，或者可以用任意標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記。
[0322] 此外，當(dāng)進(jìn)行上述本發(fā)明的確定方法時，所述方法可以通過使用結(jié)核病治療效果 確定試劑盒容易地進(jìn)行，所述結(jié)核病治療效果確定試劑盒包括本發(fā)明的MoAb、優(yōu)選MoAbl 作為結(jié)核病治療效果確定試劑。因此，本發(fā)明提供用于進(jìn)行抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效 果確定方法的結(jié)核病治療效果確定試劑盒。所述結(jié)核病治療效果確定試劑盒是用于通過使 用抗原-抗體反應(yīng)檢測測定在治療之前和之后的測試樣品中存在的結(jié)核桿菌LAM而確定抗 結(jié)核病藥劑對結(jié)核病患者的治療效果的試劑的試劑盒。當(dāng)所述試劑盒包括本發(fā)明的MoAb、 優(yōu)選MoAbl時，其是充分的；并且所述試劑盒可以包括上述結(jié)核桿菌LAM檢測工具，與本發(fā) 明的MoAb反應(yīng)的第二抗體，抗體檢測試劑等。此外，為了進(jìn)行所述測定的便利，診斷試劑盒 還可以包括適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溶液、稀釋溶液、潤洗溶液、反應(yīng)終止溶液、標(biāo)記活性測量試劑等。
[0323] 用于活動性結(jié)核病的治療通常通過施用四種以上類型的治療劑持續(xù)六個月而進(jìn) 行。當(dāng)懷疑患有結(jié)核病感染時，首先，進(jìn)行使用Ziehl-Neelsen染色或熒光染色的涂片檢 測。如果在lml痰液樣板中存在數(shù)目為10, 000個以上的細(xì)菌，則認(rèn)為其是"涂片陽性的"。 作為傳染源。痰液-涂片-陽性患者在臨床上和對于公眾健康是特別重要的。因此，涂片 陽性患者需要在結(jié)核病病房住院治療。轉(zhuǎn)為門診治療的一個指標(biāo)是連續(xù)三天具有陰性的涂 片檢查結(jié)果。本發(fā)明的結(jié)核桿菌LAM檢測方法可以定量生物樣品（如痰液、唾液和血液） 中的LAM濃度。因此，通過測定諸如痰液、唾液和血液的生物樣品中的LAM，可以監(jiān)測治療劑 的效用，并且本發(fā)明還適用于確定對于細(xì)菌釋放狀態(tài)是感染陰性的。 實施例
[0324] 本發(fā)明及其效果在下文參照實施例進(jìn)行描述。然而，本發(fā)明的范圍不限于這些實 施例。
[0325] 實施例1-4
[0326] 1.材料準(zhǔn)各
[0327] (1-1)制各宴聚-LAM和制各免疫原
[0328] 將人結(jié)核桿菌結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis)的LAM(3mg)(來源于青山B菌株 (strain Aoyama B)，Nacalai Tesque)針對50mM乙酸鹽緩沖液（pH 4.5)透析，并且調(diào)節(jié) 至濃度為lmg/mL。隨后，向其中加入150 μ L 200mM高碘酸水溶液，并且將混合物在4°C避 光攪拌7分鐘。攪拌后，向其中加入35 μ L乙二醇，并且將混合物使用小柱ro-ΙΟ (由GE Company制備）進(jìn)行凝膠過濾（0. 1M碳酸氫鈉 ，pH 8. 3)，并且分成各個lmL的部分。通過 苯酚-硫酸法檢測分成的樣品的糖；并且將檢測到糖的級分針對純水透析，然后冷凍干燥。
[0329] 將冷凍干燥的寡聚_LAM(3mg)溶解在0. 5mL純水中。向其中加入12 μ L溶解在乙 腈中的100mg/mL 1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸鹽并將混合物攪拌約1分鐘后，向 其中加入12yL 0. 2M三乙胺，并且將混合物攪拌2分鐘。然后，向其中加入0. 53mL溶解在 0. 5M碳酸氫鈉緩沖液（pH 8. 5)中的0. 6M脂肪酸二酰肼（adipic acid dihydrazide)，并 將混合物在4°C攪拌10小時，然后針對純水透析約1小時。
[0330] 向透析后得到的溶液中，加入300 μ g鑰孔娀血藍(lán)蛋白（KLH)、30 μ L 200mM磷酸鹽緩沖液（pH 5. 0)和45 μ L 100mM Ν-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉 (N-hydroxysulfosuccinimide)。然后，再向其中加入65yL 1M二氯乙燒，并且將混合物在 4°C攪拌3小時以上。最后，將得到的混合物針對磷酸鹽緩沖液透析，以獲得寡聚-LAM-KLH 用于免疫原。將所述寡聚-LAM-KLH與佐劑（完全或不完全弗氏佐劑，由Difco制備）以 1 : 1的比率（寡聚-LAM-KLH :佐劑（重量比））混合，并且用作免疫原。
[0331] (1-2)制各BCG疫苗和免疫原
[0332] 作為BCG疫苗，使用由日本BCG實驗室制備的冷凍干燥的BCG疫苗（授權(quán)號： 20300AMZ00767000)。對于免疫，使用100mg (濕重）冷凍干燥的BCG疫苗與lml生理鹽水 的混合物。
[0333] (1-3)制各殺滅的H37Ra細(xì)菌細(xì)朐和免疫原
[0334] 作為殺滅的H37Ra細(xì)菌細(xì)胞，使用Difco制備的結(jié)核分枝桿菌H37Ra (冷凍干燥的 產(chǎn)品）。對于免疫，使用l〇〇mg(濕重）冷凍干燥的殺滅的H37Ra細(xì)菌細(xì)胞與lml生理鹽水 的混合物。
[0335] (1-4)制各用于產(chǎn)牛scFv片段的引物
[0336] 表1顯示制備單鏈抗體（scFvs)所用的引物的名稱、堿基序列和用途。合成下述 引物：四條有義引物和一條反義引物用作VH區(qū)擴增的引物，四條有義引物和四條反義引物 用作VL區(qū)擴增的引物，一條有義引物和一條反義引物用作連接重鏈可變區(qū)片段和輕鏈可 變區(qū)片段的接頭（GS接頭）的擴增的引物，兩條引物用于限制性酶（SfiI，NotI)識別區(qū)的擴 增。序列表的SEQ ID NOs :13-29所示的氨基酸序列對應(yīng)于表1從上到下的順序列出的引 物的氨基酸序列。
[0337]

【權(quán)利要求】
1. 能夠結(jié)合抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的單克隆抗體，所述抗體為下述（A)-(c)中任 一項所述的抗體： (A) 單克隆抗體，其包含通過接頭連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變 區(qū)包含下述（a)-(c)所示的重鏈CDR1-CDR3,并且所述輕鏈包含下述（d)-(f)所示的 CDR1-CDR3 ; (a) 由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R1， (b) 由SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R2， (c) 由SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R3， (d) 由SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R1， (e) 由SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R2,和 (f) 由SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R3 ; (B) 單克隆抗體，其包含通過接頭連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變 區(qū)包含下述（g)-(i)所示的重鏈CDR1-CDR3,并且所述輕鏈包含下述（j)_⑴所示的 CDR1-CDR3 ; (g) 由SEQ ID NO :31所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R1， (h) 由SEQ ID NO :32所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R2， (i) 由SEQ ID N0:33所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R3， (j) 由SEQ ID N0:34所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R1， (k) 由SEQ ID N0:35所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R2,和 (l) 由SEQ ID NO :36所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R3 ;和 (C) 單克隆抗體，其包含通過接頭連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變 區(qū)包含下述（m)-(o)所示的重鏈CDR1-CDR3,并且所述輕鏈包含下述（p)-(r)所示的 CDR1-CDR3 ; (m) 由SEQ ID NO :47所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R1， (η)由SEQ ID NO :48所示的氨基酸序列組成的重鏈CDR2， (〇)由SEQ ID N0:49所示的氨基酸序列組成的重鏈⑶R3， (P)由SEQ ID N0:50所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R1， (q) 由SEQ ID NO :51所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R2,和 (r) 由SEQ ID N0:52所示的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中（A)的單克隆抗體由SEQ ID NO :12所示 的氨基酸序列組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中（B)的單克隆抗體由SEQ ID NO :39所示 的氨基酸序列組成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中（C)的單克隆抗體由SEQ ID NO :30所示 的氨基酸序列組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的單克隆抗體，其是單價或二價抗體。
6. 用于檢測分枝桿菌（mycobacterium)的方法，所述方法包括下述步驟： (1) 使權(quán)利要求1-5中任一項所述的單克隆抗體與受試者的生物樣品接觸；并且 (2) 使用所述單克隆抗體與抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖之間的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo)測定 所述樣品中的分枝桿菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其使用權(quán)利要求1-5中任一項所述的（A)的單克隆抗 體特異性檢測抗酸桿菌中的結(jié)核桿菌（tubercle bacillus)。
8. 抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖檢測試劑，其包含權(quán)利要求1-5中任一項所述的單克隆 抗體。
9. 抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖檢測試劑盒，其包含權(quán)利要求1-5中任一項所述的單克 隆抗體作為抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖檢測試劑。
10. 結(jié)核病診斷試劑，其包含權(quán)利要求1-5中任一項所述的（A)的單克隆抗體。
11. 結(jié)核病診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求1-5中任一項所述的（A)的單克隆抗體作為結(jié) 核病檢測試劑。
12. 用于測量測試樣品中的抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的方法，所述方法包括下述步 驟： (1) 使權(quán)利要求1-5中任一項所述的單克隆抗體與可能含有分枝桿菌的測試樣品接 觸；并且 (2) 使用所述單克隆抗體與抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖之間的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo)測定 所述測試樣品中的抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其是包括檢測抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖作為步驟 (2)的抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖定性方法，或是包括定量抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖作 為步驟（2)的抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖定量方法。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其使用權(quán)利要求1-5中任一項所述的（A)的單 克隆抗體作為單克隆抗體來特異性測量抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖中的結(jié)核桿菌脂阿拉 伯甘露聚糖。
15. 用于確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果的方法，所述方法包括下述步驟： (1) 使權(quán)利要求1-5中任一項所述的（A)的單克隆抗體與施用所述抗結(jié)核病藥物之前 和之后的測試樣品接觸； (2) 使用所述單克隆抗體與結(jié)核桿菌脂阿拉伯甘露聚糖之間的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo)測定 在施用所述抗結(jié)核病藥物之前和之后所述測試樣品中的結(jié)核桿菌脂阿拉伯甘露聚糖；并且 (3) 當(dāng)在施用所述抗結(jié)核病藥物之前在所述測試樣品中檢測到結(jié)核桿菌脂阿拉伯甘露 聚糖，并且在施用所述抗結(jié)核病藥物之后在所述測試樣品中沒有檢測到結(jié)核桿菌脂阿拉伯 甘露聚糖時，確定所述抗結(jié)核病藥物具有結(jié)核病治療效果。
16. 用于確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果的方法，所述方法包括下述步驟： (1) 使權(quán)利要求1-5中任一項所述的（A)的單克隆抗體與施用所述抗結(jié)核病藥物之前 和之后的測試樣品接觸； (2) 使用所述單克隆抗體與結(jié)核桿菌脂阿拉伯甘露聚糖之間的結(jié)合反應(yīng)作為指標(biāo)定量 在施用所述抗結(jié)核病藥物之前和之后所述測試樣品中的結(jié)核桿菌脂阿拉伯甘露聚糖；并且 (3) 比較施用所述抗結(jié)核病藥物之后所述測試樣品中的結(jié)核桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的 量（給藥后測量）與施用所述抗結(jié)核病藥物之前所述測試樣品中的結(jié)核桿菌脂阿拉伯甘露 聚糖的量（給藥前測量）；并且 當(dāng)給藥后測量低于給藥前測量時，確定所述抗結(jié)核病藥物具有結(jié)核病治療效果，并且 當(dāng)給藥后測量不低于給藥前測量時，確定所述抗結(jié)核病藥物不具有結(jié)核病治療效果。
17. 用于確定抗結(jié)核病藥物的結(jié)核病治療效果的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求 1-5中任一項所述的（A)的單克隆抗體。
18. 分枝桿菌檢測工具，所述檢測工具包含由能夠通過毛細(xì)作用轉(zhuǎn)移測試樣品的材料 形成的溶液吸收片，所述溶液吸收片包含： (1) 樣品收集部，其用于吸收和收集所述測試樣品； (2) 標(biāo)記的抗體部，其負(fù)載有與抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖特異性反應(yīng)的標(biāo)記的權(quán)利 要求1-5中任一項所述的單克隆抗體； (3) 確定部，其包括測試結(jié)果顯示部（a)，在所述測試結(jié)果顯示部（a)上固定有與抗酸 桿菌脂阿拉伯甘露聚糖特異性反應(yīng)的未標(biāo)記的權(quán)利要求1-5中任一項所述的單克隆抗體； 和 (4) 溶液吸收部，其用于吸收已經(jīng)移動通過所述樣品收集部、標(biāo)記的抗體部和確定部的 測試樣品的殘余溶液。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的分枝桿菌檢測工具，其中所述確定部（3)還包括對照顯示 部（b)，在所述對照顯示部（b)上固定有與標(biāo)記的權(quán)利要求1-5中任一項所述的單克隆抗體 反應(yīng)的未標(biāo)記的抗體，所述對照顯示部與所述測試結(jié)果顯示部（a)分開放置。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的分枝桿菌檢測工具，其用于檢測作為抗酸桿菌的結(jié)核 桿菌，所述工具包含權(quán)利要求1-5中任一項所述的（A)的單克隆抗體作為單克隆抗體。
21. 用于免疫非人動物來產(chǎn)生特異性結(jié)合結(jié)核桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的單克隆抗體的 方法，所述方法包括向所述非人動物施用BCG作為免疫原來誘導(dǎo)針對BCG的體液免疫應(yīng)答。
22. 用于產(chǎn)生特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)脂阿拉伯甘 露聚糖的單克隆抗體的方法，所述方法包括下述步驟： 向非人動物施用BCG作為免疫原來誘導(dǎo)針對BCG的體液免疫應(yīng)答并且產(chǎn)生結(jié)合結(jié)核分 枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的抗體；并且 從所述非人動物收集產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞。
23. 用于產(chǎn)生特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的單克隆抗體的方法，所述 方法包括下述步驟： 向非人動物施用BCG作為免疫原以誘導(dǎo)針對BCG的體液免疫應(yīng)答； 制備編碼特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的抗體的mRNA ; 使用所述mRNA作為模板制備cDNA ;并且 使用所述cDNA通過噬菌體展示法收集特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的 單克隆抗體。
24. 根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的方法，其中特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚 糖的單克隆抗體是權(quán)利要求1-5中任一項所述的（A)的單克隆抗體。
25. 用于產(chǎn)生特異性結(jié)合抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的單克隆抗體的方法，所述方法 包括下述步驟： 向非人動物施用脂阿拉伯甘露聚糖與權(quán)利要求1所述的抗體的復(fù)合物作為免疫原，以 誘導(dǎo)針對所述復(fù)合物的體液免疫應(yīng)答并且產(chǎn)生結(jié)合抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的抗體；并 且從所述非人動物收集產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞。
26. 用于產(chǎn)生特異性結(jié)合抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的單克隆抗體的方法，所述方法 包括下述步驟： 向非人動物施用脂阿拉伯甘露聚糖與權(quán)利要求1所述的（A)的抗體的復(fù)合物作為免疫 原，以誘導(dǎo)針對所述復(fù)合物的體液免疫應(yīng)答； 制備編碼特異性結(jié)合抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的抗體的mRNA ; 使用所述mRNA作為模板制備cDNA ;并且 使用所述cDNA通過噬菌體展示法收獲特異性結(jié)合抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的單克 隆抗體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的方法，其中所述特異性結(jié)合抗酸桿菌脂阿拉伯甘露聚 糖的單克隆抗體是權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
【文檔編號】C12M1/34GK104144944SQ201380011658
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月29日
【發(fā)明者】葛城肅典, 富樫將高, 織田哲彌, 伊藤隆太, 川口知惠, 西條容子, 古賀大輔, 松本真, 藤原守, 小野賢司 申請人:大塚制藥株式會社