一種多功能新型小肽、包含該肽的組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種具有Syntaxin1A?H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽、含有該小肽的組合物及其應(yīng)用，所述小肽選自：（a）Glu-Glu-Lys-Ala-Asp（b）Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro；或（c）Glu-Glu-Lys-Ala-Asn所示的氨基酸序列組成的小肽。該小肽能與GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GAT-1結(jié)合，降低其對(duì)GABA的攝取功能，還能與Syntaxin1A競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合SNAP-25，最終造成興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞抑制，從而為預(yù)防或治療因?yàn)樯窠?jīng)信號(hào)傳遞活躍引起的疾病或狀態(tài)提供了一種新的有效途徑，可以應(yīng)用于促進(jìn)荷爾蒙分泌、治療高血壓藥物以及減緩緊張、減少脂肪、減少皺紋和改善睡眠的保健品或化妝品。本發(fā)明的小肽對(duì)天然抑制通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，具有更安全高效的有利條件，還具有序列簡(jiǎn)單、合成方便等優(yōu)勢(shì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種多功能新型小肽、包含該肽的組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多功能新型小肽,具體地涉及一種具有SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽，還涉及含有該小肽的組合物以及該小肽或組合物在制備治療或預(yù)防高血壓、減少脂肪、改善皺紋、改善睡眠的藥物、保健品或化妝品中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)遞質(zhì)是指神經(jīng)元在進(jìn)行化學(xué)突觸傳遞過(guò)程中，起信息傳遞的化學(xué)物質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元細(xì)胞中合成，存儲(chǔ)于神經(jīng)末梢的突觸小泡中，在外界刺激的作用下，一種稱(chēng)為N-乙基馬來(lái)酸胺敏感因子附著蛋白受體(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factorattachment protein receptor proteins, SNARE)的蛋白刺激突觸小泡,使其釋放出神經(jīng)遞質(zhì)，并經(jīng)突觸縫隙到達(dá)突觸后膜，產(chǎn)生突觸去極化電位或超極化電位，導(dǎo)致突觸后神經(jīng)興奮性升高或降低。 [0003]SNARE是一類(lèi)位于細(xì)胞器及膜泡膜上的跨膜蛋白家族，介導(dǎo)膜泡與靶膜的準(zhǔn)確識(shí)別。SNARE復(fù)合體(SNARE complex)由兩個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)膜上的定向SNARE蛋白(target-SNARE) SyntaxinlA、SNAP-25以及一個(gè)位于囊泡膜上的囊泡SNARE蛋白(vesicle-SNARE)VAMP-2三者組成。在參與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞過(guò)程中，SyntaxinlA和SNAP-25首先形成一個(gè)中間復(fù)合體，即定向SNARE復(fù)合體(target-SNARE complex),再與VAMP-2結(jié)合，形成SNARE復(fù)合體。
[0004]從生理上來(lái)講，皺紋的產(chǎn)生與面部肌肉纖維的緊張收縮有關(guān)。在外界作用下，SNARE受體刺激突觸小泡，使其釋放出乙酰膽堿、兒茶酚胺等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，促使肌肉發(fā)生收縮。而通過(guò)直接減少肌肉運(yùn)動(dòng)收縮或減弱神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)肌肉收縮的作用可以減少皺紋的產(chǎn)生或者消除已經(jīng)生成的皺紋。
[0005]當(dāng)前已有部分開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品及其相關(guān)發(fā)明涉及通過(guò)阻斷乙酰膽堿在神經(jīng)-肌肉接頭處的釋放和抑制SNARE受體的合成，引起臉部肌肉組織的松弛，釋放皺紋。如A型肉毒毒素(Botox)結(jié)合到神經(jīng)元細(xì)胞膜，通過(guò)鈣和pH依賴(lài)易位過(guò)程進(jìn)入細(xì)胞，并以溫度和鋅離子依賴(lài)方式阻斷SNARE位點(diǎn)，從而抑制了鈣依賴(lài)性神經(jīng)元的細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)，使得肌肉因沒(méi)有接受到信息而不產(chǎn)生收縮。
[0006]目前，Botox獲美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的適應(yīng)癥有:慢性偏頭痛、腋下嚴(yán)重出汗(多汗癥)、眼瞼痙攣和斜視(眼肌異常癥)、頸肌異常癥、成人肢體痙攣、眉間皺紋和改善魚(yú)尾紋線外觀。其中用于治療眉間皺紋和改善魚(yú)尾紋線外觀的Botox Cosmetic是FDA批準(zhǔn)的唯一治療藥物。檢索美國(guó)專(zhuān)利數(shù)據(jù)庫(kù)，Allergan公司已為Botox的90多種潛在適應(yīng)癥申請(qǐng)了專(zhuān)利。
[0007]雖然Botox除皺效果優(yōu)異，但因其毒性強(qiáng)，只能在醫(yī)囑條件下謹(jǐn)慎使用，難以普及。因此另有公司試圖合成與SNAP-25類(lèi)似的小肽，以期達(dá)到與Botox相似的功效，如西班牙LipoTec公司的Agriline和法國(guó)Kappa Biotech公司開(kāi)發(fā)的LETT ICELINE0該小肽是一種已肽物(Ac-EEMQRR-NH2)，模仿了 SNAP-25的末端鏈，可與SNAP-25競(jìng)爭(zhēng)占有SNARE中的位置，從而抑制了鈣依賴(lài)性兒茶酚胺從親鉻細(xì)胞中釋放出來(lái)。雖然這類(lèi)小肽效果較Botox弱,但臨床研究證明連續(xù)使用30天10%濃度小肽可減輕皺紋30%左右。另一種生物活性肽來(lái)源自蜂毒、蛇毒、蟾毒等生物神經(jīng)毒素，可迫使體內(nèi)信號(hào)通路阻斷，例如來(lái)自蝮蛇(Wagler)的Waglerin-1毒液是一個(gè)22-氨基酸肽選擇性結(jié)合乙酰膽堿受體(nAChPs)。瑞士 Pentapharm公司合成的三肽模擬Waglerin -1的功能，已經(jīng)以SYN-AKE上市，SYN-AKE作用于突觸后膜，通過(guò)結(jié)合到nAChP的小亞單位達(dá)到阻止乙酰膽堿與受體結(jié)合的目的，從而抑制肌肉收縮，減少皺紋生成。
[0008] 預(yù)計(jì)在未來(lái)數(shù)年中將會(huì)有更多的神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。但是，目前已開(kāi)發(fā)和申請(qǐng)專(zhuān)利的抑制劑主要是通過(guò)強(qiáng)烈阻斷完整的神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)通路達(dá)到目的，因此可能會(huì)引起正常細(xì)胞的信號(hào)通路紊亂。而在機(jī)體中還存在著另一種天然的神經(jīng)信號(hào)抑制通路，利用此通路，既可以達(dá)到抑制神經(jīng)興奮，阻止肌肉收縮的效果，又可以避免外在強(qiáng)制阻斷信號(hào)通路的弊端。因此，開(kāi)發(fā)天然神經(jīng)信號(hào)抑制通路激活劑比開(kāi)發(fā)興奮神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑更為重要和安全。
[0009]主要的神經(jīng)遞質(zhì)包括乙酰膽堿、兒茶酚胺、谷基酸、多巴胺(DA)、5_羥色胺(5-HT)、Y-氨基丁酸(GABA)、P物質(zhì)、和一氧化氮等。其中GABA和谷氨酸為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其他均為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。
[0010]GABA是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì)，約50%的中樞神經(jīng)突觸部位以GABA為遞質(zhì)。GABA可以快速穿透皮膚，抑制神經(jīng)傳遞，釋放皺紋，淡化細(xì)紋，增強(qiáng)肌肉本身的放松機(jī)能，從而具有減壓美容的效果。
[0011]另外，GABA作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度興奮，具有安定、促進(jìn)放松和消除神經(jīng)緊張的作用。
[0012]當(dāng)GABA作用于血管運(yùn)動(dòng)中樞時(shí)，可促進(jìn)動(dòng)脈血管擴(kuò)張，進(jìn)而有效降低血壓。進(jìn)入體內(nèi)的GABA還能有效抑制血液中谷氨酸的脫羧作用，促進(jìn)血氨轉(zhuǎn)化為尿素排出體外，進(jìn)而預(yù)防高血壓。
[0013]GABA作用于中樞神經(jīng)時(shí)，能促進(jìn)脂肪分解代謝，減少合成代謝，有效降低肝臟及血液中的甘油三酸酯(TG)含量，對(duì)降低體重及預(yù)防動(dòng)脈硬化有效。
[0014]但是，體內(nèi)GABA的作用會(huì)受到機(jī)體自身終止途徑的干擾，降低GABA的效果或者縮短GABA的有效作用時(shí)間。因此發(fā)展一種能可逆抑制GABA失效機(jī)制的物質(zhì)并且適當(dāng)增強(qiáng)GABA有效濃度對(duì)高效利用天然抑制途徑具有重要意義。
[0015]神經(jīng)遞質(zhì)的作用可通過(guò)兩個(gè)途徑中止:一是再回收抑制，即通過(guò)突觸前載體的作用將突觸間隙中多余的神經(jīng)遞質(zhì)回收至突觸前神經(jīng)元并貯存于囊泡；另一途徑是酶解，如以多巴胺(DA)為例，它經(jīng)由位于線粒體的單胺氧化酶(MAO)和位于細(xì)胞質(zhì)的兒茶酚胺鄰位甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的作用被代謝和失活。GABA的作用通過(guò)第一種途徑中止。
[0016]GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GABA transporter)會(huì)重?cái)z取突觸間隙中的GABA以終止突觸的信號(hào)傳遞。SyntaxinlA及SNAP-25/SyntaxinlA復(fù)合體(即定向SNARE復(fù)合體)可以與位于神經(jīng)元上的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GAT-1(GABAtransporter-1)亞型直接結(jié)合,從而抑制它的重?cái)z取功能。SNAP-25與SyntaxinlA結(jié)合SyntaxinlA與GAT-1的相互作用，從而顯著增強(qiáng)了SyntaxinlA介導(dǎo)的對(duì)GAT-1重?cái)z取功能的抑制。例如，一氧化氮(NO)促進(jìn)的SyntaxinlA與SNAP-25結(jié)合以及SNARE復(fù)合體形成能夠加強(qiáng)SyntaxinlA與GAT-1的相互作用，從而抑制GAT-1對(duì)GABA的重?cái)z取。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑毒性強(qiáng)的缺點(diǎn)，本發(fā)明人對(duì)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的信號(hào)通路進(jìn)行了深入研究，最終設(shè)計(jì)出了一種具有SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽，實(shí)現(xiàn)了對(duì)GABA的再回收抑制。
[0018]因此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽。
[0019]本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于預(yù)防或治療由于SyntaxinlA與SNAP-25或GAT-1結(jié)合效率而引起的疾病或狀態(tài)的組合物。
[0020]本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于預(yù)防或治療由于SyntaxinlA與SNAP-25或GAT-1結(jié)合效率而引起的疾病或狀態(tài)的組合物的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明的另一目的在于提供一種編碼具有SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽的多核苷酸。
[0022]一方面，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究以制備和篩選出多種具有SyntaxinlA結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽，并且己經(jīng)選擇出一種顯現(xiàn)出較高活性和穩(wěn)定性的小肽，所述小肽由5個(gè)氨基酸組成，氨基酸序列為Glu-Glu-Lys-Ala-Asp (SEQ IDNO: 1)，在本發(fā)明中稱(chēng)為JKB-A小肽，其測(cè)序結(jié)果如圖3所示。本發(fā)明人將JKB-A小肽在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比搜索，未發(fā)現(xiàn)有功能相同的同類(lèi)小肽。本發(fā)明人利用分析程序，按照本領(lǐng)域技術(shù)的默認(rèn)參數(shù)對(duì)JKB-A小肽與SyntaxinlA的同源性進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果得出這五個(gè)氨基酸與SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似,而SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域已被鑒定為結(jié)合 SNAP-25 和 GAT-1 的位點(diǎn)(Fan, et al., SNAP-25/syntaxinlA complexfunctionally modulates neurotransmitter gamma-aminobutyric acid reuptake.JBiol Chem.2006;281(38):28174-84)。
[0023]因此，本發(fā)明的肽包含與SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功的SEQ ID NO:1氨基酸序列。優(yōu)選地，所述肽主要由SEQ ID NO:1氨基酸序列組成。最優(yōu)選地，所述肽由SEQ ID NO:1氨基酸序列組成。
[0024]本發(fā)明中所用術(shù)語(yǔ)“肽”是指通過(guò)肽鍵連接氨基酸殘基而形成的直鏈分子。
[0025]本發(fā)明的JKB-A小肽能夠直接與SNAP-25和GAT-1結(jié)合，增強(qiáng)了對(duì)GAT-1的重?cái)z功能的抑制，從而延長(zhǎng)GABA的抑制作用，提高局部GABA的有效作用濃度。同時(shí)，本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)還證實(shí)JKB-A小肽在體外能夠與SyntaxinlA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合SNAP-25，導(dǎo)致SNARE復(fù)合體的結(jié)合效率降低甚至解聚。因?yàn)镴KB-A小肽和SNAP-25形成的中間復(fù)合體，不能再與VAMP-2結(jié)合形成SNARE復(fù)合體，進(jìn)一步阻止了皮膚神經(jīng)細(xì)胞中的乙酰膽堿、兒茶酚胺等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)經(jīng)SNARE的激活作用，從而抑制了神經(jīng)傳遞，減輕了肌肉收縮和面部皺紋。
[0026] 由于本發(fā)明SEQ ID N0:1所示的序列為僅有5個(gè)氨基酸序列的小肽，所以本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以很容易對(duì)SEQ ID NO:1的氨基酸序列進(jìn)行本領(lǐng)域常規(guī)的改變而不改變其功能，所述改變例如進(jìn)行常規(guī)取代、缺失或添加等操作，尤其是進(jìn)行非極性氨基酸間或是極性氨基酸間(特別是不帶電荷的極性氨基酸間或帶相同電荷(帶正電荷或負(fù)電荷)的極性氨基酸間)的取代。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的小肽可以為Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro (SEQ ID N0:2)所示的序列組成的小肽(在本文中稱(chēng)JKB-Al)或Glu-Glu-Lys-Ala-Asn (SEQ ID NO:3)所示的序列組成的小肽(在本文中稱(chēng)JKB-A2), JKB-Al和JKB-A2小肽的結(jié)構(gòu)和功能與SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似。
[0027]本發(fā)明的小肽可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)固相合成方法合成。例如本發(fā)明小肽可以用Applied Biosystem合成儀或PioneerTM肽合成儀按固相化學(xué)技術(shù)合成。一般，這些方法包括向成長(zhǎng)的肽鏈上依次添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或適當(dāng)保護(hù)的氨基酸。一般，第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)，然后將保護(hù)的氨基酸連在惰性固相載體上，隨后在適于形成酰胺鍵的條件下加入相應(yīng)氨基或羧基被適當(dāng)保護(hù)的序列中的下一個(gè)氨基酸。然后從新加入的氨基酸殘基上除去保護(hù)基，再加入必要時(shí)適當(dāng)保護(hù)的下一個(gè)氨基酸，如此重復(fù)操作。當(dāng)所有氨基酸以正確的順序連接后，相繼或同時(shí)除去任何剩余的保護(hù)基和固相支持物，得到最終的多肽。通過(guò)簡(jiǎn)單修改此一般程序，可能一次向成長(zhǎng)鏈添加一個(gè)以上的氨基酸。
[0028]在本【技術(shù)領(lǐng)域】中，為了增強(qiáng)肽的穩(wěn)定性通常會(huì)對(duì)肽進(jìn)行一定的修飾，例如，可以在氨基酸殘基的N-末端或C-末端加上保護(hù)基團(tuán)保護(hù)本發(fā)明的小肽在體內(nèi)免遭蛋白酶的降解。
[0029]第二方面，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于預(yù)防或治療由于SyntaxinlA與SNAP-25或GAT-1結(jié)合效率而引起的疾病或狀態(tài)的組合物，所述組合物包含具有SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽作為活性成分。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“SyntaxinlA與SNAP-25或GAT-1結(jié)合效率而引起的疾病或狀態(tài)”是指由于SyntaxinlA與SNAP-25或GAT-1的結(jié)合效率不同(包括結(jié)合增強(qiáng)或減弱)引起的相關(guān)的神經(jīng)信號(hào)通路的改變而導(dǎo)致的生理反應(yīng)。優(yōu)選地，可以將本發(fā)明的肽或組合物著重預(yù)防或治療功效的活性描述為:改善皮膚狀態(tài)、降低血壓、改善睡眠、減少脂肪。
[0030]更優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物顯現(xiàn)出改善皮膚狀態(tài)的功效。尤其是，由于其低分子量，在本發(fā)明的組合物中用作活性成分的小肽顯示出優(yōu)異的皮膚滲透性。因此，當(dāng)本發(fā)明的組合物局部施用于皮膚時(shí)，皮膚狀態(tài)顯著改善，最優(yōu)選為改善皺紋或皮膚彈性、預(yù)防皮膚老化。
[0031 ] 本發(fā)明的組合物可以作為藥物、保健品或化妝品組合物制備。
[0032]根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述組合物為包含(a)藥用有效量的包含SEQID NO: UN0:2或N0:3氨基酸序列的小肽；和(b)可藥用載體的藥物組合物。
[0033]本文所用術(shù)語(yǔ)“藥用有效量”是指足以顯示出并實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的肽的效能和活性的量。
[0034]本發(fā)明的藥物組合物內(nèi)含有的可藥用載體，其通常用在制藥配方中，但不限于此，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉等。根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物可以另外包含潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、增甜劑、增香劑、乳化劑、懸浮劑和防腐劑等物質(zhì)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，可以與如上所述的可藥用載體和/或賦形劑一起配制，根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物，最終提供幾種形式的單劑量型和多劑量型。
[0035]根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述組合物為包含(a)美容有效量的含有SEQID NO: UNO: 2或NO: 3氨基酸序列的小肽；和(b)化妝品可用載體的化妝品組合物。
[0036]本文所用術(shù)語(yǔ)“美容有效量”是指足以實(shí)現(xiàn)以上所述的改善皮膚狀態(tài)的功效的量。[0037]可以將本發(fā)明的化妝品組合物制成很多種形式，例如，包括溶液、混懸液、乳狀液、膏、油膏、凝膠、霜、洗劑、粉、肥皂、含表面活性劑的清潔劑、油、粉底、乳狀液粉底、蠟狀粉底和噴霧劑。具體而言，可以將本發(fā)明的化妝品組合物制成以下形式:營(yíng)養(yǎng)液、營(yíng)養(yǎng)霜、按摩霜、精華素、眼霜等。
[0038]第三方面，本發(fā)明提供了上述小肽和組合物的具體應(yīng)用，包括:
[0039](I)在制備治療高血壓的藥物或保健品中的應(yīng)用，其作用機(jī)理如前所述，即本發(fā)明的小肽或組合物能夠促進(jìn)GABA作用于血管運(yùn)動(dòng)中樞，從而促進(jìn)動(dòng)脈血管擴(kuò)張，有效降低血壓。同時(shí)還能夠有效抑制血液中谷氨酸的脫羧作用，促進(jìn)血氨轉(zhuǎn)化為尿素排出體外，進(jìn)而預(yù)防高血壓。
[0040](2)在制備減少脂肪的藥物或保健品中的應(yīng)用，其作用機(jī)理如前所述，即本發(fā)明的小肽或組合物能夠協(xié)同作用于中樞神經(jīng)時(shí)，能促進(jìn)脂肪分解代謝，減少合成代謝，從而有效降低肝臟及血液中的甘油三酸酯(TG)含量，達(dá)到降低體重及預(yù)防動(dòng)脈硬化的目的。
[0041](3)在制備改善皺紋的化妝品或保健品中的應(yīng)用，其作用機(jī)理如前所述，即本發(fā)明的小肽或組合物能夠抑制GAT-1對(duì)GABA的再回收，從而延長(zhǎng)GABA的抑制作用，抑制神經(jīng)傳遞引起的面部肌肉纖維的緊張收縮，達(dá)到改善皺紋的目的。
[0042](4)在制備改善睡眠的藥物或保健品中的應(yīng)用，其作用機(jī)理如前所述，即本發(fā)明的小肽或組合物能夠抑制GAT-1對(duì)GABA的再回收。GABA作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度興奮，具有安定、促進(jìn)放松和消除神經(jīng)緊張的作用，因而可用于改善睡眠。
[0043]第四方面，本發(fā)明提供了一種編碼本發(fā)明所述的小肽的多核苷酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，可以根據(jù)不同氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼子，確定編碼如SEQ ID N0:1所示小肽的多肽的多核苷酸。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所述的多核苷酸可以有不同的形式，優(yōu)選根據(jù)不同生物密碼子的使用頻率，選擇相應(yīng)的密碼子。本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的DNA，DNA可以是雙鏈或是單鏈形式，單鏈DNA可以是編碼鏈或是非編碼鏈(反義鏈)。由于本發(fā)明的小肽氨基酸序列很短，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易確定編碼其小肽的多核苷酸序列。
[0044]本發(fā)明提供一類(lèi)全新的小肽，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、合成方便，可以快速的進(jìn)行突變改造。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，此類(lèi)小肽具有SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)相似特性，能與GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GAT-1結(jié)合，降低其對(duì)GABA的攝取功能，還能與SyntaxinlA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合SNAP-25，最終造成興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞抑制，從而為預(yù)防或治療因?yàn)樯窠?jīng)信號(hào)傳遞活躍引起的疾病或狀態(tài)提供了一種新的有效途徑。主要表現(xiàn)為減弱肌肉纖維的收縮，松弛面部皺紋，從而達(dá)到減輕甚至消除皺紋的功效；改善因神經(jīng)遞質(zhì)興奮引起的失眠，提高睡眠質(zhì)量；降低因神經(jīng)緊張引起的高血壓；減少脂肪。本發(fā)明的小肽對(duì)天然抑制通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，具有更安全高效的有利條件。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045]圖1顯示JKB-A與GAT-1的結(jié)合。
[0046]圖2 顯示 JKB-A 與 SyntaxinlA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 SNAP-25。
[0047]圖3顯示JKB-A的GC-MS檢測(cè)峰。
[0048]圖4顯示眼周 連續(xù)30天使用有效濃度0.01% (ff/V) JKB-A與0.01% (ff/V) GABA溶液后皺紋變化?！揪唧w實(shí)施方式】
[0049]現(xiàn)在將通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而言，這些實(shí)施例是為了更具體地說(shuō)明，而如所附權(quán)利要求所述的本發(fā)明的范圍并不限于這些實(shí)施例也不受這些實(shí)施例的限制。
[0050]實(shí)施例1: JKB-A的制備
[0051]1.利用單通道Liberty全自動(dòng)流動(dòng)微波多肽合成系統(tǒng)合成其全序列,通過(guò)HPLC反相C18柱脫鹽、純化。
[0052]2.利用高效液相(HPLC)分離檢測(cè)(C18柱)，鑒定其純度。
[0053]3.采用快原子轟擊質(zhì)譜法(FAB-MS)測(cè)定其分子量，其中以甘油:間硝基芐醇:二甲亞砜(體積比1:1:1)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為I U A，發(fā)射電壓為25kV。
[0054]4.用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定合成小肽序列的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0055]經(jīng)測(cè)定，JKB-A的氨基酸序列為SEQ ID NO:1:Glu-Glu-Lys-Ala_Asp,其分子量590Da,等電點(diǎn)5.52,序列分析顯示其具有與SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)相似特性。
[0056]實(shí)施例2 JKB-A突變體及衍生序列的制備
[0057]1.在JKB-A序列基礎(chǔ)上進(jìn)行殘基替換及末端殘基增加，獲得衍生體庫(kù)。
[0058]2.經(jīng)改造的小肽的合成及分離純化同實(shí)施例1中JKB-A方法一樣。
[0059]3.獲得的產(chǎn)物與SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域特異性抗體孵育,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Western Blot實(shí)驗(yàn)，檢查突變序列功能特性。
[0060]最終獲得兩個(gè)具有與SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域特異性抗體結(jié)合能力的小肽序列，分別為:
[0061]SEQ ID N0:2 =Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro
[0062]SEQ ID N0:3:Glu-Glu-Lys-Ala-Asn
[0063]實(shí)施例3:: JKB-A的藥理實(shí)驗(yàn)
[0064]1、JKB-A與GAT-1結(jié)合的檢測(cè)
[0065]親鉻細(xì)胞培養(yǎng)物取自于牛腎上腺，并經(jīng)膠原酶消化，通過(guò)離心法去除了紅血球，使細(xì)胞密度為652000個(gè)/cm2。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分別在細(xì)胞培養(yǎng)后3天和6天進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)均在37°C下進(jìn)行。取新鮮親鉻細(xì)胞，裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液在37°C條件下與JKB-A共孵育10小時(shí)(每隔三小時(shí)換液一次)，然后在100V電壓，0.5A條件下進(jìn)行12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，使跑膠產(chǎn)物與GAT-1單克隆抗體孵育，牛奶封閉，洗脫后再次孵育熒光標(biāo)記二抗。震蕩孵育4小時(shí)后進(jìn)行顯影照相。
[0066]從附圖1可以看出，JKB-A能夠與GAT-1相結(jié)合，并且隨著JKB-A濃度的增加結(jié)合強(qiáng)度增大。說(shuō)明JKB-A具有GAT-1結(jié)合能力，并且是濃度依賴(lài)的。
[0067]2、JKB-A 與 SyntaxinlA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 SNAP-25 的驗(yàn)證
[0068]在等摩爾的VAMP-2和SyntaxinlA存在的條件下,40 °C下培養(yǎng)2h。接著加入SNAP-25與JKB-A或SNAP-25與JKB-Al混合液，其中在第一組實(shí)驗(yàn)中，JKB-A, JKB-Al的濃度為5mg/L，SNAP-25與JKB-A、JKB-Al摩爾比為1:2 ;第二組實(shí)驗(yàn)中，JKB-A、JKB-Al的濃度為10mg/L，SNAP-25與JKB-A、JKB-Al摩爾比為1:2，40°C下反應(yīng)3h。最后所得到的組合物用12%SDS-PAGE凝膠中分析，用Kodak X-Oiat AR X射線測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果。[0069]從圖2中可以看出，隨著JKB-A加入的增多，形成的完整三元SNARE復(fù)合物的數(shù)量在降低，說(shuō)明JKB-A可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合SNAP-25。
[0070]實(shí)施例四:JKB-A的去皺實(shí)驗(yàn)[0071 ] 1、JKB-A溶液皮膚滲透性實(shí)驗(yàn)
[0072]將JKB-A溶液均勻涂抹在固定的人角質(zhì)層細(xì)胞上，2h后檢測(cè)細(xì)胞表面殘留JKB-A含量。使用少量溶劑洗脫培養(yǎng)細(xì)胞表面殘留JKB-A，通過(guò)HPLC檢測(cè)洗脫下的JKB-A總量，比較JKB-A在細(xì)胞表面含量的的變化，測(cè)定具體的滲透率。
[0073]表1:不同濃度JKB-A溶液皮膚滲透率
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種具有Syntaxin 1A H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽,其中所述小肽為: (a)Glu-Glu-Lys-Ala-Asp所示的序列組成的小肽； (b)Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro所示的序列組成的小肽；或 (c)Glu-Glu-Lys-Ala-Asn所示的序列組成的小肽。
2.一種具有Syntaxin 1A H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽,其中所述小肽為: Ca)權(quán)利要求1中任一氨基酸序列經(jīng)過(guò)修飾所得到的功能等同的小肽衍生物； (C)權(quán)利要求1中任一氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加所形成的功能等同的衍生小肽。
3.一種用于預(yù)防或治療由于Syntaxin 1A與SNAP-25或GAT-1結(jié)合效率而引起的疾病或狀態(tài)的組合物，所述組合物包含如權(quán)利要求1或2中任一所述的具有Syntaxin 1A H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽作為活性成分。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述組合物包含: (a)藥用有效量的如權(quán)利要求1或2中任一所述的具有Syntaxin1A H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽；和 (b)可藥用載體的藥物組合物。
5.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述組合物包含: (a)美容有效量的的如權(quán)利要求1或2中任一所述的具有Syntaxin1A H3結(jié)構(gòu)域類(lèi)似功能的小肽；和 (b)化妝品可用載體的化妝品組合物。
6.如權(quán)利要求3或4所述的組合物在制備治療高血壓的藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求3或4所述的組合物在制備減少脂肪的藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求3或5所述的組合物在制備改善皺紋的化妝品中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求3或4所述的組合物在制備改善睡眠的藥物中的應(yīng)用。
10.一種編碼如權(quán)利要求1所述的小肽的多核苷酸。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103641888SQ201310651700
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】趙偉, 李波 申請(qǐng)人:廣州健坤生物科技有限公司