甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法，新鮮甘蔗葉洗凈剪碎，按每克甘蔗葉添加4mL冷丙酮，并通過勻漿、抽濾、冷凍干燥得到甘蔗葉丙酮粉，按每克甘蔗葉丙酮粉加入3℃、pH6.5、濃度為0.1mol/L磷酸緩沖液6mL，通過冷凍浸提、過濾、冷凍離心，得到甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液，并經(jīng)凝膠排阻柱層析、純化、真空下冷凍干燥后得到多酚氧化酶粉末。通過本發(fā)明能夠獲得廉價、量大、具有高酶活力的多酚氧化酶，為甘蔗的綜合利用和甘蔗葉多酚氧化酶的工業(yè)應(yīng)用以及環(huán)境保護(hù)提供參考。
【專利說明】甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甘鹿(Saccharum sinense)作為我國最常見的農(nóng)作物,在兩廣地區(qū)及海南島等地區(qū)廣泛種植。甘蔗可作為食用甘蔗，也是制造蔗糖的重要原料，并且可以用來制造燃料乙醇作為一種能源替代品。但是甘蔗葉往往被作為廢棄物，然而甘蔗葉中的多酚氧化酶在植株抗蟲害、防褐變等方面具有十分重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法，通過該方法能夠獲得廉價、量大、具有高酶活力的多酚氧化酶，為甘蔗的綜合利用和甘蔗葉多酚氧化酶的工業(yè)應(yīng)用以及環(huán)境保護(hù)提供參考。
[0004]本發(fā)明以如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題:
[0005]甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法，其特征在于，采集新鮮甘蔗葉洗凈并剪成碎塊，按每克甘蔗葉碎塊添加4mL冷丙酮，高速勻漿搗碎I分鐘，停止30秒然后再次高速勻漿搗碎I分鐘，形成懸濁液，將懸濁液用雙層定性濾紙抽濾，所得濾渣用所述冷丙酮洗至呈白色為止，冷凍干燥所述濾渣，得到甘蔗葉丙酮粉，按每克甘蔗葉丙酮粉加入3°C、pH6.5、濃度為
0.lmol/L磷酸緩沖液6mL，冷凍浸提后用紗布進(jìn)行過濾，收集濾液，將所述濾液以1000Or/min冷凍離心20分鐘，收集上清液得到甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液，所得甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200進(jìn)行凝膠排阻柱層析,收集活性組分,運用DEAE Sephadex A50純化，得到甘蔗葉多酚氧化酶純液，在真空下冷凍干燥得到甘蔗葉多酚氧化酶粉末。
[0006]所述冷丙酮溫度為-10°C。
[0007]所述濾渣冷凍干燥、冷凍浸提、冷凍離心的溫度均為3°C ;所述冷凍浸提時間為4小時。
[0008]甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法，其特征在于，采集新鮮甘蔗葉洗凈并剪成碎塊，按每克甘蔗葉碎塊加入含表面活性劑的3°C、pH6.5、濃度為0.lmol/L的磷酸緩沖液6mL，然后高速勻漿搗碎I分鐘，停止30秒后再次高速勻漿搗碎I分鐘，形成勻漿，所得勻漿冷凍浸提后用紗布過濾，收集濾液，將所述濾液以lOOOOr/min冷凍離心20分鐘，收集上清液得到甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液，所得甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200進(jìn)行凝膠排阻柱層析，收集活性組分，運用DEAE Sephadex A50純化,得到甘鹿葉多酹氧化酶純液,在真空下冷凍干燥得到甘蔗葉多酚氧化酶粉末。
[0009]所述表面活性劑為吐溫或Triton X-100。
[0010]所述含表面活性劑吐溫的磷酸緩沖液中，吐溫與磷酸緩沖液的容積比為2.5% ；或:含Triton X-100的磷酸緩沖液中，Triton X-100與磷酸緩沖液的容積比為0.2%。
[0011]所述勻漿冷凍浸提、冷凍離心溫度均為3°C，冷凍浸提時間為8小時。[0012]本發(fā)明采用的原料是來源豐富、廉價的甘蔗葉，為提高甘蔗的綜合附加值提供了參考，同時通過本發(fā)明可獲得量大、活性高、廉價的甘蔗葉多酚氧化酶，具有工業(yè)實用價值。
【具體實施方式】
[0013]以0.2mol/L鄰苯二酚為底物，測得甘蔗葉多酚氧化酶最合適的反應(yīng)溫度為33°C，最適 pH 為 7.1，其米氏常數(shù)為 0.831mol/L, Vmax=0.2310 (U/min)。
[0014]本發(fā)明所述甘蔗葉剪成碎塊，對碎塊大小沒有嚴(yán)格的要求，因為之后還要勻漿搗碎，所以剪成I 一 3cm2大小的碎塊均可。
[0015]實施例1:
[0016]采集新鮮甘蔗葉洗凈，取100克甘蔗葉剪成Icm2左右大小的塊狀，加入400mL-10°C冷丙酮，用組織搗碎儀高速勻漿搗碎I分鐘，停機(jī)30秒然后再次搗碎I分鐘使甘蔗葉充分搗碎，形成懸濁液；將懸濁液用雙層定性濾紙抽濾，所得濾渣用-10°C冷丙酮洗至濾渣呈白色為止，在:TC溫度下冷凍干燥濾渣，得到甘蔗葉丙酮粉；取100克甘蔗葉丙酮粉加入600mL3°C預(yù)冷、pH為6.5、濃度為0.lmol/L的磷酸緩沖液，置于冰箱內(nèi)在3°C溫度下冷凍浸提4小時，之后用2層紗布進(jìn)行抽濾，收集濾液，將濾液以10000r/min在3°C溫度下冷凍離心20分鐘，收集上清液得甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液；所得甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200進(jìn)行凝膠排阻柱層析，用分部收集器收集活性組分，用DEAESephadex A50純化,得到甘鹿葉多酹氧化酶純液，用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥8小時,得到甘蔗葉多酚氧化酶粉末 。
[0017]經(jīng)測定酶活力為223U/mL。
[0018]實施例2:
[0019]采集新鮮甘蔗葉洗凈，取100克甘蔗葉剪成Icm2左右大小的塊狀，加入600mL含吐溫的、3°C預(yù)冷、pH6.5、濃度為0.lmol/L的磷酸緩沖液，所述吐溫與所述磷酸緩沖液容積比為2.5%，用組織搗碎儀高速勻漿搗碎I分鐘，停機(jī)30秒然后再次搗碎I分鐘，所得勻漿置于冰箱內(nèi)在3°C溫度下冷凍浸提8小時，之后用4層紗布過濾，收集濾液，將濾液以1000Or/min在:TC溫度下冷凍離心20分鐘，收集上清液得甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液；所得甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200進(jìn)行凝膠排阻柱層析，用分部收集器收集活性組分，用DEAESephadex A50純化，得到甘蔗葉多酚氧化酶純液，用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥8小時，得到甘蔗葉多酚氧化酶粉末。
[0020]經(jīng)測定酶活力為241U/mL。
[0021]實施例3:
[0022]采集新鮮甘蔗葉洗凈，取100克甘蔗葉剪成Icm2左右大小的塊狀，加入600mL含TritonX-1OO的、3°C預(yù)冷、ρΗ6.5、濃度為0.lmol/L的磷酸緩沖液，所述Triton X-100與所述磷酸緩沖液容積比為0.2%，用組織搗碎儀高速勻漿搗碎I分鐘，停機(jī)30秒然后再次搗碎I分鐘，所得勻漿置于冰箱內(nèi)在3°C溫度下冷凍浸提8小時，之后用4層紗布過濾，收集濾液，將濾液以10000r/min在3°C溫度下冷凍離心20分鐘，收集上清液得甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液；所得甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200進(jìn)行凝膠排阻柱層析，用分部收集器收集活性組分，用DEAE Sephadex A50純化，得到甘蔗葉多酚氧化酶純液，用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥8小時，得到甘蔗葉多酚氧化酶粉末。[0023] 經(jīng)測定酶活 力為250U/mL。
【權(quán)利要求】
1.甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法，其特征在于，采集新鮮甘蔗葉洗凈并剪成碎塊，按每克甘蔗葉碎塊添加4mL冷丙酮，高速勻漿搗碎I分鐘，停止30秒然后再次高速勻漿搗碎I分鐘，形成懸濁液，將懸濁液用雙層定性濾紙抽濾，所得濾渣用所述冷丙酮洗至呈白色為止，冷凍干燥所述濾渣，得到甘蔗葉丙酮粉，按每克甘蔗葉丙酮粉加入3°C、pH6.5、濃度為0.lmol/L磷酸緩沖液6mL，冷凍浸提后用紗布進(jìn)行過濾，收集濾液，將所述濾液以1000Or/min冷凍離心20分鐘，收集上清液得到甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液，所得甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200進(jìn)行凝膠排阻柱層析,收集活性組分,運用DEAE Sephadex A50純化，得到甘蔗葉多酚氧化酶純液，在真空下冷凍干燥得到甘蔗葉多酚氧化酶粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法，其特征在于，所述冷丙酮溫度為-1o°c。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法，其特征在于，所述濾渣冷凍干燥、冷凍浸提、冷凍離心的溫度均為3°C ;所述冷凍浸提時間為4小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法，其特征在于，采集新鮮甘蔗葉洗凈并剪成碎塊，按每克甘蔗葉碎塊加入含表面活性劑的3°C、pH6.5、濃度為0.1mol/L的磷酸緩沖液6mL，然后高速勻漿搗碎I分鐘，停止30秒后再次高速勻漿搗碎I分鐘，形成勻漿，所得勻漿冷凍浸提后用紗布過濾，收集濾液，將所述濾液以10000r/min冷凍離心20分鐘，收集上清液得到甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液，所得甘蔗葉多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200進(jìn)行凝膠排阻柱層析,收集活性組分,運用DEAE Sephadex A50純化,得到甘蔗葉多酚氧化酶純液，在真空下冷凍干燥得到甘蔗葉多酚氧化酶粉末。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法，其特征在于，所述表面活性劑為吐溫或Triton X-100。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法，其特征在于，所述含表面活性劑吐溫的磷酸緩沖液中，吐溫與磷酸緩沖液的容積比為2.5% ;或:含Triton X-100的磷酸緩沖液中，Triton X-100與磷酸緩沖液的容積比為0.2%。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的甘蔗葉多酚氧化酶的制備方法，其特征在于，所述勻漿冷凍浸提、冷凍離心溫度均為3°C，冷凍浸提時間為8小時。
【文檔編號】C12N9/02GK103627681SQ201310648809
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】楊洋, 候杰, 馬萬良, 胡振興, 葉琴 申請人:廣西大學(xué)