GhUGP1基因在改良棉花纖維品質(zhì)中的應(yīng)用方法
【專(zhuān)利摘要】GhUGP1基因在改良棉花纖維品質(zhì)中的應(yīng)用方法，利用pCAMINBIA-2300構(gòu)建GhUGP1基因的過(guò)量表達(dá)載體，分別使用35S啟動(dòng)子和棉花纖維特異性E6啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因，將構(gòu)建的載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花；獲得了連續(xù)3代以上田間檢測(cè)及分子檢測(cè)陽(yáng)性，纖維長(zhǎng)度和斷裂比強(qiáng)度提高，可溶性糖含量顯著降低，穩(wěn)定遺傳不再分離的轉(zhuǎn)基因后代材料。35S啟動(dòng)過(guò)量表達(dá)GhUGP1基因的兩個(gè)受體轉(zhuǎn)基因后代株系纖維長(zhǎng)度最高增加18.50％，斷裂比強(qiáng)度最多增加31.85％；E6啟動(dòng)過(guò)量表達(dá)GhUGP1基因的轉(zhuǎn)基因后代株系纖維長(zhǎng)度最高增加9.06％，斷裂比強(qiáng)度最多增加15.00％。
【專(zhuān)利說(shuō)明】GhUGPI基因在改良棉花纖維品質(zhì)中的應(yīng)用方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及構(gòu)建棉花中一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(GhUGPl)過(guò)量表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化棉花，該基因的表達(dá)產(chǎn)物尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶能夠利用纖維細(xì)胞中的游離糖合成尿苷二磷酸葡萄糖，進(jìn)而促進(jìn)纖維素的合成，影響次生壁的發(fā)育，達(dá)到改良纖維品質(zhì)的目的。
二、【背景技術(shù)】
[0002]棉花是我國(guó)的主要經(jīng)濟(jì)作物之一，我國(guó)也是世界上棉花的生產(chǎn)大國(guó)和消費(fèi)大國(guó)；棉纖維是人們衣被和日用紡織品的主要原料，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)和人民生活中占有重要地位。近年來(lái)由于我國(guó)紡織技術(shù)的發(fā)展以及國(guó)民需求的日益增長(zhǎng)，對(duì)棉花纖維的品質(zhì)，主要是長(zhǎng)度和強(qiáng)度方面，提出了更高的要求。自從上個(gè)世紀(jì)90年代，基因工程技術(shù)在棉花中開(kāi)始應(yīng)用以來(lái)，與棉花纖維發(fā)育相關(guān)的基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，分子手段在棉花育種中地位也越來(lái)越重要。研究棉纖維發(fā)育的分子機(jī)制，運(yùn)用分子標(biāo)記和基因工程等手段改良纖維品質(zhì)，同時(shí)結(jié)合傳統(tǒng)育種技術(shù)篩選高品質(zhì)纖維的優(yōu)良品種，已經(jīng)成為當(dāng)今棉花研究領(lǐng)域的主題。
[0003]棉纖維是棉花種子的表皮毛，是胚珠外珠被表皮層的單細(xì)胞分化逐步發(fā)育而成，成熟的棉纖維由初生壁和次生壁組成，后者為棉纖維的主體部分。棉纖維在發(fā)育過(guò)程中主要經(jīng)歷纖維原始細(xì)胞分化和突起、纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)、次生壁增厚和棉纖維脫水成熟四個(gè)階段，其各個(gè)階段各具特點(diǎn)，并且相互重疊，沒(méi)有明顯的界限(BaraAS，1984)。纖維原始細(xì)胞分化和突起是棉纖維發(fā)育的第一階段，是指胚珠表皮細(xì)胞分化形成纖維原始細(xì)胞并且已分化的纖維原始細(xì)胞擴(kuò)展為球狀或半球狀的纖維突起。棉纖維在此階段含有的代謝物對(duì)調(diào)節(jié)纖維表皮細(xì)胞和非纖維細(xì)胞的比例、長(zhǎng)絨和短絨的比例起重要作用，從而能夠影響纖維長(zhǎng)度和整齊度(杜雄明，2000)。纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)是棉纖維發(fā)育的第二階段，棉纖維細(xì)胞在開(kāi)花當(dāng)天開(kāi)始伸長(zhǎng)，棉纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)是一個(gè)涉及初生壁合成、細(xì)胞的生長(zhǎng)方向以及遺傳因素在內(nèi)的復(fù)雜的生理過(guò)程，并且棉纖維伸長(zhǎng)期的長(zhǎng)短直接影響棉纖維的長(zhǎng)度。次生壁增厚是棉纖維發(fā)育的第三個(gè)階段，在此階段，纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)和初生壁合成逐漸停止，而次生壁開(kāi)始增厚，并且纖維素大量合成。纖維素的沉積量決定細(xì)胞壁的厚度，原纖維的排列方式?jīng)Q定了纖維素的結(jié)晶度。細(xì)胞壁的厚度和纖維素的結(jié)晶度是影響纖維強(qiáng)度的主要因素(張輝，2007)。脫水成熟是棉纖維發(fā)育的最后階段，是細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程。成熟的纖維主要是細(xì)胞壁以及少量的殘留物，成熟棉纖維纖維素含量高達(dá)90%~95% ;并且棉纖維的成熟度對(duì)纖維強(qiáng)度，彈性等有重要影響。
[0004]成熟棉纖維的主要組成部分是纖維素，纖維素是葡萄糖分子通過(guò)(6-1, 4-糖苷鍵連接而形成的高分子化合物。目前普遍認(rèn)為，在棉纖維細(xì)胞中，纖維素以尿苷二磷酸葡萄糖(UGPD)為底物由纖維素合酶催化合成的(高振宇，1998)。在棉花纖維中，UGPD由蔗糖合酶(SuSy)和尿苷二磷酸葡萄·糖焦磷酸化酶(UGPase)催化合成(Ruan YL, 1997)。有研究表明，UGPD含量在纖維細(xì)胞次生壁加厚期含量較高且表達(dá)SuSy和UGPase的基因在次生壁加厚期同樣有較高的表達(dá)量，并且SuSy和UGPase的基因表達(dá)同步(Taliercio E，2004)。[0005]北京大學(xué)朱玉賢教授實(shí)驗(yàn)室利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法發(fā)現(xiàn)UDP-D-葡萄糖磷酸化酶(UGPase)在10DPA(day post anthesis)纖維中累積，UGPase催化葡萄糖-1磷酸轉(zhuǎn)化為尿苷二磷酸葡萄糖(M)PG)，而植物細(xì)胞壁豐富的多糖是由UDPG經(jīng)一系列的轉(zhuǎn)化成各種核苷糖，再經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶合成細(xì)胞壁不同組分?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因GhUGPl在纖維發(fā)育中后期表達(dá)量達(dá)到峰值。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UGPase主要參與次生壁發(fā)育，暗示提高GhUGPl的表達(dá)量可降低纖維中寡糖的含量，提高UDPG的合成，從而影響細(xì)胞壁的發(fā)育，但是還未在實(shí)際生產(chǎn)中得到應(yīng)用。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在提供一種通過(guò)植物基因工程改良棉花纖維品質(zhì)的方法，依據(jù)是棉花纖維中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶能夠利用纖維中游離的寡糖，促進(jìn)纖維素的合成，從而達(dá)到改良棉花纖維品質(zhì)的目的。
[0007]本發(fā)明提供了利用GhUGPl基因改良棉花纖維品質(zhì)的方法，該方法是利用植物表達(dá)雙元載體pCAMINBIA-2300來(lái)構(gòu)建GhUGPl基因的過(guò)量表達(dá)載體，并分別使用花椰菜花葉病病毒35S啟動(dòng)子和棉花纖維特異性E6啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)目的基因，將構(gòu)建的載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花，后代經(jīng)種植、田間鑒定、分子檢測(cè)及纖維品質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)，連續(xù)選擇多代，得到改良后代。
[0008]該方法包括如下的具體步驟:
[0009]1.GhUGPl過(guò)量表達(dá)載體構(gòu)建
[0010]a.質(zhì)粒提取
[0011]分別將攜帶有GhUGPl cDNA 序列 T 載體、35S-pCAMBIA 2300 載體、E6_pCAMBIA2300載體的E.coli DH5 a 40 u L菌液置于4mL含有100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，180rpm過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒；
`[0012]c.酶切產(chǎn)物的回收`
[0013]d.載體與目的基因連接、轉(zhuǎn)化及鑒定
[0014]①將回收的酶切產(chǎn)物16°C過(guò)夜連接；
[0015]②將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)化菌落振蕩培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR ；
[0016]使用的引物序列為:
[0017]F 引物 5' -AACCTCGTCTCTCGCTATCTCAGT-3'
[0018]R 引物 5' -CAATAGCACCCAAGTTGTCTGAGT-3'
[0019]PCR 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 5min 后，94°C變性 45s，58°C退火 45s，72°C延伸 lmin，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存；
[0020]將上述PCR產(chǎn)物，在含有染料的I %瓊脂糖凝膠電泳后，觀(guān)察；
[0021]③選擇PCR陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定；
[0022]選擇酶切結(jié)果理想的菌液，加入等體積30%甘油，_80°C保菌；
[0023]2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
[0024]a.制備農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)并使用凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)化
[0025]b.農(nóng)桿菌LBA4404重組子的檢測(cè)[0026]挑取轉(zhuǎn)化平板上的農(nóng)桿菌單菌落，接種于含25mg / L利福平和50mg / L卡那霉素的液體YEB培養(yǎng)基，于28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，選擇PCR檢測(cè)陽(yáng)性的克隆進(jìn)行保存及后續(xù)轉(zhuǎn)化；
[0027]c.農(nóng)桿菌使用改良的浸花法轉(zhuǎn)化棉花
[0028]將ImL菌液置于含有50mg / L利福平和50mg / L卡那霉素的IL培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)至菌液OD6tltl大于1.2以上；5000rpm4°C離心IOmin收集菌液，將菌液重懸于IL含有0.2% Silwet-L77的10%蔗糖溶液，于田間進(jìn)行轉(zhuǎn)化；
[0029]選擇當(dāng)天花朵完全綻放，但是還未授粉受精的棉花花朵，用小型噴壺對(duì)著棉花柱頭噴二到三次，約I~2mL菌液，將花朵花瓣合攏扎住，花柄標(biāo)記，轉(zhuǎn)化結(jié)束后及時(shí)灌溉；待收獲季節(jié)，根據(jù)標(biāo)記收集轉(zhuǎn)化花朵，軋花、脫絨，得Ttl種子；
[0030]將收獲的Ttl種子種植，待棉花長(zhǎng)出2~3片真葉后，分別用0.5%,0.75%、1%卡那霉素溶液篩選三次，篩選間隔為5~7天；
[0031]選擇連續(xù)三次滴加卡那霉素部位未變黃的植株，綁線(xiàn)標(biāo)記，采集葉片，置于液氮中，用于后續(xù)PCR檢測(cè)及Southern雜交(Southern blotting)鑒定；
[0032]待收獲季節(jié)，選擇棉株株型適合種植的材料，收獲；
[0033]軋取棉纖維，進(jìn)行纖維品質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)；選擇PCR檢測(cè)陽(yáng)性、纖維長(zhǎng)度顯著增加的轉(zhuǎn)基因后代品系保留，作為下一個(gè)種植季的材料，其他材料作為種質(zhì)資源保存；
[0034]連續(xù)3代以上田間檢測(cè)及分子檢測(cè)陽(yáng)性，纖維長(zhǎng)度和斷裂比強(qiáng)度提高，可溶性糖含量顯著降低，穩(wěn)定遺傳不再分離的轉(zhuǎn)基因后代即可確定為有效導(dǎo)入并改良成功的品種材料。
[0035]改良后代的棉花纖 維經(jīng)農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心進(jìn)行纖維品質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)分析，結(jié)果表明:35S啟動(dòng)的GhUGPl基因的轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系相比，過(guò)量表達(dá)GhUGPl基因的“新陸早36”及陸地棉品系“3-6-7”轉(zhuǎn)基因株系纖維長(zhǎng)度增加范圍分別為3.75%~15.12%,3.61%~18.50%，斷裂比強(qiáng)度增加范圍分別為9.56%~31.85%,0.58~22.36%；E6啟動(dòng)的GhUGPl基因轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系相比，過(guò)量表達(dá)GhUGPl基因的“新陸早36”轉(zhuǎn)基因株系纖維長(zhǎng)度增加范圍為5.68%~9.06%，斷裂比強(qiáng)度增加范圍為 6.92%~15.00%。
[0036]35S啟動(dòng)的GhUGPI基因轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系相比，過(guò)量表達(dá)GhUGPI基因的“3-6-7”轉(zhuǎn)基因株系可溶性糖含量降低的范圍為34.61%~48.19%，可溶性糖中還原性糖含量降低的范圍為34.73%~60.05%，纖維素含量增加的范圍為0.81%~2.23% ；E6啟動(dòng)的GhUGPl基因轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系相比，過(guò)量表達(dá)GhUGPl基因的“新陸早36”轉(zhuǎn)基因株系纖維中可溶性糖含量降低的范圍為32.47%~48.12%，可溶性糖中還原性糖含量降低的范圍為30.40%~46.29%，纖維素含量增加的范圍為0.67%~2.56%。
[0037]5個(gè)轉(zhuǎn)35S: =GhUGPl基因的“3_6_7”轉(zhuǎn)基因株系后代與5個(gè)轉(zhuǎn)E6: =GhUGPl轉(zhuǎn)“新陸早36”的轉(zhuǎn)基因株系后代Southern雜交結(jié)果表明10個(gè)株系均為單拷貝，其成熟纖維中可溶性糖含量和可溶性糖中還原性糖含量與對(duì)照相比均降低，呈現(xiàn)極顯著差異。
[0038]檢測(cè)結(jié)果證明將上述基因在棉花中過(guò)量表達(dá)，能夠降低纖維中寡糖的含量，從而影響細(xì)胞壁的發(fā)育，提高纖維素含量，纖維品質(zhì)得到明顯改良，尤其是增加纖維長(zhǎng)度和強(qiáng)力。四、【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1為35S啟動(dòng)的GhUGPl基因插入到載體pCAMBIA2300中以獲得的過(guò)量表達(dá)載體 35S-pCAMBIA2300-GhUGPl 的構(gòu)建示意圖。
[0040]圖2為E6啟動(dòng)的GhUGPl基因插入到載體pCAMBIA2300中以獲得的過(guò)量表達(dá)載體E6-pCAMBIA2300-GhUGPl 的構(gòu)建示意圖。
[0041]圖1、圖2中LB和RB分別表示T-DNA的左右邊界序列；NPTII代表卡那霉素基因；GaMV35s代表花椰菜花葉病病毒35s啟動(dòng)子，E6代表棉花纖維特異性E6啟動(dòng)子；GhUGPl代表目的基因；Nos terminator代表冠癭堿合成酶終止子。
[0042]圖3 為 35S: =GhUGPl 轉(zhuǎn)陸地棉品系 “3-6-7” T8Southern 雜交圖。
[0043]圖4為E6: =GhUGPl轉(zhuǎn)陸地棉品種“新陸早36” T8Southern雜交圖。
[0044]圖3、圖4中陰性對(duì)照表示未轉(zhuǎn)基因的受體材料；陽(yáng)性對(duì)照表示構(gòu)建的過(guò)量表達(dá)載體質(zhì)粒;40，41，54，60，62 代表 35S: =GhUGPl 轉(zhuǎn) “3-6-7” T8 株系；22，24，25，28，34 代表E6: =GhUGPl轉(zhuǎn)“新陸早36” T8株系。
五、【具體實(shí)施方式】
[0045]下述實(shí)施中所使用的方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0046]下述實(shí)施中所用的材料、試劑等，如無(wú)特別說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑中獲得
[0047]( 一 ) GhUGPl 過(guò)量表達(dá)載體構(gòu)建
[0048]1.質(zhì)粒提取
[0049]含有GhUGPlcDNA序列T載體由北京大學(xué)蛋白質(zhì)工程及植物基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室朱玉賢教授提供，植物表達(dá)載體35S-pCAMBIA2300和E6_pCAMBIA2300均由本實(shí)驗(yàn)室保存，以上質(zhì)粒均被大腸桿菌E.coli DH5a攜帶。
[0050]分別將攜帶有GhUGPlcDNA 序列 T 載體、35S_pCAMBIA2300 載體、E6-pCAMBIA2300載體的E.coli DH5 a 40 u L菌液置于4mL含有IOOmg / L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，370C，180rpm過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒；
[0051]2.載體及目的基因的酶切
[0052]提取質(zhì)粒后，將以上三種質(zhì)粒分別按照下列體系過(guò)夜酶切:
[0053]表1質(zhì)粒酶切體系
【權(quán)利要求】
1.GhUGPl基因在改良棉花纖維品質(zhì)中的應(yīng)用方法，該方法是利用植物表達(dá)雙元載體pCAMINBIA-2300來(lái)構(gòu)建GhUGPl基因的過(guò)量表達(dá)載體，并分別使用花椰菜花葉病病毒35S啟動(dòng)子和棉花纖維特異性E6啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)目的基因，將構(gòu)建的載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花，后代經(jīng)種植、田間鑒定、分子檢測(cè)及纖維品質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)，連續(xù)選擇多代，得到纖維長(zhǎng)度和斷裂比強(qiáng)度提高，可溶性糖含量顯著降低的棉花轉(zhuǎn)基因后代材料。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的分子檢測(cè)使用的引物序列及反應(yīng)程序?yàn)? F 引物 5' -AACCTCGTCTCTCGCTATCTCAGT-3'； R 引物 5' -CAATAGCACCCAAGTTGTCTGAGT-3'； 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min后，94°C變性45s，58°C退火45s，72°C延伸Imin，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72°C延伸1 0min，4°C保存。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103667337SQ201310613879
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】李曉榮, 秦詠梅, 李曉東, 范玲, 李波, 胡文冉, 柳皋雋, 楊洋 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所, 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院