昆蟲促前胸腺激素基因及其在植物抗蟲方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種昆蟲促前胸腺激素基因及其在植物抗蟲方面 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、蛻皮、變態(tài)、滯育、生殖、多型現(xiàn)象等生理過(guò)程以及行為反應(yīng)等都 離不開激素的參與。蛻皮激素（ecdysone)是由前胸腺分泌的能調(diào)節(jié)動(dòng)物(主要是節(jié)肢動(dòng)物 門昆蟲綱、甲殼綱的動(dòng)物）蛻皮的激素。蝦、蟹的幼體和成體都有蛻皮現(xiàn)象，無(wú)翅亞綱動(dòng)物 的幼蟲和成蟲具有蛻皮現(xiàn)象,有翅亞綱動(dòng)物只有幼蟲有蛻皮現(xiàn)象。大多數(shù)昆蟲幼蟲有周期 性蛻皮現(xiàn)象。神經(jīng)肽是一類分泌肽，由大分子量的、無(wú)活性前激素原經(jīng)過(guò)翻譯后裂解而來(lái)。 神經(jīng)肽類激素在昆蟲生活周期的各個(gè)方面均發(fā)揮著重要的作用，例如常見(jiàn)的促前胸腺激素 (ProthoracicotropicHormone,PTTH)對(duì)昆蟲的前胸腺合成脫皮激素有重要的促進(jìn)作用。
[0003] 多年以來(lái)作物產(chǎn)量的提高依賴于化學(xué)合成殺蟲劑的高效利用。但是隨著殺蟲劑在 農(nóng)、林業(yè)中的大量應(yīng)用，一些有待解決的問(wèn)題逐漸引起關(guān)注，如環(huán)境污染，邊際效應(yīng)對(duì)非靶 標(biāo)昆蟲產(chǎn)生的危害，自然平衡被擾亂引起的害蟲猖獗和害蟲抗藥性的增加等問(wèn)題。為了解 決這些問(wèn)題科學(xué)家們?cè)趯ふ腋行У目商娲瘜W(xué)殺蟲劑的抗蟲技術(shù)方面做了很多嘗試，包 括天敵的利用，基于天然產(chǎn)物的殺蟲劑的使用，抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)等等。以上策略中， 以表達(dá)蘇云金芽孢桿菌毒蛋白的轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)用最為廣泛。Bt毒蛋白可以殺死一些主要的 以作物為食的害蟲種群，而對(duì)脊椎動(dòng)物和其它生物無(wú)害。目前Bt蛋白殺蟲劑應(yīng)用最廣的是 CrylA晶體蛋白家族，尤其是用于轉(zhuǎn)基因玉米的CrylAb和用于轉(zhuǎn)基因棉花的CrylAc。在中 國(guó)，轉(zhuǎn)基因Bt棉自1997年商業(yè)化以來(lái)，在對(duì)抗棉鈴蟲的過(guò)程中發(fā)揮了很大的作用。近年來(lái)， 在實(shí)驗(yàn)室或者種植Bt轉(zhuǎn)基因作物的大田中都發(fā)現(xiàn)對(duì)Bt蛋白產(chǎn)生抗性的害蟲，至少分離出3 種害蟲的7個(gè)產(chǎn)生抗性的小種。另一方面，由于長(zhǎng)期種植Bt轉(zhuǎn)基因作物，農(nóng)田的害蟲種群 結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了變化，由單一害蟲占主導(dǎo)的種群結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)展成多個(gè)害蟲占主導(dǎo)的種群結(jié)構(gòu)， 這為控制害蟲帶來(lái)了更多困難。綜上所述，亟待一種對(duì)環(huán)境安全，種群特異性強(qiáng)，對(duì)作物性 狀沒(méi)有不良影響的新抗蟲方法出現(xiàn)。昆蟲激素已成為殺蟲劑研究與開發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)領(lǐng)域， 不同于以往作用于神經(jīng)系統(tǒng)的傳統(tǒng)殺蟲劑，其作用毒性低、污染少、對(duì)天敵和有益生物影響 小，有助于可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展、有利于無(wú)公害綠色食品生產(chǎn)、有益于人類健康。
[0004]RNA干擾（RNAinterference，RNAi)是一種新發(fā)現(xiàn)的基因調(diào)控機(jī)制，是由與祀基因 序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)所誘導(dǎo)的一種特異性基因沉默現(xiàn)象。有研究表明將dsRNA直 接注射進(jìn)昆蟲的卵、血腔或局部組織，可引發(fā)遠(yuǎn)距離靶基因的特異性沉默。此外，除了直接 注射dsRNA，還可以通過(guò)飼喂dsRNA的方法誘導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。目前已有研究表明飼 喂相應(yīng)祀基因的dsRNA已成功降低蘋淺褐卷蛾（Epiphyaspostvittana)幼蟲羧酸酯酶表 達(dá)水平、蜜蜂（Apismellifera)的雷帕霉素祀蛋白（targetofrapamycin，amTOR)的表達(dá) 水平及棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera)P450基因的表達(dá)水平。因而，以RNAi技術(shù)為基礎(chǔ) 開發(fā)新的害蟲防治方法，為農(nóng)業(yè)害蟲的防治提供了高特異性和環(huán)境安全的新策略。
[0005] 昆蟲激素在昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育中起著極其重要的作用。調(diào)節(jié)昆蟲發(fā)育的昆蟲激素， 其合成、運(yùn)輸和代謝途徑中所涉及的關(guān)鍵基因多數(shù)具有很強(qiáng)的物種特異性，即與其他物種 的基因同源性低，尤其是與人類基因相比幾乎沒(méi)有同源性，這在很大程度上降低了RNAi技 術(shù)的"脫靶效應(yīng)"，從而為應(yīng)用安全性方面提供了保障。因此，在植物中表達(dá)昆蟲激素相關(guān)基 因的dsRNA，其優(yōu)點(diǎn)在于只對(duì)植食性的昆蟲有抑制作用，同時(shí)還可以根據(jù)昆蟲激素相關(guān)基因 的物種特異性，通過(guò)表達(dá)不同序列的dsRNA對(duì)某一種或某一屬昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響， 從而達(dá)到精確、安全的控制蟲害的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種昆蟲促前胸腺激素基因在植物抗蟲方面的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供了一種可以表達(dá)抑制昆蟲促前胸腺激素的發(fā)卡RNA的DNA分子。
[0008] 本發(fā)明所提供的DNA分子具體為如式（I)所示的DNA片段：
[0009]SEQ正向-X-SEQ反向(I)
[0010] 所述SEQM的序列為序列1的第1-659位；
[0011] 所述SEQ_的序列與所述序列反向互補(bǔ)(序列1的第879-1537位）；
[0012] 所述X是所述SEQM與所述SEQ_之間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ 正向及所述SEQ反向均不互補(bǔ)。
[0013] 在本發(fā)明中，式（I)中所述X的序列如序列表中序列1的第669-869位所示。
[0014] 更加具體的，式（I)所示的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0015] 本發(fā)明所提供的DNA分子也可為如下DNA片段甲和DNA片段乙：所述DNA片段甲 為序列表中序列4的第10-667位；所述DNA片段乙為序列表中序列4的第10-667位的反 向互補(bǔ)序列。
[0016] 含有所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0017] 所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。
[0018] 所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元 農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、 pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá) 載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加 工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端。使 用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、 組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒（CAMV)35S啟動(dòng)子、泛素基因Ubiquitin 啟動(dòng)子（pUbi)、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合 使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或 轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與 編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的 來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié) 構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用重組表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性 的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境 篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0019] 在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子具體為PRP啟動(dòng)子 或17啟動(dòng)子。
[0020] 進(jìn)一步，所述PRP啟動(dòng)子的序列如序列表中序列2所示。
[0021] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體具體為如下（a)或（b):
[0022] (a)在pC2300PN載體的酶切位點(diǎn)處正向插入序列1所示DNA片段后得到的重組質(zhì) 粒；所述酶切位點(diǎn)具體為PstI;
[0023] 所述pC2300PN載體為將序列表中序列2所示的DNA片段（PRP啟動(dòng)子）插入到 PCAMBIA2300載體的PstI和EcoRI之間，同時(shí)將序列3所示DNA片段（T-N0S終止子）插 入到PstI和HindIII之間后的得到的重組質(zhì)粒。
[0024] (b)在L4440載體的兩個(gè)反向17啟動(dòng)子之間插入序列4的第10-667位核苷酸(或 其反向互補(bǔ)序列）后得到的重組質(zhì)粒；所述酶切位點(diǎn)具體為BglII和XhoI。在該重組質(zhì) 粒中，序列4的第10-667位核苷酸(或其反向互補(bǔ)序列）被兩個(gè)反向17啟動(dòng)子雙向啟動(dòng)。
[0025] 由以上式（I)所示DNA片段編碼得到的RNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 以上式（I)所示DNA片段，或所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌，或所述RNA分 子在如下al)或a2)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0027] al)防治蟲害；
[0028] a2)培育抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物。
[0029] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0030] 本發(fā)明所提供的培育抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟：將所述 DNA片段導(dǎo)入目的植物中，得到抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物。
[0031] 在上述應(yīng)用或方法中，所述抗蟲可體現(xiàn)為促進(jìn)蟲的死亡，和/或抑制存活下來(lái)的 蟲的體重的增加。
[0032] 在上述方法中，將所述DNA片段導(dǎo)入所述目的植物中具體是通過(guò)將攜帶有所述 DNA片段的以上所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中實(shí)現(xiàn)的。
[0033] 在上述方法中，將攜帶有所述DNA片段的所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物， 具體可為：通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿 菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0034] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種殺蟲劑。
[0035] 本發(fā)明所提供的殺蟲劑的活性成分為以上式（I)所示DNA片段，或所述重組表達(dá) 載體、表達(dá)盒或重組菌，或所述RNA分子。
[0036] 以上式（I)所示DNA片段，或所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌，或所述RNA分 子在制備殺蟲劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0037] 以上所有的所述殺蟲劑均為可作用于棉鈴蟲等害蟲的殺蟲劑。
[0038] 在以上所述的應(yīng)用或方法中，所述植物可為雙子葉植物，也可為單子葉植物。在 本發(fā)明中，所述植物為雙子葉植物，具體為棉花（GossypiumhirsutumL.)，如陸地棉 (Gossypiumhirsutum)品種泗棉 3 號(hào)，或煙草（如Nicotianatabacumcv.Xanthi)。
[0039] 在本發(fā)明中，以上所述的應(yīng)用或方法中的所述蟲為棉鈴蟲，具體為2齡棉鈴蟲或3 齡棉鈴蟲。
[0040] 實(shí)驗(yàn)