專利名稱：棉花GbVe基因、其編碼蛋白及在植物抗黃萎病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及棉花GbVe基因、其編碼蛋白及在植物抗黃 萎病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
棉花黃萎病被稱為“棉花癌癥”，其致病菌為大麗輪枝菌，由于抗病基因資源匱乏 和大麗輪枝菌治病機(jī)理復(fù)雜，尚無有效地防治方法，黃萎病已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)影響棉花 產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的主要病害之一。黃萎病是一種土傳維管束疾病，其病菌可在土壤中長(zhǎng)期 潛伏。到目前為止尚未能找到徹底防治棉花黃萎病的辦法。利用棉花抗黃萎病品種進(jìn)行 黃萎病的防治由于受到育種周期長(zhǎng)和抗黃萎病資源匱乏等因素的限制而未能廣泛應(yīng)用。因 此，利用基因工程技術(shù)分離植物抗黃萎病相關(guān)基因并通過遺傳轉(zhuǎn)化培育抗黃萎病新品種， 是目前棉花抗黃萎病遺傳改良的一個(gè)重要方向。目前，已從棉花上克隆了一些抗病相關(guān)基因，這些基因的克隆為棉花抗病基因工 程的研究奠定了良好的理論基礎(chǔ)。最近，Parkhi等將NPRl基因?qū)朊藁ê?，轉(zhuǎn)基因植株表 現(xiàn)為一種廣譜性抗病，不僅可以抗多種真菌病害，還同時(shí)對(duì)線蟲病害有一定的抗性。盡管前 人從棉花中克隆了大量與抗病相關(guān)的基因，但有關(guān)棉花抗黃萎病基因(Ve)的克隆及功能 分析尚無報(bào)道。番茄、馬鈴薯等作物是大麗輪枝菌侵害的主要對(duì)象，近年來其在抗黃萎 病基因克隆方面取得了突破進(jìn)展。Kawchuk等用圖位克隆技術(shù)從番茄(Solanum lycopersicum “VFN8”)基因組文庫(kù)中成功分離了 2個(gè)大麗輪枝菌抗性基因Vel和Ve2， 且Ve賦予了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對(duì)強(qiáng)致病力黑白輪枝菌(Verticillium albo-atrum Reinke和 Berth)較強(qiáng)的抗性。Chai等依據(jù)Vel和Ve2基因的部分保守域設(shè)計(jì)引物，采用同源克隆法 從Solanum licopersicoides分離了 SlVel基因，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)SlVel的馬鈴薯提高了其抗黑 白輪枝菌的能力。以上結(jié)果表明Ve基因具有介導(dǎo)跨物種抗黃萎病的能力，并不嚴(yán)格受小種 特異性的限制，即具有多效性。Fei等利用RACE技術(shù)從水茄(S. torvum Swartz)中克隆了 全長(zhǎng)3640bp的StVe基因；生物信息學(xué)分析顯示，StVe與Vel和Ve2在核酸水平具有較高同 源性，編碼的是一個(gè)富含亮氨酸(15. 89% )LRRs型跨膜細(xì)胞表面受體類蛋白，暗示了 StVe 可能具有抗黃萎病功能。Shi等從水茄(Solanum torvun)中分離StVe基因，并表明該基 因與抗黃萎病抗性有一定相關(guān)性。最近，Vining K等從長(zhǎng)葉薄荷中(mentha longifolia) 分離到與Ve基因同源的mVel基因，并認(rèn)為該基因在薄荷黃萎病抗性方面起著重要作用。 Emilie F.等將番茄Vel與Ve2基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將其導(dǎo)入番茄作物，結(jié)果表明Ve 基因在番茄中超量表達(dá)，顯著提高了番茄黃萎病抗性。綜上所述，Ve基因在植物抗黃萎病 方面具有顯著的作用，應(yīng)是一個(gè)理想的棉花轉(zhuǎn)基因抗黃萎病育種候選基因。目前關(guān)于棉花抗黃萎病基因的研究工作已經(jīng)展開，篩選出的用于轉(zhuǎn)化的基因大部 分是具有廣譜抗性的抗真菌基因，而對(duì)黃萎病病菌?？沟幕蚝苌?，尤其是還未見有關(guān)棉 花中大麗輪枝菌抗性基因Ve的相關(guān)報(bào)道。因此，從高抗黃萎病的海島棉品種中克隆與抗黃萎病相關(guān)的關(guān)鍵基因(Ve)，研究其表達(dá)調(diào)控機(jī)制及功能，為獲得高抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花提 供新的基因資源，進(jìn)而為培育高抗黃萎病棉花新品種奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種棉花GbVe基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供上述棉花GbVe基因在植物抗黃萎病中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種棉花GbVe基因編碼的蛋白，其具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功 能的氨基酸序列。例如在非活性區(qū)段，將第297位的谷氨酰胺(Gln)替換為脯氨酸(Pro)， 或是將第597位的蘇氨酸(Thr)缺失，或是在837位添加蘇氨酸(Thr)均不會(huì)影響蛋白的 功能。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供含有棉花GbVe基因的載體及含有該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供含有棉花GbVe基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供棉花GbVe基因在植物抗黃萎病中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述植物為 擬南芥。具體地，本發(fā)明是從高抗黃萎病菌的海島棉品種中克隆得到與抗黃萎病相關(guān)的基 因Ve，根據(jù)染色體步移技術(shù)，將擴(kuò)增得到的5’端的GbVe基因片段和3’端的GbVe基因片段 拼接，然后根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)合成可擴(kuò)增全長(zhǎng)GbVe基因的引物，采用RT-PCR技術(shù)經(jīng)過常規(guī) 克隆測(cè)序方法獲得了全長(zhǎng)GbVe基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)本發(fā)明提供了棉花GbVe基因及其編碼的蛋白，其核苷酸序列和氨基酸序列分 別如 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。(2)利用本發(fā)明提供的GbVe基因獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥的黃萎病抗性顯著提高。(3)本發(fā)明克隆得到的GbVe基因不僅有助于揭示棉花與黃萎病菌之間相互作用 的分子機(jī)制，為植物的抗黃萎病代謝途徑的研究提供重要理論基礎(chǔ)，也為植物基因工程領(lǐng) 域進(jìn)行植物遺傳性狀的改良提供了更有價(jià)值的候選功能基因。


圖1為本發(fā)明棉花GbVe基因的cDNA全長(zhǎng)序列PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果，其中M 為DL 5000Marker, 1為目的片段。圖2為本發(fā)明載體pCamGbVe的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為本發(fā)明pCamGbVe質(zhì)粒雙酶切結(jié)果示意圖，其中M為DL12000 DNA Marker, 1禾口 2為BamHI和KpnI雙酶切質(zhì)粒pCamGbVe的產(chǎn)物。圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)GbVe基因擬南芥的PCR檢測(cè)結(jié)果，其中M為DL2000 DNA Marker, 1 為水對(duì)照，2為非轉(zhuǎn)基因擬南芥陰性對(duì)照，3為GbVe-EST陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增結(jié)果，4_14為轉(zhuǎn)GbVe 基因擬南芥。圖5為本發(fā)明轉(zhuǎn)GbVe基因擬南芥的Southern檢測(cè)結(jié)果，其中M為DNA Marker，P 為陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照；WT為陰性質(zhì)粒對(duì)照；L3-L5為轉(zhuǎn)GbVe基因擬南芥株系。
圖6為本發(fā)明轉(zhuǎn)GbVe基因擬南芥的Northern檢測(cè)結(jié)果，其中WT為陰性質(zhì)粒對(duì)照； L3-L5為轉(zhuǎn)GbVe基因擬南芥株系。圖7示例本發(fā)明轉(zhuǎn)GbVe基因擬南芥對(duì)大麗輪枝菌的抑制作用。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1棉花GbVe基因的克隆包括步驟l)GbVe基因中間片段的擴(kuò)增；2)GbVe基因的3'染色體步移擴(kuò)增；3)GbVe基因的5'染色體步移擴(kuò)增；
4) GbVe基因全序列的gDNA和cDNA擴(kuò)增。具體地，步驟1)選用天根生化公司提供的植物基因組DNA試劑盒(Plant Genomic DNA Kit)和植物基因組DNA提取試劑盒，從抗黃萎病的海島棉“Pima 90-53”的棉花幼嫩 葉片和根部組織分別提取出gDNA和總RNA，純化后用于隨后的染色體步移擴(kuò)增和cDNA合 成，具體方法如下根據(jù)GenBank上公布的番茄Ve基因序列，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)， 根據(jù)比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物上游引物5‘ -GGAGTATCCCTGAGTCGATATGCA-3‘；下游引物 5 ‘ -CACTTCTGGTATTGGCCC-3 ‘。以純化后的 gDNA 為模板，取 1 μ LgDNA 進(jìn)行 Touch Down PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序及條件為溫度95°C，時(shí)間5分鐘；溫度95°C，時(shí)間45秒，溫度62°C，時(shí) 間45秒，溫度72°C，時(shí)間1分鐘，5個(gè)循環(huán)；溫度95°C，時(shí)間45秒，溫度60°C、時(shí)間45秒，溫 度72°C，時(shí)間1分鐘，5個(gè)循環(huán)；溫度94°C，時(shí)間45秒，溫度58 °C，時(shí)間45秒，溫度72°C，時(shí) 間1分鐘，5個(gè)循環(huán)；溫度72°C，時(shí)間10分鐘，4°C保存；的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn) 物，PCR產(chǎn)物通過T4DNA連接酶連接到質(zhì)粒pGEM-T載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，然后涂 布到具有氨芐青霉素的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)直至菌落長(zhǎng)出，隨機(jī)挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn) 行測(cè)序，序列分析獲得GbVe基因的中間部分基因序列。步驟2)選用TaKaRa公司提供的染色體步移試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作； 根據(jù)步驟1)中GbVe基因中間片段的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)合成三條上游特異引物，3' SPl 5 ‘ -GGAGTATCCCTGAGTCGATATGCA-3 ‘ ,3 ‘ SP2 5 ‘ -GTCTAATAATTCCCTGAGCGGGTC-3 ‘， 3' SP3 5' -CGTGCATTGTTCAGAGAGGAGCC-3 ‘，用試劑盒提供的簡(jiǎn)并引物 AP Primer 為下 游引物，以純化的gDNA為模板進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增。第1輪PCR采用特異性引物3' SPl與 試劑盒中提供的簡(jiǎn)并引物AP Primer分別進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)。第1輪反應(yīng)程序及條件 為94"C Imin98 "C Imin940C 30s, 650C lmin，72°C 2min，5 個(gè)循環(huán)94°C 30s, 25°C 3min,72°C 2min94°C 30s, 65°C lmin, 72°C 2min、
94°C 30s, 65°C lmin, 72°C 2min [ 15個(gè)循環(huán)
94°C 30s, 44°C lmin, 72°C 2min」72 °C 10min，4°C 保存第2輪PCR反應(yīng)以第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍為模板，采用特異性引物3‘ SP2與 試劑盒中提供的簡(jiǎn)并引物AP Primer分別進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)。第2輪反應(yīng)程序及條件
為
94 °C30s,65 °Clmin,72 0C2 min、94 °C30s,65 °Clmin,72 °C2 min94 °C30s,44 °Clmin,72 0C2 min ^72 "C 10min，4°C 保存第3輪PCR反應(yīng)以第2輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍為模板，采用特異性引物3‘ SP3與 試劑盒中提供的簡(jiǎn)并引物AP Primer分別進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)。第3輪反應(yīng)程序及條件 同第2輪反應(yīng)程序及條件。的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收條帶特異清晰的PCR 產(chǎn)物按上述方法克隆到質(zhì)粒PGEM-T載體上，隨機(jī)挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，序列分析獲 得GbVe基因的3'端基因序列。步驟3)選用TaKaRa公司提供的染色體步移試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作； 根據(jù)步驟1)中GbVe基因中間片段的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)合成三條上游特異引物，5' SPl 5' -GGAGGTAAACACCGTTAGGA-3‘ ,5' SP2 5' -ATTGCCTTCCAGGTCGACAAGCA-3‘ ,5' SP3 5 ‘ -CAGGAATAGACCCGCTCAGGGAA-3 ‘，用試劑盒提供的簡(jiǎn)并引物AP Pr imer為下游引物，以 純化的gDNA為模板進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增。第1輪PCR采用特異性引物5' SPl與試劑盒中提 供的簡(jiǎn)并引物APPrimer分別進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)。第1輪反應(yīng)程序及條件為94"C Imin98 "C Imin940C 30s, 650C lmin，72°C 2min，5 個(gè)循環(huán)94°C 30s, 25°C 3min,72°C 2min
94°C 30s, 650C lmin, 72°C 94°C 30s, 65°C lmin, 72°C
94°C 30s, 440C lmin, 72°C72 °C 10min，4°C 保存第2輪PCR反應(yīng)以第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍為模板，采用特異性引物5' SP2與 試劑盒中提供的簡(jiǎn)并引物AP Primer分別進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)。第2輪反應(yīng)程序及條件
為
2min、
2min > 15個(gè)循環(huán) 2min J 72 °C 10min，4°C 保存第3輪PCR反應(yīng)以第2輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍為模板，采用特異性引物5‘ SP3與 試劑盒中提供的簡(jiǎn)并引物AP Primer分別進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)。第3輪反應(yīng)程序及條件 同第2輪反應(yīng)程序及條件。的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收條帶特異清晰的PCR 產(chǎn)物按上述方法克隆到質(zhì)粒PGEM-T載體上，隨機(jī)挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，序列分析獲 得GbVe基因的5'端基因序列。根據(jù)中間片段、5'染色體步移、3'染色體步移的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，設(shè)計(jì)合 成一對(duì)特異的引物，擴(kuò)增全長(zhǎng)的GbVe基因，5'端GbVeF 5' -CTGGGATCCACCAATGATGATTTC ACC-3 ‘，3 ‘端引物 GbVeR 5 ‘ -CCTGGTACCCTAAGGAGAAAAGGGAGGAG-3 ‘；以純化的 gDNA 為 模板，選用LATaq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序及條件為溫度94°C，時(shí)間5分鐘；溫度94°C， 時(shí)間45秒，溫度55 °C，時(shí)間45秒，溫度72 °C，時(shí)間3. 5分鐘，30個(gè)循環(huán)；溫度72 °C，時(shí)間10 分鐘；1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物按上述方法克隆到PMD19-T載體上，隨 機(jī)挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得GbVe基因的gDNA全長(zhǎng)序列，所得到的重組質(zhì)粒命名為 pMDGbVe。以提取的總RNA為模板，按照Takara公司提供的M-MLV試劑說明書合成cDNA第 一鏈，取1 μ L cDNA為模板，分別以GbVeF和GbVeR為上、下游引物，選用LATaq酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序及條件為溫度94°C，時(shí)間5分鐘；溫度94°C，時(shí)間45秒，溫度55°C，時(shí)間45 秒，溫度72°C，時(shí)間3. 5分鐘，30個(gè)循環(huán)；溫度72°C，時(shí)間10分鐘；的瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)PCR產(chǎn)物(圖1)，PCR產(chǎn)物按上述方法克隆到質(zhì)粒PMD19-T載體上，隨機(jī)挑取3個(gè)克隆進(jìn) 行測(cè)序，序列分析獲得GbVe基因的cDNA全長(zhǎng)序列。實(shí)施例2棉花GbVe基因編碼蛋白的氨基酸序列的同源性分析將棉花GbVe基因編碼蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn) 行blast對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)它與多種植物體內(nèi)的應(yīng)答病原菌侵染重要的受體類抗病基因 (LRR-TM)均有一定相似度，但同源性較低。GbVe基因與StVe和SlVe2的一致性不到55%， 但它們同屬于植物應(yīng)答病原菌侵染重要的受體類抗病基因(LRR-TM)，含有信號(hào)肽、跨膜域、 LRR重復(fù)單元、N端成熟區(qū)等保守結(jié)構(gòu)域。利用DNAman分析軟件將分離克隆的GbVe基因 與GenBank上的植物應(yīng)答病原菌侵染重要的受體類抗病基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行比 對(duì)分析，結(jié)果如表 1 所示，分別為 SIVe，AY262015 ；Vel, AF272366 ；SlVe2, AY282579 ；Ve2, AF365929 ；StVe, AY311527 ；Cf-2. 2，U42445 ；Cf5, AF053993 ；HcrVf1, AJ297739 ；HcrVf2, AJ297740 ；HcrVf3, AJ297741 ；LeEiXl, AY359965 ；LeEiX2, AY359966。結(jié)果表明本發(fā)明獲得 的GbVe基因與以往的報(bào)道的植物應(yīng)答病原菌侵染重要的受體類抗病基因序列具有明顯的 差異，證明該基因是一個(gè)新的抗大麗輪枝菌基因，且在棉花上為首次克隆。表1 GbVe基因與植物應(yīng)答病原菌侵染重要的受體類抗病基因的氨基酸序列同源 性比較(％) 實(shí)施例3棉花GbVe基因在提高擬南芥黃萎病抗性中的應(yīng)用1、棉花GbVe基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化將上述已構(gòu)建好的pMDGbVe和真核基因表達(dá)啟動(dòng)子35s和終止子構(gòu)建成融合表達(dá) 基因，連接在雙元表達(dá)載體pCambial300(市售商品)的EcoRI/Hindlll酶切位點(diǎn)(結(jié)構(gòu)如 圖2所示)，得到重組質(zhì)粒pCamGbVe，經(jīng)BamHI和KpnI雙酶切鑒定結(jié)果顯示為兩條目的片 段(圖3)，表明GbVe基因以正確的閱讀框架插入到pCambia1300中。將pCamGbVe轉(zhuǎn)化到 農(nóng)桿菌GV3101中。按照侵染擬南芥花絮的方法轉(zhuǎn)化擬南芥獲得抗潮霉素(hptll)的轉(zhuǎn)基 因植株。2、轉(zhuǎn)GbVe基因植株的PCR檢測(cè)剪取轉(zhuǎn)GbVe基因植株和非轉(zhuǎn)GbVe基因植株的幼嫩葉片，采用CTAB法提取基因 組DNA，在室溫干燥后用適量無菌雙重蒸餾水懸浮，-20°C保存。提取的DNA模板量調(diào)整為 50ng/y L，取 1 μ L 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，94°C，5min ；94 °C, 45S, 55 °C, 45S, 72 °C, 30min, 30 個(gè)循環(huán)；72°C，10min。1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果表明獲得了 GbVe基因整合 到擬南芥植物基因組的轉(zhuǎn)基因植株(圖4)。3、轉(zhuǎn)GbVe基因擬南芥的Southern檢測(cè)剪取轉(zhuǎn)GbVe基因植株和非轉(zhuǎn)GbVe基因植株的幼嫩葉片，采用CTAB法提取基因 組DNA，在室溫干燥后用適量無菌雙重蒸餾水懸浮并純化，-20°C保存。用KpnI分別酶切 轉(zhuǎn)GbVe基因植株和非轉(zhuǎn)GbVe基因植株的gDNA，每個(gè)樣品酶切30 μ g，以GbVe基因的一 段長(zhǎng)約530bp的EST為探針，按照地高辛DNA標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒(DIG DNA Labeling and Detection Kitl，Roche，德國(guó))的說明書進(jìn)行操作。結(jié)果表明GbVe基因在檢測(cè)的三個(gè)株系 中以單拷貝整合到擬南芥基因組中(圖5)。
4、轉(zhuǎn)GbVe基因擬南芥的Northern檢測(cè)剪取轉(zhuǎn)GbVe基因植株和非轉(zhuǎn)GbVe基因植株的幼嫩葉片，采用植物RNA試劑盒 (Tiangen，中國(guó))提取總RNA。每個(gè)樣品取30 μ g在1 %的甲酰胺變性瓊脂糖凝膠上電泳， 以GbVe基因的一段長(zhǎng)約530bp的EST為探針，按照地高辛DNA標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒(DIG DNA Labeling and Detection Kitl，Roche，德國(guó))的說明書進(jìn)行操作。結(jié)果表明GbVe基因在 檢測(cè)的三個(gè)株系高效表達(dá)(圖6)。5、轉(zhuǎn)GbVe基因擬南芥的黃萎病抗性鑒定大麗輪枝菌為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳育種分子研究室保存的強(qiáng)致病力菌系，將該 病菌在PDA培養(yǎng)基上活化7-10天，并轉(zhuǎn)接到液體查彼克培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)10-14天，接菌 時(shí)在顯微鏡下借助血球計(jì)數(shù)板將懸浮孢子液濃度調(diào)至5X 107cfu/mL。擬南芥種子經(jīng)春化4 天，播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，22°C，光照16h/黑暗8h，濕度60-70%，培養(yǎng)四周。小心拔出幼苗，用 滅菌水沖洗根部，將處理好的幼苗根部浸入20mL的孢子懸浮液(5 X 107CfU/mL) 1分鐘，每 處理一個(gè)株系更換一次新的孢子懸浮液，對(duì)照按同樣方法接滅菌水。接種后將幼苗迅速移 栽回營(yíng)養(yǎng)缽并保持高濕2天。定期觀察對(duì)照株系與轉(zhuǎn)基因株系的表型變化。結(jié)果顯示(圖7)，在接種大麗輪枝菌后，野生型擬南芥表現(xiàn)出葉片嚴(yán)重黃化甚至 干枯(圖7-E、F、G)，株高嚴(yán)重矮化(圖7-1)，長(zhǎng)勢(shì)弱小，維管束褐變程度高(圖7-H)等癥 狀；而轉(zhuǎn)基因擬南芥出現(xiàn)輕微的葉片黃化(圖7-A、B、C)，株高較對(duì)照減少不明顯(圖7-1)， 生長(zhǎng)健壯，維管束無明顯褐變現(xiàn)象(圖7-H)。說明GbVe基因可以明顯抑制大麗輪枝菌的繁 殖，顯著提高植株的黃萎病抗性。本發(fā)明屬于新基因的制備，特別是指抗黃萎病基因GbVe及其制備以及利用其編 碼的蛋白。包括以 5'端 5' -CTGGGATCCACCAATGATGATTTCACC-3‘和 3'端 5' -CCTGGTAC CCTAAGGAGAAAAGGGAGGAG-3 ‘為特異引物，以棉花根部cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增方法獲得 抗黃萎病基因GbVe，并應(yīng)用其編碼了對(duì)大麗輪枝菌具有顯著抑制作用的蛋白。本發(fā)明為抗 黃萎病基因工程提供了新的重要候選基因，利用本發(fā)明獲得了全長(zhǎng)的GbVe基因及其構(gòu)建 的植物表達(dá)載體，可為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到重要作物提高轉(zhuǎn)基因植物的黃萎病抗性奠定基礎(chǔ)，具 有極大的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用價(jià)值。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
棉花GbVe基因編碼的蛋白，其特征在于，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的宿主細(xì)胞。
6.含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
7.權(quán)利要求2或3所述的基因在植物抗黃萎病中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述的植物為擬南芥。全文摘要
本發(fā)明涉及棉花GbVe基因及其編碼蛋白，其是從高抗黃萎病的海島棉品種中克隆得到與抗黃萎病相關(guān)的Ve基因，根據(jù)染色體步移技術(shù)，將擴(kuò)增得到的5’端的GbVe基因片段和3’端的GbVe基因片段拼接，然后根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)合成可擴(kuò)增全長(zhǎng)GbVe基因的引物，采用RT-PCR技術(shù)經(jīng)過常規(guī)克隆測(cè)序方法獲得了全長(zhǎng)GbVe基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明為植物抗黃萎病基因工程提供了新的重要候選基因，利用本發(fā)明獲得的全長(zhǎng)GbVe基因及其構(gòu)建的植物表達(dá)載體，可為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化重要作物以提高轉(zhuǎn)基因作物的黃萎病抗性奠定基礎(chǔ)，具有極大的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101928338SQ201010275300
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者吳立強(qiáng), 張桂寅, 張艷, 李志坤, 楊碩, 王省芬, 馬峙英 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)