一種用于分子標(biāo)記輔助育種檢測棉花植株對黃萎病抗性的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測棉花植株對黃萎病抗性的方法，該方法包括：（1）將待測棉花植株的種子用浸種液浸泡；（2）將浸泡后的種子種植于病圃中；（3）選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；（4）分別使用第一引物對和第二引物對初篩棉花植株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物；第一引物對如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示，第二引物對如SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示；如果第一擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ?ID?NO:5所示的核酸且第二擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ?ID?NO:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為抗黃萎病植株。本發(fā)明對黃萎病菌的抗性進(jìn)行預(yù)測和篩選，淘汰病圃篩選過程中雖不發(fā)病但仍為感病的植株，減少人力物力的浪費(fèi)，提高育種效率。
【專利說明】一種用于分子標(biāo)記輔助育種檢測棉花植株對黃萎病抗性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種檢測棉花植株對黃萎病抗性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]棉花黃萎病是世界性的重大植物病害，常年給棉花生產(chǎn)造成10-15%的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重年份超過全國植棉面積的60%，給棉花生產(chǎn)造成沉重打擊。其病原菌隨種子、殘枝敗葉和土壤傳播，菌核在土壤中可存活多年，化學(xué)藥物、耕作栽培等手段對其無效，被植物病理界稱為棉花的“癌癥”，成為長期以來懸而未決的世界性難題。培育抗病品種被公認(rèn)為是解決棉花黃萎病最經(jīng)濟(jì)有效的手段，究其一直未能成功的原因是棉花黃萎病的抗性受多個(gè)主效基因共同控制的多基因控制遺傳模式，遺傳機(jī)制較為復(fù)雜(祁偉彥，張永軍，張?zhí)煺?，陳捷胤，戴小?基于人工病圃篩選和分子標(biāo)記輔助的棉花抗黃萎病育種方法研究與應(yīng)用.分子植物育種，2012，10(5):607-612;蔣鋒，趙君，周雷，郭旺珍， 張?zhí)煺?陸地棉抗黃萎病基因的分子標(biāo)記定位.中國科學(xué)，2009，39(9):849-861;葛海燕，汪業(yè)春，郭旺珍，張?zhí)煺?陸地棉抗黃萎病性狀的遺傳及分子標(biāo)記研究.棉花學(xué)報(bào)，2008, 20(I):19-22;Jiang F，Zhao J, Zhou L, Guo WZ, Zhang TZ.Molecular mapping of Verticillium wilt resistance QTL on chromosomes D7and D9in upland cotton.Science China SerC-Life Science, 2009，52 (9):872-884;楊扼，郭旺珍，張?zhí)煺?陸地棉抗黃萎病、纖維品質(zhì)和產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀的QTL定位.分子植物育種，2007,5(6):797-805)， 缺乏有效的可用于穩(wěn)定篩選和準(zhǔn)確跟蹤其抗性基因的分子標(biāo)記，鑒定十分困難，導(dǎo)致棉花抗黃萎病育種進(jìn)展緩慢。 [0003]早在20世紀(jì)40年代我國就開始棉花育種，50年代后開展雜交育種，當(dāng)時(shí)棉田病害輕，基本上根據(jù)產(chǎn)量表現(xiàn)選育品種。70年代后棉花枯萎病的發(fā)生逐漸加重，開始了抗枯萎病育種，但育種技術(shù)基本上采用自然感病試驗(yàn)田進(jìn)行抗病性鑒定，由于病原菌不足，田間發(fā)病不均勻，年份間差異大，育種親本和雜交后代材料鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確，材料當(dāng)選或淘汰盲目性較大。90年代后黃萎病發(fā)生漸趨嚴(yán)重，迫切需要培育抗黃萎病品種，但抗病性鑒定與選育仍然采用與抗枯萎病類似的方法，育種效率低，后代材料選擇不準(zhǔn)確，育成品種抗病性差，且抗病品種產(chǎn)量較低。
[0004]棉花抗黃萎病分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)已經(jīng)在纖維品種改良、不育系改良等得到應(yīng)用，但在抗黃萎病品種選育上由于缺乏穩(wěn)定可靠、緊密連鎖的分子標(biāo)記，尚未應(yīng)用與生產(chǎn)實(shí)際。雷蒙德氏棉是對黃萎病高抗的野生棉種，也是栽培棉種陸地棉和海島棉的D染色體組的共同祖先，通過對雷蒙德氏棉基因組抗病基因的分析及其SSR標(biāo)記的系統(tǒng)開發(fā)，可以獲得在栽培棉種中穩(wěn)定遺傳的抗黃萎病基因簇及其連鎖的SSR標(biāo)記，進(jìn)而對棉花育種過程中不同的材料、品系、品種進(jìn)行早期世代篩選，淘汰不抗病的植株，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高育種和選擇效率，由此建立高效準(zhǔn)確的棉花抗黃萎病選育技術(shù)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的方法，該方法包括:
[0007](I)將待測棉花植株的種子用浸種液浸泡；所述浸種液是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用水浸泡，過濾得到的菌懸液；
[0008](2)將浸泡后的種子種植于病圃中；所述病圃是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎摻入土壤之后構(gòu)建的；
[0009](3)選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；
[0010](4)分別使用第一引物對和第二引物對初篩棉花植株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物；第一引物對如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，第二引物對如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示；
[0011]如果第一擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID N0:5所示的核酸且第二擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為抗黃萎病植株。
[0012]通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)對棉花植株對黃萎病菌抗性進(jìn)行方便、快速地檢測。
[0013]本發(fā)明的其他 特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]附圖是用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的【具體實(shí)施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0015]圖1是品種名稱海島棉7124和軍棉I號的棉花植株的第一擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
[0016]圖2是品種名稱海島棉7124和軍棉I號的棉花植株的第二擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
[0017]圖3是12個(gè)初篩棉花植株的第一擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
[0018]圖4是12個(gè)初篩棉花植株的第二擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0020]本發(fā)明提供了一種檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的方法，該方法包括:
[0021](I)將待測棉花植株的種子用浸種液浸泡；所述浸種液是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用水浸泡，過濾得到的菌懸液；
[0022](2)將浸泡后的種子種植于病圃中；所述病圃是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎摻入土壤之后構(gòu)建的；
[0023](3)選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；
[0024](4)分別使用第一引物對和第二引物對初篩棉花植株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物；第一引物對如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，第二引物對如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示；[0025]如果第一擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID N0:5所示的核酸且第二擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為抗黃萎病植株。
[0026]其中，如果第一擴(kuò)增產(chǎn)物中不具有SEQ ID NO: 5所示的核酸或者第二擴(kuò)增產(chǎn)物中不具有SEQ ID N0:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為感黃萎病植株。
[0027]其中，所述PCR擴(kuò)增的條件可以包括:變性溫度為93.5-94.5°C ;退火溫度為 54.5-55.5。。。
[0028]其中，所述PCR擴(kuò)增的條件還可以包括:PCR循環(huán)數(shù)為28-32輪。
[0029]其中，制備浸種液時(shí)，相對于每重量份的死于黃萎病的棉花植株的組織，水的用量可以為5重量份。
[0030]其中，用浸種液浸泡種子時(shí)，相對于每重量份的種子，浸種液的用量可以為2重量份。
[0031]其中，用浸種液浸泡種子的時(shí)間可以為6小時(shí)。
[0032]其中，構(gòu)建病圃時(shí)，相對于每平方米的土壤，死于黃萎病的棉花植株的組織的摻入量可以為3kg。
[0033]其中，待測棉花植株的基因組DNA可以通過常規(guī)的DNA提取方法從待測棉花植株中提取得到。
[0034]本發(fā)明可通過檢測分子標(biāo)記對棉花植株對黃萎病菌的抗性進(jìn)行預(yù)測和篩選，淘汰病圃篩選過程中雖不發(fā)病但仍為感病的植株，減少人力物力的浪費(fèi)，提高育種效率。
[0035]以下將通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0036]實(shí)施例1
[0037]I)收集31種棉種材`料，按照文獻(xiàn)(張興華，棉花抗枯、黃萎病研究進(jìn)展及其抗性鑒定方法，江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，20(3):43-49)中的人工苗床病圃法，鑒定它們的抗病性，結(jié)果如表1中所列，其中，抗病種質(zhì)3份，在表1的抗黃萎病材料一欄表示為“R”；感病種質(zhì)28 份，在表1的感黃萎病材料一欄表不為“S”。
[0038](2)按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法，分離每份種質(zhì)的基因組DNA。
[0039]以每份種質(zhì)的基因組DNA為模板，采用正向引物如SEQ ID NO:1所示(5' -AAACAA TMTAAACGAGTTGAATTA-3')且反向引物如SEQ ID NO:2所示(5' -TTGTTTCATAATTTTAAAGTA TGTA-3')的第一引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，變性溫度為94°C ;退火溫度為55°C:PCR循環(huán)數(shù)為 30輪；分別得到每份材料的第一擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0040]以每份種質(zhì)的基因組DNA為模板，采用正向引物如SEQ ID N0:3所示(5' -AAGGGT AAGTAATAAATCATAGMC-3')且反向引物如SEQ ID N0:4所示(5' -GCATTTATCCATTTCTTTACT TTTC-3')的第二引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，變性溫度為94°C ;退火溫度為55°C:PCR循環(huán)數(shù)為 30輪；分別得到每份材料的第二擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0041](3)按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法，將步驟(2)中的第一擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測；圖1是品種名稱海島棉7124和軍棉I號的棉花植株的第一擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；與海島棉7124帶型一致的在表1的分子標(biāo)記檢測結(jié)果一欄中表示為“ + ” ；與軍棉I號帶型一致的在表1的分子標(biāo)記檢測結(jié)果一欄中表示為在海島棉7124的電泳圖中(圖1左泳道)，自上而下第3條帶的大小為185bp，經(jīng)測序的序列為SEQ ID NO: 5(AAAC AATMTAAACGAGTTGAATTAAAATGCTTTTGTAATTAMTGGGCATAAAAAGATAGACATTTTGCGAATCAACAAGACCATAAAATATATGAMATTTTMTATATATATATATGTATGTGTATGTACATAAAATATGAAAMAATATGTAGGTA TACATACTTTAAAATTATGAAACAA)，是相對于軍棉I號的差異條帶。
[0042]按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法，將步驟(2)中的第二擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測；圖2是品種名稱海島棉7124和軍棉I號的棉花植株的第二擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；與海島棉7124帶型一致的在表1的分子標(biāo)記檢測結(jié)果一欄中表示為“ + ” ；與軍棉 I號帶型一致的在表1的分子標(biāo)記檢測結(jié)果一欄中表示為在海島棉7124的電泳圖中 (圖2左泳道)，自上而下第I條帶的大小為249bp，經(jīng)測序的序列為SEQ ID N0:6(5’_AAGGG TAAGTAATAMTCATAGAACACAATAATAATGACGTAATTATAATAATAATCACCAAATAATAATAACAATGACCATA TTAATTACTATTCTAATACTAAAAATATAAAAATGAATTMACACTMTAAAAATGATAATAATAAAATAATAATAAT AGTGATAATAATAATGAAATGTATAAATAAAGGAATAAATAACAATATAAATTCTAAACACAAGAAAAGTAAAGAAA TGGATAAATGC-3’)，是相對于軍棉I號的差異條帶。
[0043]表1
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測棉花植株對黃萎病抗性的方法，其特征在于，該方法包括:(1)將待測棉花植株的種子用浸種液浸泡；所述浸種液是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用水浸泡，過濾得到的菌懸液；(2)將浸泡后的種子種植于病圃中；所述病圃是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎摻入土壤之后構(gòu)建的；(3)選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；(4)分別使用第一引物對和第二引物對初篩棉花植株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物；第一引物對如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，第二引物對如 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4 所示；如果第一擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID N0:5所示的核酸且第二擴(kuò)增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為抗黃萎病植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述PCR擴(kuò)增的條件包括:變性溫度為 93.5-94.50C ;退火溫度為 54.5-55.5°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述PCR擴(kuò)增的條件還包括:PCR循環(huán)數(shù)為28-32輪。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，制備浸種液時(shí)，相對于每重量份的死于黃萎病的棉花植株的組織，水的用量為5重量份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中，用浸種液浸泡種子時(shí)，相對于每重量份的種子，浸種液的用量為2重量份。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，用浸種液浸泡種子的時(shí)間為6小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的方法，其中，構(gòu)建病圃時(shí)，相對于每平方米的土壤，死于黃萎病的棉花植株的組織的摻入量為3kg。
【文檔編號】C12Q1/68GK103602743SQ201310588981
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】戴小楓, 陳捷胤, 李蕾, 馬雪峰, 桂月晶, 孔志強(qiáng), 包郁明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所