專利名稱：含gcc盒的誘導(dǎo)型啟動子及構(gòu)建和在基因工程上的應(yīng)用的制作方法
含GCC盒的誘導(dǎo)型啟動子及構(gòu)建和在基因工程上的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)型啟動子及構(gòu)建和在基因工程上的應(yīng)用，更具體地涉及了一種含 GCC盒的誘導(dǎo)型啟動子在單子葉植物水稻抗病蟲基因工程中的應(yīng)用，屬于植物基因工程技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
真菌、細(xì)菌、病毒等病原微生物的侵染常造成各種農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降。培育和推 廣抗病品種是防治作物病害、保證作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)最安全有效的途徑。利用植物自身抗病基 因，通過常規(guī)育種和分子標(biāo)記輔助育種方法已培育了許多抗病新品種。然而，抗性基因在種 屬間利用具有一定的局限性。轉(zhuǎn)基因方法可克服上述局限，為作物抗病育種開辟了一條新 途徑，也是植物種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑之一。目前，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中所使用的啟動子大多數(shù)為 組成型啟動子，如果使用植物組織特異性啟動子或病原誘導(dǎo)的植物啟動子不僅會獲得目的 產(chǎn)物、達(dá)到預(yù)定目標(biāo)，而且也不會產(chǎn)生副作用。植物基因啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)、含有順式作用元件的DNA序列，決 定著下游基因轉(zhuǎn)錄的特異性、方向和效率，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。高等植物啟動子區(qū)域存在各 種特征元件，包括轉(zhuǎn)錄起始位點、TATA盒、起始因子和不同的順式作用元件等。其中，TATA 框是依賴于RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄所必需的，決定著轉(zhuǎn)錄起始，并調(diào)控著上游激活蛋白的行為； 起始因子的功能與TATA盒相似，可影響轉(zhuǎn)錄的方向和起始點的定位，但一般不能改變啟動 子內(nèi)包含2個核心序列因子的TATA活性。植物的許多性狀與啟動子的結(jié)構(gòu)及其調(diào)控方式 密切相關(guān)。因此，研究啟動子不僅可以為基因工程提供重要的調(diào)控元件，也可促進(jìn)從遺傳分 子基礎(chǔ)上發(fā)掘具有重要利用價值的植物新資源。根據(jù)植物啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導(dǎo) 型啟動子。組成型啟動子調(diào)控的基因表達(dá)不受時空限制和某種物質(zhì)的誘導(dǎo)而在植物中表達(dá) 出來。雙子葉植物中常用的組成型啟動子花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子是目前植物基 因工程中使用最多的啟動子，它驅(qū)使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生組成型表達(dá)。它是異源病毒型啟動子，在轉(zhuǎn) 基因植物中具有較高的表達(dá)活性。組成型啟動子可應(yīng)用于評價一個基因的生物學(xué)功能、轉(zhuǎn) 基因表達(dá)數(shù)量及其活性，但在改良轉(zhuǎn)基因作物的實際應(yīng)用中的主要問題是(1)組成型啟 動子驅(qū)動的基因在植物各組織中均有不同程度表達(dá)，它驅(qū)動外源基因在植物的各種組織和 所有發(fā)育階段都會表達(dá)，產(chǎn)生大量異源蛋白或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破了植物原有 的代謝平衡，增加了植株的代謝負(fù)擔(dān)，有些產(chǎn)物甚至對植物的生長發(fā)育有毒，造成了物質(zhì)和 能量上的巨大浪費(fèi)，同時還會改變植物的形態(tài)，影響植物正常的生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致死亡； (2)植物所有細(xì)胞可能會全部進(jìn)入防御模式，即使在無病原侵染時仍進(jìn)行抗病反應(yīng)；(3)組 成型啟動子調(diào)控表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物可在人和動物食用的植物組織中積累，但是生物安全性 要求不能有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。如果用組織、器官特異型和病原誘導(dǎo)型啟動子取代組成型啟動子，使外源基因能 夠定時、定點、定量地在植物中表達(dá)，可以克服組成型啟動子帶來的問題。因此，組織特異型啟動子和病原誘導(dǎo)型啟動子的研究與應(yīng)用是植物基因工程的重要內(nèi)容和當(dāng)今國內(nèi)外研究 的熱點。利用啟動子的最好方法可能是利用一個內(nèi)源抗性基因啟動子，這樣既可以減少植 物的代謝負(fù)擔(dān)，又可以避免植物防御反應(yīng)的假性激活。比組成型表達(dá)和組織特異型表達(dá)更理想的表達(dá)模式是，只在需要的時間和地點表 達(dá)而且僅在感染部位啟動抗病相關(guān)基因表達(dá)。病原誘導(dǎo)型啟動子能達(dá)到上述較為理想的結(jié) 果，防止“逃離細(xì)胞死亡”現(xiàn)象出現(xiàn)，消除了對植物生長和發(fā)育影響的副作用。一種理想的 病原誘導(dǎo)型啟動子應(yīng)迅速被廣譜野生型病原侵染所激活，并有廣譜抗病性。然而由于植物 對不同病原菌采取了不同的防御機(jī)制，許多重要植物抗病分子機(jī)制尚不明確，所以，目前分 離的大多數(shù)病原誘導(dǎo)型啟動子很少能滿足上述要求，仍然存在輕微的“逃離細(xì)胞死亡”的現(xiàn) 象。因此，迫切需要分離或人工構(gòu)建理想的病原誘導(dǎo)型啟動子。植物抗病機(jī)制研究、轉(zhuǎn)錄組 學(xué)和啟動子克隆技術(shù)的發(fā)展，為人工構(gòu)建新的病原誘導(dǎo)型啟動子奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)前可使用的病原誘導(dǎo)型啟動子缺乏的主要原因是分離各種天然的病原誘導(dǎo)型 啟動子較少。與天然病原誘導(dǎo)型啟動子相比，人工構(gòu)建病原誘導(dǎo)型啟動子不僅更具有廣譜 性，而且可根據(jù)不同目的進(jìn)行靈活選擇，如消除啟動子表達(dá)元件，可改變啟動子的強(qiáng)度和病 原誘導(dǎo)表達(dá)基因的數(shù)量和質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，啟動子元件在不同植物品種中防御信號是相對 保守的。因此，通過收集各種植物啟動子元件可以人工構(gòu)建病原啟動子。啟動子組件有許多不同的類型，包括病原誘導(dǎo)型作用元件、組織特異型作用元件、 細(xì)胞特異型作用元件和人工組建啟動子所需的最小啟動子區(qū)段。其中病原誘導(dǎo)型作用元件 在抗病方面是最重要的。已知的植物轉(zhuǎn)錄因子家族中有許多在抗病反應(yīng)中起重要作用的成 員，其中包括 WRKYs、ERFs, bZIPs、Mybs、Dofs、bHLHs、ffhirly, SR 和 DBPl 等。這些轉(zhuǎn)錄因 子與I3R基因特異結(jié)合的位點即順式作用元件，對于組建啟動子作用元件是非常有用的。在植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)過程中，順式作用元件通過與轉(zhuǎn)錄因子的互作發(fā) 揮著重要調(diào)控作用環(huán)境刺激經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、傳遞后，激活防衛(wèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與特 異順式作用元件的互作，從而實現(xiàn)相關(guān)防衛(wèi)功能基因的表達(dá)。目前，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高 植物的抗逆性已成為植物基因工程中重要的研究策略。鑒于順式作用元件的上述重要調(diào) 控作用，與早期的組成型表達(dá)的抗性基因的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用相比，使用誘導(dǎo)型啟動子介導(dǎo)的抗 性基因無疑具有多方面的優(yōu)勢，因此鑒定抗性相關(guān)(特別是細(xì)菌性病原相關(guān))誘導(dǎo)型啟動 子已成為目前植物分子生物學(xué)研究的熱點。迄今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種受不同病原誘導(dǎo)的GCC box(AGC-CGCC)和受創(chuàng)傷、部分病原誘導(dǎo)的W box([T]TGAC[C/T]。在防御基因啟動子區(qū)經(jīng) 常還含GCC box，它與調(diào)控茉莉酸、激發(fā)子誘導(dǎo)表達(dá)的JERE元件(AGACCGCC)和調(diào)控真菌誘 導(dǎo)表達(dá)的S box (AGCCACC)相似。GCC盒是一類乙烯應(yīng)答的順式作用元件，存在于眾多ra基 因的啟動子序列中與EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控與抵抗病原菌的侵染有關(guān)基因的表達(dá)， 在植物抗性反應(yīng)和生長發(fā)育中具有重要調(diào)控作用。目前，使用組成型啟動子的基因工程植物中，轉(zhuǎn)入抗病相關(guān)基因的持續(xù)表達(dá)可能 會引起無法控制的防御反應(yīng)，例如“逃離細(xì)胞死亡”。利用轉(zhuǎn)基因的方法來提高作物產(chǎn)量 面臨的另一個主要問題是啟動子引起的背景表達(dá)，帶有開關(guān)并在病原侵染位點能迅速短暫 地誘導(dǎo)抗病基因表達(dá)的啟動子是比較理想的啟動子。另外，內(nèi)源啟動子的分離與利用可以 減少背景表達(dá)，但是某些啟動子的調(diào)控元件通常既調(diào)控病原誘導(dǎo)基因的表達(dá)又調(diào)控背景表 達(dá)，因而，理想的病原誘導(dǎo)特異型啟動子的分離迄今還比較困難。然而，隨著對啟動子作用元件和抗病調(diào)控機(jī)制研究的深入發(fā)展，成功地分離或人工構(gòu)建更理想啟動子的可能性會越 來越大。研究表明，將馬鈴薯、擬南芥、芫荽菜、長春花等雙子葉植物中鑒定的GCC盒與 CaMV35S核心啟動子(-46 +8bp)融合所構(gòu)建成的誘導(dǎo)型啟動子能在煙草、擬南芥等原生 質(zhì)體中瞬間表達(dá)或在轉(zhuǎn)基因植株中被病原菌或誘發(fā)子處理后驅(qū)動^依基因表達(dá)。該結(jié)果 一方面表明GCC盒元件在誘導(dǎo)型防御反應(yīng)中的重要作用，另一方面也說明該順式作用元件 的結(jié)合蛋白及其上游的信號傳導(dǎo)途徑在上述多種雙子葉植物中具有保守性。但是，迄今仍 缺乏在水稻以及單子葉植物中GCC盒等元件應(yīng)答病原菌或激發(fā)子的直接證據(jù)。進(jìn)一步在水 稻中開展GCC盒應(yīng)答病原菌、ET、JA信號的鑒定和應(yīng)用研究，具有十分重要的意義(1)明 確GCC盒介導(dǎo)的信號傳遞途徑在水稻抗病蟲等逆境防御反應(yīng)中的作用；(2)探索GCC元件 在構(gòu)建用于水稻等單子葉植物基因工程的誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)建中的應(yīng)用價值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種含GCC盒的誘導(dǎo)型啟動子及構(gòu)建和在基因工程上的應(yīng)用，將大力促 進(jìn)水稻抗病基因工程的發(fā)展與應(yīng)用。本發(fā)明的含GCC盒的誘導(dǎo)型啟動子，其至少含有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。構(gòu)建方法如下
將雙子葉植物擬南芥中鑒定的應(yīng)答逆境脅迫的GCC盒(其序列為AATCA GAAGCCGCCCCAGAAT)與CaMV35S啟動子核心序列(_46 +8bp)融合，構(gòu)建成誘導(dǎo)型啟動子。 所述CaMV35S啟動子核心序列為TCGACCGCAAGACCC TTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC。本發(fā)明的含GCC盒的誘導(dǎo)型啟動子本底表達(dá)低、應(yīng)答速度快、持續(xù)時間長、表達(dá)強(qiáng) 度適中。將上述的誘導(dǎo)型啟動子與抗病(蟲)等基因結(jié)合，構(gòu)建成轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化水稻，可使獲 得的轉(zhuǎn)基因水稻的外源抗性基因誘導(dǎo)表達(dá)，既發(fā)揮抗性基因在抗病(蟲)中的作用，又可避 免由于抗性基因過量表達(dá)導(dǎo)致的物質(zhì)、能量的浪費(fèi)和抗性基因表達(dá)產(chǎn)物對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞 本身的不利影響。本發(fā)明的顯著優(yōu)點
該啟動子在轉(zhuǎn)基因水稻中可較好地應(yīng)答水稻稻瘟病菌侵染、稻縱卷葉螟取食和機(jī)械損 傷等生物與非生物脅迫。該誘導(dǎo)型啟動子在單子葉植物水稻抗病、蟲基因工程中具有十分 重要的應(yīng)用價值，其轉(zhuǎn)基因植物株系在誘導(dǎo)植物抗病的小分子化合物高通量篩選中也有重 要的應(yīng)用價值。


圖1為瞬間表達(dá)載體ρΒΤΙΟ-GUS的質(zhì)粒圖譜； 圖2為pDN0R-207入門載體； 圖3為pMDC-163目的載體； 圖4為瞬間表達(dá)載體ρΒΤΙΟ-GUS的結(jié)構(gòu)圖5為轉(zhuǎn)基因水稻目的片段的PCR檢測；1 8，為陽性轉(zhuǎn)基因植株；9，為非轉(zhuǎn) 基因植株；10，為陽性對照；M，為Marker 2000 ；圖6為稻瘟病菌侵染Tl代植株5-7天后組織化學(xué)染色的結(jié)果；其中1，表示4天后；2， 表示5天后；3，表示6天后；4，表示7天后；5，表示8天后；CK為陰性對照；
圖7為稻縱卷葉螟取食Tl代植株葉片不同時間段后組織化學(xué)染色的結(jié)果；其中1表示 Ih后組織化學(xué)染色的結(jié)果；2，表示3h后；3，表示5h后；4，表示12h后；
圖8為機(jī)械損傷Tl代植株葉片不同時間段后GUS組織化學(xué)染色的結(jié)果；其中1表示Ih 后GUS組織化學(xué)染色的結(jié)果；2，表示3h后；3，表示5h后；4，表示12h后。
具體實施例方式
1載體構(gòu)建過程和轉(zhuǎn)基因植株的獲得 材料與方法 材料
1. 1. 1. 1菌株和載體大腸桿菌(fecAericAia co7i)DH5 a和DB3. 1 (福建農(nóng)林大學(xué)生 命科學(xué)學(xué)院實驗室保存)；根癌農(nóng)桿菌(^rohcteriws tumefaciems) EEAlOb菌株(福建農(nóng) 林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室保存);pBT10_GUS瞬間表達(dá)載體(見圖1)(由Weisshaar教授惠 贈，Sprenger-Haussels and ffeisshaar, 2000);pDN0R_207 入門載體(見圖 2)和 pMDC-163 目的載體(見圖3)均購自Invitrogen公司。1. 1. 1. 2生化試劑DNA快速回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工 程有限公司，損a/、SacU SpeU PfuTaq酶、rh^酶、T4連接酶和dNTP等購自TaKaRa公司， Gateway載體構(gòu)建試劑盒購自Irwitrogen公司，慶大霉素、卡那霉素、利福平、羧卞青霉素、 潮霉素、X-gluc等為Sigma公司產(chǎn)品。其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純。1. 1. 1. 3引物引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，如表1所示。表1引物名稱和核苷酸序列
1. 1. 1. 4序列合成根據(jù)Ohme-Takagi and Shinshi中的GCC盒序列，(其中劃線堿基 為附加上去的，使正反鏈退火合成的雙鏈兩側(cè)分別帶有損a/和兩個限制性酶切位點) 分別委托上海博亞生物技術(shù)公司合成，如表2所示。
表2合成鏈的名稱和核苷酸序列 1. 1. 1. 6生物和非生物脅迫稻瘟病菌(菌株為識分生孢子、稻縱卷葉螟幼 蟲、機(jī)械損傷等。方法
1. 1. 2. 1構(gòu)建含二倍盒的誘導(dǎo)型啟動子瞬間表達(dá)載體將1. 1. 1. 4中合成的帶有 XbaI和SpeI限制性酶切位點的GCC盒雙鏈寡核苷酸片段插入pBT10_GUS的相應(yīng)酶切位點 上(如圖4所示)，獲得含有單拷貝GCC盒的載體ρΒΤΙΟ-Χ-GUS (X-GCC盒，下同)，將載體 pBT 10-X-GUS分別用XbaIlSacI和SpeI/SacI組合酶切(37°酶切3_5h)，回收含GCC盒的 片段通過使用T4連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a和驗證，從而獲得帶有2個GCC盒 拷貝串聯(lián)的瞬間表達(dá)載體pBTlO-XX-GUS。1. 1. 2. 2構(gòu)建含二倍盒的誘導(dǎo)型啟動子植物表達(dá)載體根據(jù)上述1. 1. 2. 1中構(gòu)建 好的瞬間表達(dá)載體pBTlO-XX-GUS上的GCC盒和其下游相鄰的CaMV35S核心啟動子(-46 +8bp)片段設(shè)計Gateway內(nèi)側(cè)引物，運(yùn)用Gateway載體構(gòu)建技術(shù)(參考Invitrogen公司 Gateway 技術(shù))構(gòu)建植物表達(dá)載體，以pDN0R-207載體為入門載體，pMDC-163為目的載體從 而獲得可用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)植物表達(dá)載體PMDC-XX-163，表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株 EHA105備用(取Iug左右的pMDC-XX-163載體質(zhì)粒加入到EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰 浴30min ；液氮速凍3min ；取出后37°C水浴5min ；冰浴2min ；加入400ul不加抗生素的YEP 液體培養(yǎng)基，280C，ISOrpm搖培4h ；取出后涂在含有50mg/L卡那霉素和利福平的YEP固體 培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)到形成單菌落，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR驗證)。1. 1. 2. 3植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌以及對水稻的遺傳轉(zhuǎn)化用接種針挑取含目的 基因pMDC-XX-163的農(nóng)桿菌EHA105菌液，劃線于濃度為50mg/L卡那霉素和利福平的AB固 體培養(yǎng)基，置于28°C黑暗培養(yǎng)3-4d。從上述AB培養(yǎng)基上挑取一個單克隆于AAM液體培養(yǎng) 基中置于28°C搖床，搖至OD值為0. 1。取脫殼的日本晴種子用70%乙醇消毒l-2min，無菌 水沖洗5遍，接著用2. 5%次氯酸鈉溶液(每50ml 2. 5%次氯酸鈉溶液含一滴Tween-20)消 毒15min，用無菌水沖洗5遍，后置于滅菌過的濾紙上晾干，再接到N6D+2. 4D誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置 于32°C光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)5-7d誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。取出經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的種子，拔芽后 浸入上述OD為0. 1的AAM菌液中(含AS 10-20mg/L) lOmin，期間輕輕晃動，后用濾紙吸干 愈傷表面的菌液。將愈傷轉(zhuǎn)移到2N6-AS培養(yǎng)基上含AAM液體培養(yǎng)基的無菌濾紙上，25°C黑 暗共培養(yǎng)3d。將共培養(yǎng)后的愈傷于無菌水中清洗5-6遍直至無混濁出現(xiàn)，接著用含500mg/ L羧芐青霉素的無菌水清洗30min，用濾紙吸干，將愈傷置于N6D篩選培養(yǎng)基上(含400mg/L 羧芐青霉素、2mg/L 2.4-D和50mg/L的潮霉素)32°C光照篩選培養(yǎng)2周。將經(jīng)篩選培養(yǎng)的 愈傷轉(zhuǎn)移到RE-III培養(yǎng)基上(含0. 02mg/L α -NAA、2mg/L KT、50mg/L潮霉素和400mg/L羧芐
7青霉素)32°C光照分化培養(yǎng)2-3周。取分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到HF生根培養(yǎng)基上30°C誘導(dǎo) 生根培養(yǎng)1周。1. 1. 2. 4轉(zhuǎn)基因水稻DNA的提取以及分子檢測水稻基因組DNA的提取參照文獻(xiàn) (sambrook and russel, 2002)方法。用Gateway內(nèi)側(cè)特異引物序列對其進(jìn)行PCR檢測(如 圖5所示)，圖中以表達(dá)載體ρΒΤΙΟ-ΧΧ-GUS為陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因水稻為陰性對照，從圖 中可以看出1 8泳道出現(xiàn)與陽性對照一樣的PCR條帶，說明其均為陽性轉(zhuǎn)基因植物。1. 1. 2. 5轉(zhuǎn)基因植株生物和非生物脅迫處理取Tl代飽滿種子經(jīng)含潮霉素的水 溶液(濃度50mg/L)抗性篩選每天12h光照、25°C、培養(yǎng)7_8d后取能正常萌發(fā)的綠色小苗種 到盛有土壤的塑料小花盆中，以尿素和有機(jī)肥作為基肥，出苗后追肥兩次尿素。3-4葉期時 采用噴霧接種法接種濃度為105個/mL的稻瘟病菌(菌株為識仏77)分生孢子后移至25°C 和80%濕度的溫室培養(yǎng)數(shù)天。稻縱卷葉螟幼蟲取食Tl代轉(zhuǎn)基因植株5-6葉期的幼嫩葉片 不同時間段后將稻縱卷葉螟幼蟲從葉片上移走。機(jī)械損傷處理用解剖刀對Tl代轉(zhuǎn)基因植 株5-6葉期幼嫩葉片切割數(shù)處2-3cm傷口。1. 1. 2. 6組織化學(xué)染色生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答結(jié)果檢測按照 (Jefferson, 1987)的方法配置⑶S染色液，于-20°C避光儲存。經(jīng)上述生物和非生物脅迫 處理后剪取5-6cm葉片于37°C放置12h再用70%乙醇脫色，期間更換乙醇數(shù)次。待脫色完 全后拍取其照片。轉(zhuǎn)基因植株對生物、非生物脅迫的應(yīng)答 代轉(zhuǎn)基因植株稻瘟病處理
Tl代GCC-GUS轉(zhuǎn)基因植株生長到3-4葉期時被稻瘟病(菌株為識^^ )分生孢子侵染后 移至25°C和80%濕度的溫室培養(yǎng)4-8d，分別檢測⑶S報告基因的表達(dá)情況，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn) 接種后隨著培養(yǎng)時間的延長病害逐漸變得嚴(yán)重，在4-6d時GUS的表達(dá)量也隨著病害增加而 增加，⑶S表達(dá)局限于病原菌侵染區(qū)域。病害嚴(yán)重的區(qū)域⑶S表達(dá)擴(kuò)散到周圍甚至整片葉 片，第8d時尤為明顯。在未經(jīng)稻瘟病菌侵染的Tl代同齡植株置于相同條件下培養(yǎng)，剪取葉 片進(jìn)行GUS染色后發(fā)現(xiàn)除靠近用剪刀剪取部位外葉片其他部位未檢測到明顯的GUS活性。 其結(jié)果說明，該啟動子能應(yīng)答病原菌侵染在侵染處表達(dá)，而且隨著病害的加重其表達(dá)也隨 之增強(qiáng)(如圖6所示)。代轉(zhuǎn)基因植株稻縱卷葉螟幼蟲取食處理
用稻縱卷葉螟幼蟲取食Tl代轉(zhuǎn)基因水稻5-6葉期植株的幼嫩葉片，從開始取食時開始 計時lh、3h、5h、12h后輕輕將稻縱卷葉螟從葉片上移走。剪取葉片5-6cm浸入⑶S液中于 37°C黑暗放置12h后進(jìn)行脫色處理，如圖7所示，可以清晰觀察到上述不同時間段取食后 GUS基因表達(dá)量的變化，在稻縱卷葉螟取食處能檢測到明顯的GUS活性，隨著被取食時間增 加，葉片受損區(qū)域增加，進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)其表達(dá)也隨著增加。其結(jié)果說明，該啟動子能應(yīng)答 咀嚼式口器昆蟲危害，而且隨著危害的加重其介導(dǎo)的表達(dá)也隨之增強(qiáng)。代轉(zhuǎn)基因植株機(jī)械損傷處理
機(jī)械損傷處理用解剖刀對Tl代轉(zhuǎn)基因植株5-6葉期幼嫩葉片切割數(shù)處2-3cm傷口，分 別于讓”??！力！^口?。『蠹羧诟浇?-6cm長的葉片浸入⑶S液中置于37°C黑暗放置12h， 然后分別檢測上述不同時間段處理后GUS表達(dá)量的變化。經(jīng)染色后可發(fā)現(xiàn)經(jīng)解剖刀切割傷 口處具有清晰的GUS活性，而且在此實驗中GUS活性隨著時間的遞增而逐漸增加(如圖8所示)。其結(jié)果說明，該啟動子能應(yīng)答機(jī)械損傷，而且隨著損傷時間的延長其介導(dǎo)的表達(dá)也隨
著增強(qiáng)。3 討論
為了驗證此嵌合型啟動子對生物和非生物脅迫應(yīng)答的功能，本發(fā)明采用病蟲害頻發(fā)而 導(dǎo)致嚴(yán)重影響其產(chǎn)量的水稻為轉(zhuǎn)基因受體材料。運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)目的基因?qū)λ居鷤M織 進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株后對其Tl代植株進(jìn)行水稻常見病蟲害(如稻瘟病、稻縱卷 葉螟)以及機(jī)械損傷處理。結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)隨著植株發(fā)病程度或受損程度的加重，該啟動子所 介導(dǎo)的GUS報告基因表達(dá)量增加，而其表達(dá)僅局限于病斑以及取食受損處，隨著模擬脅迫 處理時間的延長其表達(dá)量顯著增加甚至?xí)U(kuò)散至整片葉片。當(dāng)用未處理的葉片染色后很少 或者不出現(xiàn)藍(lán)色，說明該啟動子只有很低的本底表達(dá)。綜上所述該啟動子本底表達(dá)低、應(yīng)答速度快、持續(xù)時間長、表達(dá)強(qiáng)度適中以及其表 達(dá)量與病害程度相一致。對于促進(jìn)水稻抗病、抗蟲基因工程的實用化，同時通過啟動子的鑒 定將植物抗病、抗蟲分子生物學(xué)研究成果向糧食作物水稻延伸，促進(jìn)水稻抗病、抗蟲的分子 機(jī)制研究具有重要意義。
權(quán)利要求
一種含GCC盒的誘導(dǎo)型啟動子，其至少含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)型啟動子的構(gòu)建方法，其特征在于將雙子葉植物擬 南芥中鑒定的應(yīng)答逆境脅迫的GCC盒與CaMV35S啟動子核心序列融合，構(gòu)建成誘導(dǎo)型啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)型啟動子的構(gòu)建方法，其特征在于所述GCC盒的核苷 酸序列為 AATCAGAAGCCGCCCCAGAAT。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)型啟動子的構(gòu)建方法，其特征在于所述CaMV35S啟動 子核心序列為 TCGACCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC。
5.一種含有權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)型啟動子或由權(quán)利要求2所述的方法構(gòu)建的誘導(dǎo)型 啟動子在單子葉植物水稻抗病、蟲基因工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含GCC盒的誘導(dǎo)型啟動子及構(gòu)建和在基因工程上的應(yīng)用，所述誘導(dǎo)型啟動子至少含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，構(gòu)建方法是將雙子葉植物擬南芥中鑒定的應(yīng)答逆境脅迫的GCC盒與CaMV35S啟動子核心序列融合構(gòu)建成誘導(dǎo)型啟動子。本發(fā)明的含GCC盒的誘導(dǎo)型啟動子本底表達(dá)低、應(yīng)答速度快、持續(xù)時間長、表達(dá)強(qiáng)度適中，該誘導(dǎo)型啟動子在單子葉植物水稻抗病、蟲基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價值，其轉(zhuǎn)基因植物株系在誘導(dǎo)植物抗病的小分子化合物高通量篩選中也有重要的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/113GK101886079SQ20101025449
公開日2010年11月17日 申請日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者何水林, 劉志欽, 官德義, 方開星, 牟少亮, 王小燕, 王芳權(quán), 黃定全 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)