一種化學(xué)誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種化學(xué)誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法，包括如下步驟：1）化學(xué)誘變；2）篩選；3）PCR檢測質(zhì)粒穩(wěn)定性；4）誘導(dǎo)表達與活性檢測。本發(fā)明通過化學(xué)誘變劑硫酸二乙酯誘變釀酒酵母基因工程菌株，用含有五氟尿嘧啶的培養(yǎng)基篩選，致死淘汰能利用培養(yǎng)基中尿嘧啶的細胞，得到不能利用培養(yǎng)基中尿嘧啶的突變體。該突變體只能或基本只能使用質(zhì)粒本身基因合成尿嘧啶，因而在非選擇培養(yǎng)基中仍然維持質(zhì)粒穩(wěn)定性，極大降低了培養(yǎng)基成本，克服了制約利用釀酒酵母基因工程菌大規(guī)模生產(chǎn)抗菌肽的關(guān)鍵難題之一。
【專利說明】一種化學(xué)誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種化學(xué)誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 。
【背景技術(shù)】
[0002]抗菌肽是在誘導(dǎo)條件下，生物體免疫防衛(wèi)系統(tǒng)產(chǎn)生的小分子活性肽類，廣泛分布于植物，動物以及人類。抗菌肽是由基因編碼、由核糖體合成的。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)、鑒定的抗菌肽已超過千種，大多帶凈正電荷。從結(jié)構(gòu)上看可以分為α-螺旋型、折疊型、富含二硫鍵的、富含脯氨酸等多種類型。抗菌肽抑菌譜廣，有些抗菌肽還可以特異性地抑制某些腫瘤細胞的生長?？咕目梢杂糜卺t(yī)藥衛(wèi)生、食品添加劑、飼料添加劑等方面?？咕呐c傳統(tǒng)抗生素抑菌機理不同，抗菌肽的作用方式主要是選擇性地攻擊病原物的細胞膜，病原物不易產(chǎn)生針對抗菌肽的耐藥性，因此使用抗菌肽可以解決細菌耐藥性問題。同時又由于它是一種肽，可以被消化道消化、吸收對人體無害，無殘留，因此，抗菌肽在醫(yī)藥、畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)等方面都有十分廣泛的應(yīng)用前景?？咕脑谏矬w內(nèi)含量極低，生產(chǎn)成本居高不下，嚴重影響其廣泛應(yīng)用；研究開發(fā)其大規(guī)模生產(chǎn)方法具有十分積極的意義。
[0003]目前，生產(chǎn)抗菌肽的方法主要有三種:1.直接從生物體中提取天然抗菌肽:抗菌肽廣泛存在于低等到高等動物的特定組織中，但是含量非常少，且提取工藝復(fù)雜，成本昂貴，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求；2.化學(xué)方法合成抗菌肽:化學(xué)合成法成本高，同時難以保證合成肽類的天然結(jié)構(gòu)和生物活性；3基因工程方法:采用該方法是如今研究的熱點，也是獲得抗菌肽的有效途徑之一。
[0004]釀酒酵母在食品業(yè)使用有數(shù)千年的歷史，也是基因工程的模式生物之一。隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，釀酒酵母已被廣泛地應(yīng)用于外源蛋白表達的宿主，其是真核生物，無內(nèi)毒素，長久以來在食品和釀酒工業(yè)中廣泛應(yīng)用；胞外分泌表達蛋白，簡化了表達產(chǎn)物的分離純化。
[0005]基因工程中釀酒酵母載體有兩類:整合型載體(YIps)和附加體型載(YEps)。整合型載體不含自主復(fù)制序列，通過同源重組被整合到宿主酵母菌的染色體上，穩(wěn)定性好，但拷貝數(shù)很低，不能滿足生產(chǎn)要求。附加體型載體一般利用酵母天然2μ質(zhì)粒的復(fù)制原點序列，能夠獨立于酵母染色體外自主復(fù)制，拷貝數(shù)通?？蛇_30以上，易于更換宿主菌，但附加體型載體在非選擇條件下不穩(wěn)定，大規(guī)模發(fā)酵時更容易丟失，而重組質(zhì)粒在宿主細胞中的穩(wěn)定存在，是基因工程生產(chǎn)異源蛋白的前提。當(dāng)利用質(zhì)粒載體在大量高效表達某種特殊產(chǎn)物時，質(zhì)粒載體的丟失就意味著產(chǎn)量的下降，對于外源基因的表達是很大的障礙。從而給生產(chǎn)帶來嚴重的后果。如何有效提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，一直是一個亟待解決的既有理論意義又有實際應(yīng)用價值的關(guān)鍵問題。
[0006]pYES2是應(yīng)用較為廣泛的釀酒酵母白表達載體，其在宿主細胞中穩(wěn)定的機制，是通過質(zhì)粒本身所攜帶的URA3基因彌補INVScl宿主細胞尿嘧啶營養(yǎng)缺陷，轉(zhuǎn)化菌在不含尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)以保持選擇壓力，即可維持質(zhì)粒的穩(wěn)定存在。但選擇性培養(yǎng)基為合成培養(yǎng)基，要求添加一些氨基酸以及無堿基氮源，成本很高，構(gòu)成工業(yè)化生產(chǎn)的主要障礙之一 。
[0007]URA3編碼乳清酸核苷-5' _磷酸脫羧酶，催化乳清甘酸脫羧形成尿嘧啶核苷酸，其它嘧啶核苷酸由尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)變得到。若細胞乳清酸核苷-5^ -磷酸脫羧酶活性缺失，則需要利用培養(yǎng)基中的尿嘧啶，通過補救途徑合成尿嘧啶核苷酸，與此有關(guān)的酶有尿嘧啶透性酶、尿苷磷酸化酶等。鑒于構(gòu)建好的基因工程菌株可以利用重組PYES2質(zhì)粒的URA3基因合+突變體，使其失去或減弱從培養(yǎng)基中獲取尿嘧啶的能力，這樣基因工程菌可以在完全培養(yǎng)基中生長，同時保持對質(zhì)粒穩(wěn)定性所必需的選擇壓力。。
[0008]誘變是通過物理、化學(xué)、生物因素作用于宿主菌，人為使其遺傳物質(zhì)發(fā)生變異的手段，不僅可以提高菌種有效產(chǎn)物的產(chǎn)量，改善其生物學(xué)特性和創(chuàng)造新品種，而且對于研究有效產(chǎn)物代謝途徑、遺傳圖譜繪制、功能基因分析等都具有一定的作用。誘變育種操作簡便、速度快、收效大、手段多樣，所以是實驗室及生產(chǎn)上最為常用的高產(chǎn)菌株育種方式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種化學(xué)誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法。
[0010]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種化學(xué)誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法，包括如下步驟:
1)化學(xué)誘變
2)篩選;
3)PCR檢測質(zhì)粒穩(wěn)定性。
[0011]步驟I)所述誘變的操作為:取含重組質(zhì)粒的釀酒酵母基因工程菌懸浮液加入誘變劑DES，超聲波處理后，將誘變液加入硫代硫酸鈉溶液中終止反應(yīng)。
[0012]作為優(yōu)選的，步驟I)的具體操作為:取含重組質(zhì)粒pYES2_ a -G13的釀酒酵母基因工程菌懸浮液加入誘變劑DES使其終濃度為2% (ν/ν)，超聲波處理10~20min后，將誘變液加入25%的硫代硫酸鈉溶液中終止反應(yīng)。
[0013]步驟2)所用的篩選劑為五氟尿嘧啶，具體操作為，將步驟I)誘變后的菌液涂布于含五氟尿嘧啶的SC-U固體培養(yǎng)基上進行篩選。
[0014]作為優(yōu)選的，所述SC-U固體培養(yǎng)基中五氟尿嘧啶的濃度為20 μ mol/L。
[0015]步驟3)的具體操作為:于篩選板上挑選單個菌落接種于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h、144h時做菌液PCR反應(yīng)，檢測質(zhì)粒的穩(wěn)定性。
[0016]所述釀酒酵母基因工程菌為含有抗菌肽G13重組質(zhì)粒pYES2- a -G13的釀酒酵母基因工程菌。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:
本發(fā)明通過化學(xué)誘變劑硫酸二乙酯誘變釀酒酵母基因工程菌株，用含有五氟尿嘧啶的培養(yǎng)基篩選，致死淘汰能利用培養(yǎng)基中尿嘧啶的細胞，得到不能利用培養(yǎng)基中尿嘧啶的突變體。該突變體只能或基本只能使用質(zhì)粒本身基因合成尿嘧啶，因而在非選擇培養(yǎng)基中仍然維持質(zhì)粒穩(wěn)定性，極大降低了培養(yǎng)基成本，克服了制約利用釀酒酵母基因工程菌大規(guī)模生產(chǎn)抗菌肽的關(guān)鍵難題之一。
[0018]對于本發(fā)明來說，主要解決了如下問題。
[0019]1.誘變菌株在沒有選擇壓力的完全培養(yǎng)基上可以正常生長而質(zhì)粒不丟失，節(jié)約了培養(yǎng)基成本；
2.誘變菌株利用α信號肽，將表達產(chǎn)物分泌至胞外，避免了破碎細胞等工序，方便分離純化，降低生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為突變菌株在含有尿嘧啶的完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天的PCR檢測結(jié)果，其中S代表在尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天菌液的PCR結(jié)果，W代表在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天的菌液 PCR 結(jié)果，M 代表 DNA Marker D (2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp);
圖2為誘變工程菌誘導(dǎo)上清對大腸桿菌DH5a和枯草芽孢桿菌活性檢測圖，其中A為枯草芽孢桿菌抑菌活性圖，B為大腸桿菌DH5 α抑菌活性圖，圖中丨為氨芐，2為SC-U尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基誘導(dǎo)上清，3為完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)上清，4為無菌ddH20 ；
圖3為PCR檢測效果圖。M為Maker，1-5是誘變菌株的在完全培養(yǎng)基第一到第五天的PCR檢測，6-10是未誘變的完全培養(yǎng)基第一到第五天的PCR檢測。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0022]實施例1
本實施例所用的釀酒酵母基因工程菌為含有重組質(zhì)粒pYES2-a -G13的釀酒酵母基因工程菌，所述重組質(zhì)粒pYES2-a -G13的制備方法參加申請?zhí)枮镃N201210073067.9的專利申請《一種利用釀酒酵母表達抗菌肽G13的方法》。
[0023]1、誘變
用接種環(huán)挑取一 80°C下保存的釀酒酵母基因工程菌甘油菌于尿嘧啶缺陷固體培養(yǎng)基(SC-U)上，等菌落長出，取單菌落接種于SC-U液體培養(yǎng)基上，待0D600=3時，無菌條件下取IOml菌液于離心機中，3000r/min離心lOmin，用pH=7的PB緩沖液40ml懸浮至菌體密度為IO6個/ml，在懸浮液中加入Iml誘變劑DES (硫酸二乙酯)使其終濃度為2% (v/v)，用超聲波處理15min，吸取500 μ I誘變液加入0.25ml 25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。取誘變菌體進行SC-U固體培養(yǎng)基平板涂布，得知在誘變15min時致死率為80%。
[0024]2、篩選
根據(jù)誘變可知在DES誘變15min時其致死率達80%，涂布于含20 μ mo I /L的五氟尿嘧啶的固體培養(yǎng)基中進行篩選。
[0025]3、PCR檢測質(zhì)粒穩(wěn)定性
挑選單個菌落接種于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h，48h，72h，96h，120h, 144h時做菌液PCR反應(yīng)，檢測質(zhì)粒的穩(wěn)定性，PCR引物序列如下:
Pl:CCGCTCGAGAAAAGACAAAGATCTGT (SEQ ID NO:1)
P2:GGAATTCTTACCATCTAGATCTACCAGTTCTACAAAC (SEQ ID NO:2)。
[0026]圖1為突變菌株在含有尿嘧啶的完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天的PCR檢測結(jié)果，該結(jié)果表明利用本發(fā)明方法篩選得到的在突變菌株可以在沒有選擇壓力的完全培養(yǎng)基上正常生長而質(zhì)粒不丟失。
[0027]4、誘導(dǎo)表達與活性檢測
挑選單克隆接種于YPD完全培養(yǎng)基，30°C 200r/min震蕩培養(yǎng)48h，4°C、3000rpm離心10 min,收集酵母菌，分別用含4%半乳糖的SC培養(yǎng)基和和SC- U誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮，使菌液終濃度達到0D600=0.4，置于20°C，200r/min的搖床誘導(dǎo)。誘導(dǎo)24h做抑菌活性試驗檢測。圖2為誘變工程菌誘導(dǎo)上清對大腸桿菌DH5 α和枯草芽孢桿菌活性檢測圖，檢測結(jié)果表明，本發(fā)明方法篩選得到的誘變菌株能夠高效穩(wěn)定的表達分泌抗菌肽G13。
[0028]5、傳代實驗
將篩選得到的誘變菌株進行傳代培養(yǎng)，傳代約100次后，所得到的菌株仍可以在沒有選擇壓力的完全培養(yǎng)基上正常生長而質(zhì)粒不丟失，并能夠高效穩(wěn)定的表達分泌抗菌肽G13。本試驗已多 次重復(fù)。
【權(quán)利要求】
1.一種化學(xué)誘變釀酒酵母基因工程菌提高重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法，包括如下步驟: 1)化學(xué)誘變； 2)篩選; 3)PCR檢測質(zhì)粒穩(wěn)定性； 4)誘導(dǎo)表達與活性檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述誘變的操作為:取含重組質(zhì)粒的釀酒酵母基因工程菌懸浮液加入誘變劑DES，超聲波處理后，將誘變液加入硫代硫酸鈉溶液中終止反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟I)的具體操作為:取含重組質(zhì)粒pYES2-a -G13的釀酒酵母基因工程菌懸浮液加入誘變劑DES使其終濃度為2%(v/v)，超聲波處理10~20min后，將誘變液加入25%的硫代硫酸鈉溶液中終止反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所用的篩選劑為五氟尿嘧啶，具體操作為，將步驟I)誘變后的菌液涂布于含五氟尿嘧啶的SC-U固體培養(yǎng)基上進行篩選。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述SC-U固體培養(yǎng)基中五氟尿嘧啶的濃度為 20 μ mol/Lo
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)的具體操作為:于篩選板上挑選單個菌落接種于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h、144h時做菌液PCR反應(yīng)，檢測質(zhì)粒的穩(wěn)定性。`
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母基因工程菌為含有重組質(zhì)粒pYES2_a -G13的釀酒酵母基因工程菌，所述重組質(zhì)粒pYES2_a -G13表達抗菌肽Gl3。
【文檔編號】C12N15/01GK103555710SQ201310519928
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】查向東, 馬利娟, 趙大偉, 余忠麗, 車媛媛, 徐雪嬌 申請人:貴州省福泉市福中福農(nóng)牧有限公司