釀酒酵母及釀酒酵母生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種釀酒酵母及釀酒酵母生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氨基葡萄糖(Glucosamine，或2-amino-2_deoxy-D-glucose)，它的英文縮寫(xiě)為GlcN，它是一種取代后的化合物，氨基取代葡萄糖2號(hào)位C上的羥基，第一個(gè)確認(rèn)結(jié)構(gòu)的氨基單糖就是氨基葡萄糖，它是一種非常重要的功能性單糖。GlcN的分子式為C6H13O5N,分子量179.Hg/mLXlcN在很多有機(jī)體中都發(fā)現(xiàn)過(guò)，含量比較多的包括細(xì)菌、絲狀真菌、酵母菌，甚至在植物體內(nèi)和動(dòng)物體內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)。氨基葡萄糖是甲殼素的重要組成成分，也是殼聚糖的重要組成成分，還是糖蛋白的重要組成成分。研究還表明在蛋白聚糖中氨基葡萄糖也起著重要的作用，這些物質(zhì)都可以由氨基葡萄糖通過(guò)一定的氨基化作用獲得。另外，作為一種生理必須物質(zhì)，在人體結(jié)締組織中也有存在，而且是人體軟骨基質(zhì)中合成蛋白聚糖所必需的重要成分。由于氨基葡萄糖用途十分廣泛，市場(chǎng)前景廣闊。
[0003]1876年，氨基葡萄糖被第一次從甲殼素的水解產(chǎn)物中分離出來(lái)，1939年，沃爾特.霍沃思確定了氨基葡萄糖的立體結(jié)構(gòu)，從此，氨基葡萄糖被人們更好的認(rèn)識(shí)和研究。目前，美國(guó)是氨基葡萄糖的最大消費(fèi)國(guó)，中國(guó)隨著收入水平及保健意識(shí)的提高，氨基葡萄糖的消費(fèi)也呈逐年快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。
[0004]氨基葡萄糖在醫(yī)藥工業(yè)方面的應(yīng)用:
[0005]氨基葡萄糖的硫酸鹽為治療抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的原料藥，近年來(lái)，由于發(fā)現(xiàn)其具有吸收體內(nèi)產(chǎn)生的自由基、抗衰老、促進(jìn)減肥、抑菌以及能調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌等多種生理功能，故廣泛被用于食品添加劑和保健食品的生產(chǎn)中。GlcN可能通過(guò)刺激軟骨蛋白聚糖的生物合成而對(duì)關(guān)節(jié)炎有特殊的療效，此外，GlcN還可增加軟骨特異性Π型膠原的合成，GlcN還具有護(hù)肝的作用。研究發(fā)現(xiàn)GlcN的另一種衍生物乙酰氨基葡萄糖GIcNAc可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的方向分化，在作用濃度和作用時(shí)間上與傳統(tǒng)的藥物相比有明顯的優(yōu)勢(shì)，而且因其毒副作用較小，因而很可能成為新型細(xì)胞分化誘導(dǎo)藥物而應(yīng)用于臨床。
[0006]氨基葡萄糖在食品工業(yè)方面的應(yīng)用:
[0007]由于GlcN對(duì)人體沒(méi)有毒性，日本和美國(guó)均將其作為食品配料廣泛使用。日本乳業(yè)組織自2004年10月就開(kāi)始銷售添加GlcN的乳飲料“GLUCOSAMINE POWER”(家庭裝)，2005年卡爾皮公司又推出
[0008]添加GlcN的綠茶飲料“FINESUPPORT GLUCOSAMINE”，其他如寶酒造的“氨基葡萄糖豆乳”，協(xié)同乳業(yè)、博佳、愛(ài)爾泰等的添加GlcN的柑桔飲料亦紛紛涌入市場(chǎng)。陳忻等研究了GlcN鹽酸鹽的抗菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GlcN鹽酸鹽對(duì)供試食品中常見(jiàn)的細(xì)菌、霉菌、酵母菌均有明顯的抑制作用，其中細(xì)菌最為敏感，而且隨著GlcN鹽酸鹽濃度增加，其抑菌作用逐漸增強(qiáng)。說(shuō)明GlcN在成為新型的天然食品防腐劑方面具有廣闊的前景。
[0009]氨基葡萄糖在化妝品方面的應(yīng)用
[0010]GlcNAc是透明質(zhì)酸的單體，是生物體內(nèi)多種重要多糖的基本組成單位，也是一種新型生化藥品、藥物中間體和高檔化妝品的添加劑。它可增強(qiáng)人體免疫功能、治療多種炎癥。GlcNAc在人體內(nèi)是合成雙歧因子和透明質(zhì)酸的重要前體，與透明質(zhì)酸相比，由于其是小分子量的單體，極易被皮膚吸收，且應(yīng)用于化妝品能提供營(yíng)養(yǎng)、保濕和抗自由基，因而常被用于高檔化妝品的生產(chǎn)，在化妝品中添加量一般為0.1%?5%。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上已有多種含GlcNAc的護(hù)膚產(chǎn)品，最高添加量達(dá)4 %，效果良好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。
[0012]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種釀酒酵母及釀酒酵母生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法，其對(duì)自制工程菌株發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，提高了氨基葡萄糖的產(chǎn)量。
[0013]為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae H158-1C，所述釀酒酵母被保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為:CGMCC N0.11735,保藏時(shí)間為:2015年11月25日。
[0014]—種利用釀酒酵母生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法，包括以下步驟:
[0015]步驟一、種子培養(yǎng):將所述釀酒酵母接種在含有硫酸卡那霉素的斜面培養(yǎng)基上，在溫度30?37°C下，培養(yǎng)24?28h后，接種至種子培養(yǎng)基上，在溫度30?37°C和轉(zhuǎn)速1100?2000r/min下培養(yǎng)至OD6QQ值=2?3時(shí)，得到種子培養(yǎng)液；
[0016]步驟二、種子發(fā)酵:將步驟二制備得到種植培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基上，在溫度35?40°C、轉(zhuǎn)速為200?220r/min下發(fā)酵18?20h，得到發(fā)酵液；
[0017]其中，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基上的種子培養(yǎng)液的體積為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1%?5%;
[0018]發(fā)酵培養(yǎng)基在接種前添加終濃度為70yg/mL的硫酸卡那霉素，殘留控制在2.0%;
[0019]當(dāng)菌體的OD6qq= 0.6時(shí)，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入5g/L的乳糖；
[0020]在種子發(fā)酵2?1h且菌體的0D6QQ= 2?3時(shí)，向發(fā)酵培養(yǎng)基中開(kāi)始指數(shù)流加葡萄糖，且控制細(xì)胞比生長(zhǎng)速度為0.21Γ1;
[0021]在種子發(fā)酵中的溶氧量調(diào)節(jié)策略為:在種子發(fā)酵O?2h、3?8、9?12和13?18h時(shí)，分別控制溶氧量為20%,30%A0%和30%，每次通氣的通氣量為lOvvm，氣體溫度為35V?37。。；
[0022]步驟三、對(duì)步驟二中的制備得到發(fā)酵液提純結(jié)晶，即得到氨基葡萄糖。
[0023]優(yōu)選的是，所述的釀酒酵母生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法中，所述步驟一中，斜面培養(yǎng)基包含:胰蛋白胨10?15g/L、酵母粉5?10g/L、NaCl 10?15g/L、瓊脂粉20?25g//L和硫酸卡那霉素40?50mg/L;
[0024]斜面培養(yǎng)基的pH值6.5?7.5，且在0.IMpa滅菌25?30min。
[0025]優(yōu)選的是，所述的釀酒酵母生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法中，所述步驟一中，種子培養(yǎng)基包含:D-氨基葡萄糖鹽酸鹽50?60g/L、碳酸鈣25?30g/L、磷酸二氫鉀10?15g/L、七水合硫酸鎂15?20g/L、硝酸鈉10?15g/L、酵母膏10?15g/L和玉米楽！?3ml/L;
[0026]種子培養(yǎng)基的pH值為6.5?7.5，且在0.1Mpa滅菌25?30min。
[0027]優(yōu)選的是，所述的釀酒酵母生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法中，所述步驟二中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括:葡萄糖50?90g/L、乳糖10?20g/L、碳酸|丐10?15g/L、磷酸二氫鉀15?20g/L、七水合硫酸鎂5?7g/L、硝酸鈉5?8g/L、酵母膏5?10g/L和玉米楽3?5ml/L;
[0028]發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值6.5?7.5，且在0.1Mpa滅菌25?30min。
[0029]優(yōu)選的是，所述的釀酒酵母生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法中，所述步驟二中，發(fā)酵培養(yǎng)基在接種種子培養(yǎng)液前添加終濃度為50?70yg/mL的硫酸卡那霉素，且硫酸卡那霉素的殘留量為 20yg/mL。
[0030]優(yōu)選的是，所述的釀酒酵母生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法中，所述步驟三具體為:
[0031 ] 將步驟二中制備得到的發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為7500?8000rpm下離心15?20min，取上清液，在90?100°C下加熱15?20min后，在轉(zhuǎn)速在12000?13000rpm下離心20?25min，取上層清液，得到原液，
[0032]用硅藻土對(duì)原液脫色，采用溫度30?35°C的硫酸銨為洗脫液，當(dāng)硫酸銨溶液濃度為0.7?1.0mol/L時(shí)，停止洗脫，得到初始過(guò)濾液，初始過(guò)濾液采用苯乙烯系強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂吸附過(guò)濾，進(jìn)樣流速為3.19BV/h，洗脫流速為3.8BV/h時(shí)，采用與初始濾液等體積的無(wú)水乙醇洗脫，得到最終濾液，最終濾液在4°C下靜置6?10h，抽濾，即得到氨基葡萄糖酸晶體。
[0033]本發(fā)明至少包括以下有益效果:第一、本發(fā)明為微生物發(fā)酵法制備氨基葡萄糖，是一種重要的氨基己糖，能夠有效作用于軟骨組織治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，并被視為天然無(wú)害的食品及保健品配料，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊；第二、本發(fā)明對(duì)自制工程菌株發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程實(shí)行乳糖流加策略及分階段溶氧控制策略，顯著提高氨基葡萄糖產(chǎn)量，氨基葡萄糖的胞內(nèi)和胞外產(chǎn)量不低于134.7g/L，純化的吸附率不低于95%，洗脫率不低于98 %，氨基葡萄糖的純度在98 %以上，達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。
[0034]本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明