一種能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白質(zhì)及構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白質(zhì)及構(gòu)建方法，構(gòu)建方法為：①將擬南芥中細(xì)胞色素-NADPH-還原酶1基因AtCPR1的5’端的前138個(gè)堿基切除，得到SEQ ID NO.2所示序列；②將以SEQ ID NO.3所示的人參中原人參二醇合酶基因PPDS的3’端終止密碼子TAA去除，與SEQ ID NO.2所示序列的5’端用編碼多肽GGG的堿基序列連接，構(gòu)建出融合蛋白質(zhì)的基因元件；③將融合蛋白質(zhì)的基因元件與釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)源啟動(dòng)子和終止子連接，構(gòu)建融合蛋白質(zhì)基因表達(dá)盒，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)。本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)，能使達(dá)瑪烯二醇到原人參二醇的轉(zhuǎn)化效率提高。
【專利說明】一種能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白質(zhì)及構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白 質(zhì)及構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 人參皂苷是中藥人參的主要活性成分，具有保護(hù)心血管，抗疲勞，抗衰老和抗癌的 藥理作用。傳統(tǒng)的人參栽培、組織培養(yǎng)和下游的植物組織提取已很難滿足市場(chǎng)對(duì)人參皂苷 的需求。
[0003] 作為一種三萜類化合物，釀酒酵母內(nèi)源代謝途徑可為人參皂苷的合成提供前體 2, 3-氧化鯊烯。隨后的環(huán)氧化、氧化以及糖基添加分別由達(dá)瑪烯二醇合成酶、原人參二醇合 成酶和糖基轉(zhuǎn)移酶完成。達(dá)瑪烯二醇合成酶基因于2006年被發(fā)現(xiàn)。Tansakul等報(bào)道PNA 是催化達(dá)瑪烯二醇合成的基因。Han等報(bào)道了另外一個(gè)DDS (DDBJ/EMBL/GenBanK數(shù)據(jù)庫，序 號(hào)AB122080)。2011年，Jung-Yeon Han等通過對(duì)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的人參不定根進(jìn)行cDNA 建庫，對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后經(jīng)過一系列篩選，確定PPDS基因（cyp716a47)編碼原人參二醇合成 酶。2014年，GT的篩選也取得一定的進(jìn)展，周志華等綜合已發(fā)表的人參轉(zhuǎn)錄組的信息，篩選 出能將原人參二醇轉(zhuǎn)化為人參皂苷compound K(CK)的糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0004] 基于以上人參皂苷合成途徑中相關(guān)基因的挖掘，張學(xué)禮對(duì)釀酒酵母進(jìn)行工程化， 引入DS、PPDS和擬南芥中的AtCPRl，并對(duì)釀酒酵母甲羥戊酸途徑限速過程進(jìn)行過表達(dá)，構(gòu) 建了產(chǎn)原人參二醇的人工釀酒酵母細(xì)胞。周志華將篩選到的GT基因植入釀酒酵母中，得到 了能產(chǎn)CK的釀酒酵母細(xì)胞。
[0005] PPDS是一種細(xì)胞色素 P450單加氧酶。前期的研宄發(fā)現(xiàn)，在人工構(gòu)建的原人參二醇 釀酒酵母合成途徑中，PPDS是一個(gè)限速的步驟，單純的增加 PPDS及其還原酶的拷貝并不能 解決問題，致使達(dá)瑪烯二醇的轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的 融合蛋白質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白質(zhì)的構(gòu) 建方法。
[0008] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白質(zhì)在釀 酒酵母中合成人參皂苷中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0010] 一種能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0011] ①將擬南芥中細(xì)胞色素-NADPH-還原酶1基因 AtCPRl的5'端的前138個(gè)堿基切 除，得到SEQ ID NO. 2所示序列，所述擬南芥中AtCPRl基因以SEQ ID NO. 1所示；
[0012] ②將以SEQ ID NO. 3所示的人參中原人參二醇合酶基因 PPDS的3'端終止密碼 子TAA去除，與SEQ ID NO. 2所示序列的5'端用編碼多肽GGG的堿基序列連接，構(gòu)建出 PPDS-I inker3-AtCPRl融合蛋白質(zhì)的基因元件；
[0013] ③將PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白質(zhì)的基因元件與釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)源啟動(dòng)子 和終止子連接，構(gòu)建PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白質(zhì)基因表達(dá)盒，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母 細(xì)胞表達(dá)。
[0014] 上述方法構(gòu)建的能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白質(zhì)。
[0015] 具體構(gòu)建過程見實(shí)施例3。
[0016] 所述GGG的堿基序列如5' -GGTGGTGGT-3'，但不僅限于此序列。
[0017] 所述釀酒酵母內(nèi)源啟動(dòng)子如PGKlp(磷酸甘油酸激酶1啟動(dòng)子），序列SEQ ID NO. 7 〇
[0018] 所述釀酒酵母內(nèi)源終止子如ADH3t (乙醇脫氫酶3)序列SEQ ID NO. 12.
[0019] SEQ ID NO. 1所示的AtCPRl基因序列為擬南芥NADPH-細(xì)胞色素 P450還原酶1的 基因針對(duì)釀酒酵母的密碼子的優(yōu)化序列。
[0020] SEQ ID NO. 2所示的基因序列為序列SEQ ID NO. 1去除前138bp后得到。
[0021] SEQ ID NO. 3所示的PPDS基因序列為人參中原人參二醇合成酶的基因針對(duì)釀酒酵 母的密碼子的優(yōu)化序列。
[0022] 上述融合蛋白質(zhì)在釀酒酵母中合成人參皂苷中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0024] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建的能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白質(zhì) PPDS-I inker3-AtCPRl在釀酒酵母中比單獨(dú)存在的PPDS和AtCPRl催化效率高。這種構(gòu)建 方法得到的融合蛋白提高了達(dá)瑪烯二醇的轉(zhuǎn)化效率，有利于人參皂苷在微生物中的高效合 成。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖 I. PGKlp-PPDS-linker3-AtCPRl-ADH3t 融合模塊電泳圖。
[0026] 圖2. PPDS和AtCPRl蛋白質(zhì)在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的示意圖。圖2A為自然條件下兩 種蛋白質(zhì)在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的示意圖；圖2B為本發(fā)明所構(gòu)建的PPDS-linker3-AtCPRl融合 蛋白質(zhì)在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的不意圖。
[0027] 圖3.達(dá)瑪烯二醇和原人參二醇LC-MS分析。
[0028] 圖4.自然條件下PPDS和AtCPRl與PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白催化能力對(duì) 比。
[0029] 圖5.各菌株達(dá)瑪烯二醇和原人參二醇的產(chǎn)量對(duì)比。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0031] 下面實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 合成達(dá)瑪烯二醇釀酒酵母細(xì)胞的構(gòu)建
[0035] 一、模塊構(gòu)建
[0036] 根據(jù)達(dá)瑪烯二醇合酶的氨基酸序列，進(jìn)行針對(duì)釀酒酵母的密碼子優(yōu)化，然后通過 化學(xué)合成的方法（金唯智生物科技有限公司合成）得到編碼達(dá)瑪烯二醇合成酶的基因 DS 為 SEQ ID NO. 4;釀酒酵母內(nèi)源的 tHMGl(SEQ ID NO. 5)，ergl(SEQ ID NO. 6)，以及啟動(dòng)子 PGKlp(SEQ ID N0.7)，TEFlp(SEQ ID N0.8)，TDH3p(SEQ ID N0.9)和終止子 CYClt(SEQ ID NO. 10)，ADHlt(SEQ ID NO. ll)，ADH3t(SEQ ID NO. 12)均來自釀酒酵母 w303-la基因組；篩 選標(biāo)記基因 leu2來自質(zhì)粒prs405 (美國ATCC)，his3來自質(zhì)粒pxp320 (購自Addgene, Inc. WWW. addgene. org) 〇
[0037] 以釀酒酵母 W303-la(美國，ATCC)基因組為模板，以 PGKlp-DS-F (SEQ ID NO. 13) (和 PGKlp-DS-R (SEQ ID NO. 14)以及 DS-CYClt-F (SEQ ID NO. 17)和 DS-CYClt-R (SEQ ID NO. 18)為引物，分別擴(kuò)增PGKlp啟動(dòng)子和CYClt終止子。
[0038] 以人參中達(dá)瑪烯二醇合成酶基因 DS(SEQ ID NO. 4)為模板，以DS-F(SEQ ID NO. 15)和DS-R(SEQ ID NO. 16)為引物擴(kuò)增DS基因。將PGKlp啟動(dòng)子、DS基因和CYClt 終止子用融合PCR的方法融合成DS的表達(dá)模塊PGKlp-DS-CYClt ;以釀酒酵母W303-la 基因組為模板，以TEFlp-ergl-F(SEQIDN0·19)和TEFlp-ergl-R(SEQIDN0·20)以及 ergl-ADHlt-F(SEQIDN0·23)和ergl-ADHlt-R(SEQIDN0·24)為引物，分別擴(kuò)增TEFlp啟 動(dòng)子和ADHlt終止子。
[0039] 以 W303-la 基因組為模板，以 ergl-F(SEQ ID NO. 21)和 ergl-R(SEQ ID NO. 22) 為引物擴(kuò)增ergl基因片段。將TEFlp啟動(dòng)子、ergl基因片段和ADHlt終止子用融合PCR的 方法融合成ergl的表達(dá)模塊TEFlp-ergl-ADHlt，所用序列見序列表。
[0040] 以釀酒酵母W303-la基因組為模板，以TDH3p-tHMGl-F(SEQ ID NO. 25)和 TDH3-tHMGl-R(SEQ ID N0.26)以及 tHMGl-ADH3t-F(SEQ ID N0.29)*tHMGl-ADH3t-R(SEQ ID NO. 30)為引物，分別擴(kuò)增TDH3p啟動(dòng)子和ADH3t終止子。
[0041] 以 W303-la基因組為模板，以 tHMGl-F(SEQ ID NO. 27)和 tHMGl-R(SEQ ID NO. 28) 為引物擴(kuò)增tHMGl基因片段。將TDH3p啟動(dòng)子、tHMGl基因片段和ADH3t終止子用融合PCR 的方法融合成tHMGl的表達(dá)模塊TDH3p-tHMGl-ADH3t，所用序列見序列表。
[0042] 另外，以 prs405 為模板，以 leu-F(SEQ ID NO. 33)和 leu-R(SEQ ID NO. 34)為 引物擴(kuò)增leu2標(biāo)記基因，以釀酒酵母W303-la基因組為模板，以S1-F(SEQ ID NO. 39) 和δ 1-R(SEQ ID NO. 40)為引物，擴(kuò)增δ位點(diǎn)部分片段，并采用融合PCR的方法構(gòu)建 leu2- δ 1 轉(zhuǎn)化元件；以 ρχρ320 為模板，以 his-F(SEQ ID NO. 31)和 his-R(SEQ ID NO. 32) 為引物擴(kuò)增his3標(biāo)記基因，以釀酒酵母W303-la基因組為模板，以rDNAl-F(SEQ ID NO. 35)和rDNAl-R(SEQ ID NO. 36)為引物擴(kuò)增rDNA部分片段，并采用融合PCR的方法 構(gòu)建his3-rDNAl轉(zhuǎn)化元件。模塊的自組裝轉(zhuǎn)化還需要以釀酒酵母基因組為模板，分別以 rDNA2-F(SEQIDN0.37)、rDNA2-R(SEQIDN0.38)*S2-F(SEQIDN0.41)、S2-R(SEQID NO. 42)為引物擴(kuò)增rDNA2和δ 2片段。模塊構(gòu)建完成后PCR擴(kuò)增各模塊，并用膠回收的方 法純化各轉(zhuǎn)化模塊。
[0043] 本發(fā)明所用PCR酶為北京全式金生物技術(shù)有限公司的pfu聚合酶，50 μ L的PCR 擴(kuò)增體系如下：DNA模板，IyL;前引（10 μ Μ)和后引（10 μ Μ)各lyL;dNTP (2. 5mM)，5 yL; 10XBuffer，10 μ L ;Pfu聚合酶，1 μ L ;最后用雙蒸水補(bǔ)齊50 μ L。在PCR儀上設(shè)置擴(kuò)增程 序。擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘（1個(gè)循環(huán)）；98°C變性10秒、退火10秒、72°C延伸1分 鐘（32個(gè)循環(huán)）；72°C延伸8分鐘（1個(gè)循環(huán)）。
[0044] 本發(fā)明所用融合PCR體系如下：DNA片段總量800ng，摩爾比1:1 ;dNTP(2. 5mM)， 5yL ;10XBuffer，10yL ;Pfu聚合酶，I yL ;最后用雙蒸水補(bǔ)齊50yL。在PCR儀上設(shè)置擴(kuò) 增程序。擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性2分鐘（1個(gè)循環(huán)）；95°C變性10秒、退火55°C 30秒、72°C 延伸1分鐘（11個(gè)循環(huán)），72°C延伸5分鐘（1個(gè)循環(huán)）。
[0045] 二、釀酒酵母轉(zhuǎn)化
[0046] 上述模塊的轉(zhuǎn)化分兩組進(jìn)行。出發(fā)釀酒酵母W303_la在YH)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小 時(shí)后取200 μ L加入2mL新鮮的YH)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4-5小時(shí)。3000轉(zhuǎn)常溫下離心5min收 集菌體，棄去上清后用滅菌的CldH 2O沖洗菌體，在3000轉(zhuǎn)常溫下離心5min收集菌體，棄去上 清。然后將ImL IOOmM的醋酸鋰加入菌體中，室溫下放置5min后在3000轉(zhuǎn)常溫下離心5min 收集菌體，制備釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化混合體系包括240 μ L PEG (50 % W/V)，36 μ L I. OM 醋酸鋰，10 μ L ss-DNA，轉(zhuǎn)化片段 PGKlp-DS-CYClt，TEFlp-ergl-ADHlt，his3-rDNAl 和 rDNA2片段各200ng，最后用ddH20補(bǔ)齊至360 μ L。按上述順序?qū)⒏黜?xiàng)依次加入剛制備的感 受態(tài)細(xì)胞中，離心漩渦lmin，在42°C水浴30min，4000轉(zhuǎn)常溫下離心2min，移去上清后加入 ImLYH)培養(yǎng)基，30°C 150rpm培養(yǎng)2h。4000轉(zhuǎn)常溫下離心5min，棄去上清，無菌水洗滌2次， 并用100 μ L無菌水重懸細(xì)胞，涂缺失組氨酸的平板進(jìn)行篩選。篩選培養(yǎng)條件為30°C，培養(yǎng) 48h以上。得到轉(zhuǎn)化DS和過表達(dá)ergl的釀酒酵母菌W1。
[0047] 以Wl為出發(fā)菌株，過表達(dá)DS和tHMGl。以PGKlp-DS-CYClt為模板，以 leu-PGKp-F(SEQ ID NO. 71)和 DS-CYClt-R(SEQ ID NO. 18)為引物，擴(kuò)增 PGKlp-DS-CYClt 表達(dá)盒。釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備方法同上所述，轉(zhuǎn)化片段PGKlp-DS-CYClt， TDH3p-tHMGl-ADH3t，leu2- δ 1，和δ 2各200ng，轉(zhuǎn)化方法和篩選方法如上所述。然后進(jìn)行 菌落PCR驗(yàn)證后，得到過表達(dá)DS和tHMGl的釀酒酵母菌株W2。
[0048] 實(shí)施例2、合成原人參二醇釀酒酵母細(xì)胞W3和W3plus的構(gòu)建
[0049] 根據(jù)原人參二醇合酶和擬南芥中細(xì)胞色素-NADPH-還原酶1的氨基酸序列，進(jìn)行 針對(duì)釀酒酵母的密碼子優(yōu)化，然后通過化學(xué)合成的方法（金唯智生物科技有限公司合成） 得到編碼人參中原人參二醇合成酶的基因 PPDS基因?yàn)樾蛄斜碇蠸EQ ID NO. 3和擬南芥中 AtCPRl基因?yàn)樾蛄斜碇械幕蛐蛄蠸EQ ID N0.1。TDH3p，PGKlp和終止子CYClt，ADH3t均 來自釀酒酵母w303_la基因組；篩選標(biāo)記基因 ura3來自質(zhì)粒pxp218 (Addgene, Inc. WWW· addgene. org) 〇
[0050] 以釀酒酵母 W303-la 基因組為模板，以 TDH3p-AtCPRl-F(SEQ ID NO. 43) 和 TDH3p-AtCPRl-R(SEQ ID N0.44)以及 AtCPRl-ADH3T-F(SEQ ID N0.47)和 AtCPRl-ADH3T-R(SEQ ID NO. 48)為引物，分別擴(kuò)增TDH3p啟動(dòng)子和ADH3t終止子。以 AtCPRl(SEQ ID NO. 1)為模板，以 AtCPRl-F (SEQ ID NO. 45)和 AtCPRl-R (SEQ ID NO. 46)為 引物擴(kuò)增AtCPRl基因片段。將TDH3p啟動(dòng)子、AtCPRl基因片段和ADH3t終止子用融合PCR 的方法融合成AtCPRl的表達(dá)模塊TDH3p-AtCPRl-ADH3t，PCR和融合PCR的方法同實(shí)施例1.
[0051] 以釀酒酵母W303-la基因組為模板，以PGKlp-PPDS-F(SEQ ID NO. 49)和 PGKlp-PPDS-R(SEQ ID NO. 50)以及 PPDS-CYClt-F (SEQ ID NO. 53)和 PPDS-CYClt-R(SEQ ID NO. 54)為引物，分別擴(kuò)增PGKlp啟動(dòng)子和CYClt終止子。以PPDS(SEQ ID NO. 3)為模 板，以 PPDS-F(SEQ ID NO. 51)和 PPDS-R(SEQ ID NO. 52)為引物擴(kuò)增 PPDS 基因片段。將 PGKlp啟動(dòng)子、PPDS基因片段和CYClt終止子用融合PCR的方法融合成PPDS的表達(dá)模塊 PGKlp-ProS-CYClt，PCR和融合PCR的方法同實(shí)施例1.
[0052] 另外，以 pxp218 為模板，以 ura-F(SEQ ID NO. 55)和 ura-R(SEQ ID NO. 56)為 引物擴(kuò)增ura3標(biāo)記基因，以釀酒酵母W303-la基因組為模板，以S1-F2(SEQ ID NO. 57) 和δ 1-R2(SEQ ID NO. 58)為引物擴(kuò)增δ位點(diǎn)部分片段，并采用融合PCR的方法構(gòu)建 ura3-Sl 轉(zhuǎn)化元件；以 W303-la 基因組為模板，以 S2-F(SEQ ID NO. 59)和 S2-R(SEQ ID NO. 60)為引物，擴(kuò)增轉(zhuǎn)化元件δ2。采用實(shí)施例1的轉(zhuǎn)化方法，將PGKlp-ProS-CYClt， TDH3p-AtCPRl-ADH3t，ura3- δ 1和δ 2轉(zhuǎn)化片段以釀酒酵母自組裝的方式整合到釀酒酵母 基因組上δ位點(diǎn)上，得到轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，得到合成原人參二醇的釀酒酵母菌 株W3〇
[0053] 在W3的基礎(chǔ)上，增加 PPDS和AtCPRl表達(dá)模塊的拷貝，主要方法如下。以釀酒 酵母 BY4742(美國 ATCC)基因組為模板，以 Ade2-F(SEQ ID NO. 63)和 Ade2-R(SEQ ID NO. 64)為引物擴(kuò)增ade2標(biāo)記基因表達(dá)元件，以prs405質(zhì)粒為模板，以leul-F2(SEQ ID NO. 65)和leul-R2(SEQ ID NO. 66)為引物擴(kuò)增leu2位點(diǎn)部分片段，并采用融合PCR的 方法構(gòu)建ade2-leul轉(zhuǎn)化元件；以prs405質(zhì)粒為模板，以Ieu2-F (SEQ ID NO. 67)和 Ieu2-R(SEQ ID NO. 68)為引物，擴(kuò)增轉(zhuǎn)化元件leu2。同時(shí)，以PGKlp-PPDS-CYClt為模 板，以PGK1P-PDDS-F2(SEQ ID N0.61)和PDDS-CYClt-R(SEQ ID N0.54)為引物擴(kuò)增 PGKlp-PPDS-CYClt 模塊；以 TDH3p-AtCPRl-F(SEQ ID NO. 43)和 TDH3p-AtCPRl-R2(SEQ ID NO. 62)為引物擴(kuò)增TEFlp-AtCPRl-ADH3t模塊。采用實(shí)施例1的轉(zhuǎn)化方法，將 PGKlp-PPDS-CYClt，TDH3p-AtCPRl-ADH3t，ade2-leul 和 leu2 轉(zhuǎn)化片段各 200ng 以酵母自 組裝的方式整合到釀酒酵母基因組leu2位點(diǎn)，菌落PCR驗(yàn)證后，得到增加 PPDS和AtCPRl 模塊拷貝的菌株W3 plus。
[0054] 實(shí)施例3、一種能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建
[0055] 根據(jù)原人參二醇合酶基因 PPDS和擬南芥中細(xì)胞色素-NADPH-還原酶1基因 AtCPRl的氨基酸序列，進(jìn)行針對(duì)釀酒酵母的密碼子優(yōu)化，然后通過化學(xué)合成的方法（金唯 智生物科技有限公司合成）得到基因片段。人參中PPDS基因以SEQ ID NO. 3所示，擬南芥 中AtCPRl基因以SEQ ID NO. 1所示；將擬南芥中AtCPRl基因5'端的前138個(gè)堿基切除， 得到SEQ ID NO. 2所示序列。內(nèi)源啟動(dòng)子PGKlp(SEQ ID NO. 7)和內(nèi)源終止子ADH3t(SEQ ID NO. 12)均來自釀酒酵母w303-la基因組；篩選標(biāo)記基因 ura3來自質(zhì)粒pxp218。
[0056] 兩個(gè)蛋白質(zhì)中用編碼多肽GGG的堿基序列連接，本實(shí)施例中編碼linker3的堿 基序列為5' -GGTGGTGGT-3'，將該堿基序列設(shè)計(jì)到引物中并采用融合PCR的方法實(shí)現(xiàn) 兩個(gè)基因片段的連接，具體實(shí)施過程為：以原人參二醇合酶基因 PPDS(SEQ ID N0.3)為 模板，以序列表中 PPDS-F(SEQ ID NO. 51)和 PPDS-linker3-R(SEQ ID NO. 69)為引物， 擴(kuò)增PPDS-linker3片段，該片段去除了人參中原人參二醇合酶基因 PPDS的3'端終止 密碼子TAA，同時(shí)還含有編碼多肽GGG的堿基序列5' -GGTGGTGGT-3' ；以擬南芥中細(xì)胞 色素-NADPH-還原酶1基因 AtCPR15 '端的前138個(gè)堿基切除序列（SEQ ID NO. 2)為 模板，以linker3-AtCPRl-F(SEQIDN0·70)和AtCPRl-R(SEQIDN0·46)為引物，擴(kuò)增 linker3-AtCPRl片段，該片段包含編碼多肽GGG的堿基序列5'-GGTGGTGGT-3'和去除5'端 138bp 的 AtCPRl 基因序列（SEQ ID N0.2)。將PPDS-linker3 和 linker3-AtCPRl 基因片段用 融合PCR的方法連接成PPDS-I inker3-AtCPRl的基因元件，該元件為PPDS-I inker3-AtCPRl 融合蛋白質(zhì)的基因元件。PCR和融合PCR的方法同實(shí)施例1。
[0057] 將PPDS-linker3_AtCPRl融合蛋白質(zhì)的基因元件與釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)源啟動(dòng)子 和終止子連接，構(gòu)建PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白質(zhì)基因表達(dá)盒，具體實(shí)施過程為：以 PGKlp-PPDS-F(SEQIDN0·49)和PGKlp-PPDS-R(SEQIDN0·50)為引物，以W303-la基因組 為模板，擴(kuò)增PGKlp啟動(dòng)子；以AtCPRl-ADH3t-F(SEQ ID NO. 47)和AtCPRl-ADH3t-R(SEQ ID NO. 48)為引物，以W303-la基因組為模板，擴(kuò)增ADH3t終止子。將PPDS-linker3-AtCPRl融 合酶的基因元件PPDS-linker3-AtCPRl與釀酒酵母細(xì)胞啟動(dòng)子PGKlp和終止子ADH3t用融 合 PCR 連接，構(gòu)建 PPDS-linker3-AtCPRl 融合酶基因表達(dá)盒 PGKlp-PPDS-linker3-AtCPRl-ADH3t (圖 1)。
[0058] 以 pxp218 為模板，以 ura-F(SEQ ID NO. 55)和 ura-R(SEQ ID NO. 56)為引物擴(kuò)增 ura3標(biāo)記基因，以酵母W303_la基因組為模板，以δ 1-F2(SEQ ID NO. 57)和δ 1-R2(SEQ ID NO. 58)為引物擴(kuò)增δ位點(diǎn)部分片段，并采用融合PCR的方法構(gòu)建ura3- δ 1轉(zhuǎn)化元件； 以W303-la基因組為模板，以S2-F(SEQ ID NO. 59)和S2-R(SEQ ID NO. 60)為引物，擴(kuò)增 轉(zhuǎn)化元件6 2。采用實(shí)施例1的轉(zhuǎn)化方法，將PGKlp-PPDS-linker3-AtCPRl-ADH3t表達(dá)盒， ura3-δ 1和δ 2轉(zhuǎn)化片段各200ng以釀酒酵母自組裝的方式轉(zhuǎn)化進(jìn)入實(shí)施例2得到的釀酒 酵母細(xì)胞W2的基因組δ位點(diǎn)上，得到轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證后，得到合成原人參二醇 的釀酒酵母菌株W3c。
[0059] 實(shí)施例4、融合Ρ450酶的催化能力測(cè)定
[0060] 一、釀酒酵母微粒體的制備
[0061] 實(shí)施例1，2, 3中得到的釀酒酵母細(xì)胞W2，W3和W3c分別在YH)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng) (30°C，220rmp)。培養(yǎng)24h后離心（3000rmp，5min)收集細(xì)胞。釀酒酵母細(xì)胞用TEK緩沖液 (IOOmM KCl，50mM Tris-HCl，lmM EDTA)重懸，6100g離心3min〇去除上清，加入與菌體量等 量的玻璃珠，并加入提取緩沖液（20mM β -巰基乙醇，1 % BSA，0. 6M山梨醇，50mM Tris-HCl， ImM EDTA)。劇烈震蕩20min后，6100g離心15min，將上清過膜后轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中， 加入MgCl2(50mM)后在冰上放置Ih沉淀微粒體。然后12500g離心20min。上清去除后，離 心管底部的微粒體轉(zhuǎn)移至TEG緩沖液中（30 %甘油，50mM Tris-HCl，ImMEDTA)，并用研磨杵 快速研磨進(jìn)行均一化處理。
[0062] 二、CO示差法測(cè)定P450酶
[0063] 取4mL釀酒酵母細(xì)胞微粒體制備液，加入80 μ L 0. 5mmol/L連二亞硫酸鈉混勾， 于冰浴中放置2min。將4mL上述制備液體分轉(zhuǎn)入兩個(gè)比色皿中，其中一份用CO氣體鼓泡 lmin，另一份不鼓泡，分別測(cè)定兩份懸液的紫外吸收光譜。所用儀器為TU-1810型紫外可見 分光光度計(jì)（比色皿光程Icm)，掃描波長(zhǎng)范圍400-500nm。以通CO鼓泡的懸液為樣品液，未 通CO的懸液為參比液，繪制示差紫外吸收光譜圖。記錄450nm和490nm波長(zhǎng)處的吸收值， 按以下公式計(jì)算P450含量（摩爾消光系數(shù)ε為91011^0^450 (mM) = (A45tol-A49cinm)/91。
[0064] 三、P450酶的酶活力的測(cè)定
[0065] 在500 μ L IOOmM磷酸二氫鉀緩沖液（pH 7. 4)加入IOmg微粒體。達(dá)瑪烯二醇濃 度500 μ M，在30°C水浴中溫育，加入NADPH(ImM)開始反應(yīng)，每隔5min取一定量的混合液， 加入等體積的正己燒萃取，12000rmp離心2min后過0. 22有機(jī)膜備用，最后用HPLC測(cè)定原 人參二醇的含量。液相色譜條件：進(jìn)樣量20 μ L，安捷倫ZORBAX SB-Aq ;流動(dòng)相為甲醇：乙 腈=4:6,流速：lmL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)203nm〇
[0066] 結(jié)果：PPDS酶的含量用W3,和W3c微粒體中P450酶的含量減去W2中P450酶的 含量所得。經(jīng)計(jì)算，W3中PPDS的含量為9. 82±0. 83 μM/g微粒體，W3c中PPDS的含量為 9. 30±0. 67 μ M/g微粒體。由此可知，釀酒酵母微粒體中的PPDS濃度差別較小，它們的酶活 測(cè)定結(jié)果如圖4所示。圖4中，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白質(zhì)的催化 效率明顯高于自然條件下PPDS和AtCPRl的催化效率。
[0067] 實(shí)施例5、工程菌株的發(fā)酵與發(fā)酵產(chǎn)物的LC-MS檢測(cè)。
[0068] 將實(shí)施例2, 3中得到的人工合成釀酒酵母細(xì)胞W3，W3plus和W3c分別在YH)培養(yǎng) 基中進(jìn)行培養(yǎng)（30°C，220rmp)。6天后離心收集細(xì)胞，加入丙酮，在冰水浴中進(jìn)行超聲波破 碎lOmin，然后在12000轉(zhuǎn)/min常溫條件下離心2min，取上清過0. 22mm有機(jī)膜后備用。
[0069] 達(dá)瑪烯二醇和原人參二醇的定性用LC-MS進(jìn)行。液相色譜條件：進(jìn)樣量5 μ L，安捷 倫ZORBAX SB-Aq ;流動(dòng)相為90%乙腈，流速：0. 2mL/min。質(zhì)譜條件：霧化氣和干燥氣都為 N2;碰撞電壓：-70V ;噴霧電壓：3. 8kV ;離子源：APCI ;離子源溫度：120°C ;脫溶溫度：300°C ; 柱后流出物導(dǎo)入離子源速率jyL/min ;質(zhì)譜掃描質(zhì)量數(shù)范圍：200-1000Da。
[0070] 達(dá)瑪烯二醇和原人參二醇的定量用HPLC進(jìn)行，液相色譜條件：進(jìn)樣量20 μ L，安 捷倫ZORBAX SB-Aq;流動(dòng)相為甲醇：乙腈=4:6,流速：lmL/min。達(dá)瑪稀二醇購自云南西 力生物技術(shù)有限公司（WWW. biobiopha.com)。原人參二醇購自北京索萊寶科技有限公司 (http://www. solarbio. cn/) 〇
[0071] 結(jié)果如附圖5所示：W3達(dá)瑪烯二醇和原人參二醇的產(chǎn)量分別為96. 8mg/L和 155. 6mg/L ;W3plus增加了 PPDS和AtCPRl表達(dá)模塊的拷貝數(shù)，達(dá)瑪烯二醇和原人參二醇的 產(chǎn)量分別為102. 5mg/L和150. 6mg/L ;W3c達(dá)瑪烯二醇和原人參二醇的產(chǎn)量分別為16. 3mg/ L 和 263. 2mg/L。
[0072] 實(shí)驗(yàn)證明，在釀酒酵母W303_la宿主中，單純的增加 PPDS和AtCPRl表達(dá)模塊的拷 貝數(shù)并不能提高達(dá)瑪烯二醇的轉(zhuǎn)化率。所構(gòu)建的PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白質(zhì)能有效 提高達(dá)瑪烯二醇的轉(zhuǎn)化效率，從而提高原人參二醇的產(chǎn)量。
【權(quán)利要求】
1. 一種能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步 驟： ① 將擬南芥中細(xì)胞色素-NADPH-還原酶1基因 AtCPRl的5'端的前138個(gè)堿基切除， 得到SEQ ID NO. 2所示序列，所述擬南芥中AtCPRl基因以SEQ ID NO. 1所示； ② 將以SEQ ID N0.3所示的人參中原人參二醇合酶基因 PPDS的3'端終止密碼 子TAA去除，與SEQ ID NO. 2所示序列的5'端用編碼多肽GGG的堿基序列連接，構(gòu)建出 PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白質(zhì)的基因元件； ③ 將PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白質(zhì)的基因元件與釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)源啟動(dòng)子和終 止子連接，構(gòu)建PPDS-linker3-AtCPRl融合蛋白質(zhì)基因表達(dá)盒，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母細(xì)胞 表達(dá)。
2. 權(quán)利要求1的方法構(gòu)建的能提高達(dá)瑪烯二醇轉(zhuǎn)化效率的融合蛋白質(zhì)。
3. 權(quán)利要求2的融合蛋白質(zhì)在釀酒酵母中合成人參皂苷中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104498577SQ201410736992
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】盧文玉, 趙方龍 申請(qǐng)人:天津大學(xué)